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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous décrivons deux méthodes pour évaluer la perméabilité vasculaire transitoire liée au microenvironnement de tumeur de la fonction de porte de métastasie (TMEM) et de l'intravasation de cellules cancéreuses utilisant l'injection intraveineuse du poids moléculaire élevé (155 kDa) dextran chez les souris. Les méthodes incluent l'imagerie intravitale chez les animaux vivants et l'analyse des tissus fixes à l'aide de l'immunofluorescence.

Résumé

La cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer est la métastasie, un processus qui nécessite la dissémination des cellules cancéreuses de la tumeur primaire aux sites secondaires. Récemment, nous avons établi que la dissémination de cellules cancéreuses dans le cancer du sein primaire et aux emplacements métastatiques dans le poumon se produit seulement aux portes appelées microenvironnement de tumeur de la métastase (TMEM). Le nombre de porte de TMEM est pronostique pour la répétition éloignée de la maladie métastatique dans les patients de cancer du sein. Les portes tMEM sont composées d'une cellule cancéreuse qui sur-exprime la protéine régulatrice d'actine Mena en contact direct avec un macrophage périvasculaire et proangiogénique qui exprime des niveaux élevés de TIE2 et de VEGF, où ces deux cellules sont étroitement liées à un sang cellule endothéliale du navire. Les cellules cancéreuses peuvent intravasate par les portes TMEM en raison de la perméabilité vasculaire transitoire orchestrée par l'activité conjointe du macrophage TMEM-associé et de la cellule cancéreuse Mena-exprimant TMEM-associée. Dans ce manuscrit, nous décrivons deux méthodes pour l'évaluation de la perméabilité vasculaire transitoire TMEM-négociée : la formation image intravitale et l'immunofluorescence fixe de tissu. Bien que les deux méthodes aient leurs avantages et inconvénients, la combinaison des deux peut fournir les analyses les plus complètes de la perméabilité vasculaire TMEM-négociée ainsi que des prérequis microenvironnementaux pour la fonction TMEM. Étant donné que le processus métastatique dans le cancer du sein, et peut-être d'autres types de cancer, implique la dissémination des cellules cancéreuses par les portes TMEM, il est essentiel d'employer des méthodes bien établies pour l'analyse de l'activité de porte TMEM. Les deux méthodes décrites ici fournissent une approche globale de l'analyse de l'activité de porte TMEM, soit chez les animaux naïfs ou pharmacologiquement traités, ce qui est d'une importance primordiale pour les essais précliniques d'agents qui préviennent les cellules cancéreuses diffusion par TMEM.

Introduction

Les progrès récents dans notre compréhension de la métastes du cancer ont mis au jour que la transition épithéliale-mésenchymale (EMT) et l'induction d'une sous-population de cellules cancéreuses migratrices/invasives ne sont pas, en elles-mêmes, suffisantes pour la dissémination hématogène 1. En effet, on pensait auparavant que la métastisation des cellules cancéreuses intravasate à travers l'ensemble de l'endothélium associé au cancer que la tumeur neovasculature est souvent caractérisée par une faible couverture péritéyte, et en tant que tel, est très perméable et instable2,3,4. Bien que fortement suggestif des fonctions défectueuses dans la tumeur, les modifications vasculaires pendant la carcinogenèse ne fournissent pas l'évidence en soi que les cellules de tumeur peuvent pénétrer des vaisseaux sanguins facilement et d'une manière incontrôlée. Les connaissances issues d'études d'imagerie intravitale (IVI), dans lesquelles les cellules tumorales sont étiquetées de façon fluorescente et où la vascularisation est étiquetée par l'injection intraveineuse de sondes fluorescentes (comme le dextran ou les points quantiques), montrent que, bien que les vaisseaux tumoraux soient uniformément perméable à faible poids moléculaire dextrans (par exemple 70 kD), dextrans de poids moléculaire élevé (155 kD) et les cellules tumorales ne peuvent traverser l'endothélium que dans des sites spécialisés d'intravasation qui sont préférentiellement situés au point de branche vasculaire5, 6 Annonces , 7. Les analyses immunohistochimiques (IHC) à l'aide de modèles animaux et de matériel dérivé du patient humain ont montré que ces sites sont des « portes » qui se spécialisent dans la régulation de la perméabilité vasculaire, localement et transitoirement, offrant une brève fenêtre de l'occasion pour les cellules cancéreuses migratrices/invasives d'entrer dans la circulation. Ces portes sont appelées « microenvironnement de tumeur de métastase » ou « TMEM », et, tout à fait prévu, leur densité corrèle avec un plus grand risque de développer la maladie métastatique dans les patients de cancer du sein8,9, 10.

Chaque porte TMEM se compose de trois types distincts de cellules: un macrophage périvasculaire, une cellule tumorale surexprimant l'actin-régulateur mammifère protéine activée (Mena), et une cellule endothéliale, le tout en contact physique direct les uns avec les autres1, 5,9,10,11,12,13. L'événement clé pour la fonction de TMEM comme porte d'intravasation est la libération localisée du facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) sur le vaisseau sous-jacent par le macrophage périvasculaire14. VEGF peut perturber les jonctions homotypic entre les cellules endothéliales15,16,17,18,19, un phénomène qui se traduit par des fuites vasculaires transitoires, aussi la perméabilité « éclatante » décrite dans les études iVI 5. TMEM macrophages ont été montrés pour exprimer le récepteur de kinase de tyrosine TIE2, qui est exigé pour la fonction de TMEM VEGF-négociée et homing de ces macrophages à la niche périvasculaire5,20,21 , 22. En plus de réguler la dissémination des cellules cancéreuses et la métastase, TIE2- macrophages se sont avérés être les régulateurs centraux de l'angiogenèse tumorale21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31. En tant que tel, les macrophages TIE2 représentent un constituant critique du microenvironnement tumoral et le régulateur principal de la cascade métastatique.

Pour mieux conceptualiser la perméabilité vasculaire médiée par TMEM (c.-à-d. « éclatement »), il est très important de la distinguer des autres modes de perméabilité vasculaire qui ne sont pas associés à la dissolution des jonctions cellules-cellules endothéliales. Dans un endothélium intact (dont les jonctions serrées et adhérentes ne sont pas perturbées), il existe trois principaux types de perméabilité vasculaire : a) la pinocytose, qui peut, ou non, être couplée à la transcytose du matériau ingéré; b) le transport du matériel par fenestrae endothélial; et c) le transport du matériel par la voie paracellulaire, qui est réglée par les jonctions serrées endothéliales15,16,17,18,19,32 , 33 Ans, états-unis ( , 34. Bien que déréglementés dans beaucoup de tumeurs, les modes mentionnés ci-dessus de perméabilité vasculaire ont été décrits principalement dans le contexte de la physiologie normale de tissu et de l'homéostasie, les extrêmes dont sont des tissus avec la perméabilité limitée ( par exemple, barrière hémato-encéphalique, barrière de test sanguin), ou perméabilité abondante (p. ex., capillaires fenestrés de l'appareil glomerulaire rénal)34,35,36,37.

À l'aide de la formation image intravitale multiphoton et de la microscopie multixée d'immunofluorescence, nous sommes en mesure de distinguer entre la perméabilité vasculaire Médiée TMEM (« éclatement ») et d'autres modes de perméabilité vasculaire dans les tumeurs mammaires. Pour ce faire, nous effectuons une seule injection intraveineuse d'une sonde de poids moléculaire de haut poids, étiquetée fluorescente chez la souris. Les événements spontanés d'éclatement peuvent alors être capturés utilisant l'imagerie intravitale chez les souris vivantes ; ou alternativement, l'extravasation de la sonde peut être quantifiée par des études de co-localisation avec la vascularisation de sang (par exemple CD31ou Endomucin)et les portes de TMEM utilisant la microscopie d'immunofluorescence. Les protocoles présentés ici décrivent ces deux techniques, qui pourraient être utilisées indépendamment ou en conjonction les unes avec les autres.

Protocole

Toutes les expériences à l'aide d'animaux vivants doivent être menées conformément aux lignes directrices et règlements sur l'utilisation et les soins des animaux. Les procédures décrites dans cette étude ont été réalisées conformément aux règlements des National Institutes of Health concernant les soins et l'utilisation des animaux expérimentaux et avec l'approbation de l'Albert Einstein College of Medicine Animal Care and Use (IACUC).

1. Évaluation de la « perméabilité éclatante » à l'aide de l'imagerie animale vivante

  1. Transplantation de tumeurs syngénéiques de sein dans des hôtes de souris avec des macrophages fluorescents
    1. Générer des morceaux de tissu tumoral adaptés à la transplantation.
      1. Générer des tumeurs fluorescentes étiquetées dans les modèles de cancer mammaire de souris en croisant le spontané, autochthonous, génétiquement modifié souris modèle de cancer mammaire MMTV-PyMT souris avec des souris transgéniques exprimant des journalistes fluorescents38, 39 [p. ex., protéine fluorescente verte améliorée (EGFP), protéine fluorescente cyan améliorée (ECFP), ou Dendra2].
      2. Permettre aux souris MMTV-PyMT avec des tumeurs fluorescentes de croître à une taille d'au plus 2 cm (environ 10-12 semaines d'âge).
      3. Euthanasier la tumeur portant des souris MMTV-PyMT en les plaçant dans une chambre avec 5% d'isoflurane jusqu'à 30 secondes après que toutes les respirations s'arrêtent.
      4. Effectuer une luxation cervicale.
      5. Enlever les poils de l'abdomen de la souris euthanasiée à l'aide d'une crème dépilatoire topique.
      6. Placer un plat Petri avec le milieu de culture cellulaire DMEM/F12 sur la glace.
      7. Placer la souris et le plat Petri sur la glace dans le capot de fumée.
      8. Assainiz l'abdomen de la souris avec 70% d'alcool éthylique.
      9. À l'aide de gants stériles et d'outils chirurgicaux (ciseaux stérilisés, forceps et lame) enlever les tumeurs et les placer dans le plat Petri.
      10. Couper la tumeur en petits morceaux (2 mm x 2 mm x 2 mm de taille), en jetant toutes les portions nécrotiques, alors qu'elles sont dans le plat Petri.
    2. Transplanter les morceaux de tumeur dans les hôtes receveurs.
      1. Élever des souris avec des macrophages génétiquement modifiés à étiquette fluorescente, par exemple, macGreen40 ou MacBlue 41 souris (Csf1r -GAL4VP16/UAS-ECFP)
      2. Permettre aux souris FVB avec des macrophages étiquetés fluorescents de croître jusqu'à un âge de 4 à 6 semaines).
      3. Anesthésiez les souris FVB avec des macrophages étiquetés fluorescents dans une chambre à l'aide de 5% d'isoflurane avec de l'oxygène comme gaz porteur.
      4. Réduire l'anesthésie à 3% d'isoflurane et appliquer un onduleur ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter le séchage.
      5. Enlever les poils de la glande mammaire 4e de la souris.
      6. Nettoyer la peau avec de la bétadine. Il est important de maintenir des conditions stériles tout au long du reste de la procédure. Cela comprend l'utilisation d'instruments stérilisés et de réactifs.
      7. Faire une petite incision de 2-3 mm juste inférieure à la mamelon 4 e.
      8. Disséquer jusqu'à ce que le coussinet de graisse mammaire soit exposé.
      9. Prenez un morceau de tumeur du plat De Petri et enrobez dans la matrice extracellulaire artificielle.
      10. Transplanter des tumeurs sous le coussinet de graisse mammaire 4 e.
      11. Fermer l'incision à l'aide d'adhésif cyanoacrylate.
      12. Surveiller continuellement l'animal jusqu'à ce qu'il se rétablisse complètement de l'anesthésie et est capable de maintenir la charge sévère. Aussi, ne pas retourner l'animal à la compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que le rétablissement complet.
      13. Pour minimiser les infections, ajouter 1 ml de 100 mg/mL d'antibiotique enrofloxacine à la bouteille d'eau potable de l'animal (8 fl oz).
      14. Laisser les tumeurs se développer jusqu'à ce qu'elles soient palpables (5 mm; 4 semaines).
      15. Selon l'expérience, répartir les souris en groupes de traitement et effectuer les traitements correspondants, le cas échéant.
  2. Configuration pour l'imagerie intravitale
    1. Allumez le laser à deux photons et les détecteurs du microscope.
    2. Allumez la boîte chauffante et préchauffez le stade x-y du microscope.
    3. Placez l'insert de scène sur mesure42 dans la scène x-y.
  3. Préparation de la fenêtre d'imagerie
    1. Avant de mettre en place pour l'imagerie, autoclave le cadre de fenêtre d'imagerie circulaire sur mesure42.
    2. Utilisez une pipette ou une seringue à insuline pour placer une fine couche d'adhésif cyanoacrylate sur le cadre de la fenêtre et apposez en place un verre circulaire de couverture de 8 mm.
      REMARQUE : 1) Il est important d'éviter d'obtenir des résidus sur l'ouverture claire du verre de couverture. 2) Il est important d'adhérer le verre de couverture au cadre de fenêtre au moins 1 h avant utilisation pour l'imagerie.
    3. Essuyez soigneusement nettoyer tout excès de cyanoacrylate sur l'ouverture claire du verre de couverture à l'aide d'une lingette de laboratoire mouillée avec une petite quantité d'acétone.
  4. Préparation du cathéter de veine de queue pour l'administration des fluides et des colorants fluorescents pendant l'imagerie
    1. Couper un morceau de 30 cm de tube de polyéthylène pour construire un cathéter de veine de queue.
    2. Détachez la partie d'aiguille d'une aiguille de 30 G de son luer en pliant doucement l'aiguille d'avant en arrière jusqu'à ce qu'elle se brise.
      REMARQUE : L'aiguille doit être tenue près du cône Luer et non de la pointe de l'aiguille. Ceci peut être exécuté avec des pinces ou des forceps pour saisir l'aiguille afin d'empêcher des dommages de bâton d'aiguille.
    3. Insérer l'extrémité émoussée de l'aiguille dans une extrémité du tube en polyéthylène.
    4. Insérez l'extrémité pointue d'une autre aiguille de 30 G, en gardant son leret luer attaché, à l'extrémité opposée du tube.
    5. Remplissez une seringue de 1 cc de phosphate tamponné saline, attachez-la à l'effiloché Luer du cathéter assemblé et rincez le cathéter de veine de queue en s'assurant qu'il n'y a pas de bulles d'air dans le système.
    6. Pour l'étiquetage vasculaire, remplissez une seringue de 1 cc avec 100 l de 10 mg/kg 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine (TMR) ou points quantiques.
  5. Préparation de la souris pour l'imagerie
    1. Anesthésiez la souris dans une cage en dessous (1 pied en dessous) d'une lampe thermique à l'aide de 4%-5% isoflurane mélangé avec 100% d'oxygène réglé à un flux de 1,5-2 L par min.
    2. Allumez la lampe thermique au-dessus de la zone de travail chirurgicale. Cette étape est essentielle pour maintenir la température corporelle physiologique de base de la souris pendant la chirurgie.
    3. Placez la souris sous la lampe thermique et abaissez l'anesthésie à 2%-3% pendant toute la durée de la chirurgie.
      REMARQUE : Assurez-vous de garder la lampe thermique à une distance sécuritaire (1 pied) de la souris pour éviter la surchauffe.
    4. Placez l'onduleur ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter le séchage des yeux et la cécité.
    5. Testez que la souris est anesthésié e en effectuant un test de pincement d'orteil. Si l'animal se retire, augmenter la dose d'isoflurane de 1% et retester en 1-2 min.
    6. Insérez le cathéter de veine de queue dans le point le plus distal sur la queue possible.
    7. Affix le cathéter de veine de queue à la queue avec un petit morceau de bande de laboratoire qui s'enroule autour de la queue et colle à l'aiguille pour s'assurer qu'il ne se délodge.
    8. Injecter 50 L par h de PBS par le cathéter de veine de queue pour fournir une hydratation adéquate. Il est essentiel d'éviter d'injecter trop de liquide (pas plus de 200 l par h) ou des bulles dans le cathéter car cela peut être fatal à la souris.
    9. Enlever les poils sur l'abdomen sur les glandes mammaires 4e et 5e à l'aide de crème dépilatoire.
    10. Nettoyez la peau avec de la bétadine et laissez la peau sécher.
    11. Faire une incision longitudinale de ligne médiane commençant immédiatement supérieure aux organes génitaux et porter l'incision jusqu'au niveau de l'aspect supérieur de la glande mammaire 4e.
    12. Porter l'incision transversale à l'aspect supérieur de la glande mammaire 4e. Il est essentiel d'éviter de compromettre l'approvisionnement en sang à ce stade.
    13. Disséquer le tampon de graisse mammaire hors du péritoine créant un lambeau de tissu utilisant des forceps et des ciseaux stériles.
      REMARQUE : L'imagerie des ailerons de peau est sensible aux artefacts de mouvement significatifs et à la déshydratation de tissu. Ceux-ci sont évités, comme décrit précédemment43,44, en apposant un morceau rigide de caoutchouc derrière le côté de la peau de l'aileron (pour raidir le tissu mou et l'isoler du reste du corps) et ensuite placer la tumeur dans une imagerie peu profonde fenêtre pour préserver l'hydratation. Ceci est essentiel pour la formation image stable que la tumeur et les tissus environnants dans ce cadre sont très conformes.
    14. Stabiliser le rabat de la peau en apposant (avec de la colle cyanoacrylate) un petit morceau de caoutchouc rigide mesurant 2 cm x 2 cm du côté de la peau du rabat. La tumeur doit être au centre de la zone étant stabilisée par le caoutchouc.
    15. Gardez les tissus exposés hydratés avec des gouttes de PBS.
    16. Appliquer un petit film de cyanoacrylate sur le bord extérieur du cadre de fenêtre d'imagerie sur mesure.
    17. Appliquer une petite gouttelette de PBS (10 à 20 l) au centre du verre de couverture.
    18. Séchez le tissu rabattaire environnant à l'utilisation d'une lingette de laboratoire. Il est essentiel de s'assurer que le cyanoacrylate sur le cadre de la fenêtre n'entre pas en contact avec le PBS sur le verre, car cela peut causer le cyanoacrylate à polymériser et mis prématurément.
    19. Affix la petite fenêtre d'imagerie à l'aileron de tissu avec la tumeur au centre de l'ouverture claire.
    20. Retirez la boîte chauffante de la scène.
    21. Transférer le cathéter de veine de souris et de queue anesthésié au stade du microscope. Faites preuve d'une extrême prudence pour vous assurer que le cathéter de veine de queue ne tombe pas.
    22. Placez la souris sur la scène en position couchée.
    23. Placer le cône nasal de l'isoflurane sur le museau pour assurer le maintien de l'anesthésie.
    24. Insérez la fenêtre dans l'alésage sur la plaque de scène x-y personnalisée.
    25. Remettre la boîte chauffante sur la scène pour maintenir une température physiologique.
    26. Surveillez les signes vitaux de l'animal en attachant une sonde d'oxymètre d'impulsion par l'intermédiaire du capteur de clip à la patte arrière.
    27. Diminution lentement isoflurane à 0,5%-1% pour maintenir un flux sanguin adéquat et éviter sur anesthésier la souris.
  6. Imagerie intravitale
    REMARQUE : L'imagerie que nous décrivons dans cette section a été réalisée sur un microscope multiphoton à deux lasers construit sur mesure qui a été précédemment décrit5,39,45. En bref, un laser femtoseconde est utilisé pour générer 90 femtoseconde lumière laser pulsée centrée à 880 nm. La lumière de fluorescence est détectée avec trois des quatre détecteurs d'acquisition simultanée (Bleu 447/60, Vert 520/65, et Rouge 580/60; longueur d'onde centrale/bande passante) après séparation de la lumière d'excitation par un dichroic (Chroma, Z720DCXXR). Le support de microscope contient une lentille objective de 25x, 1,05 NA (ouverture numérique) longue distance de travail (2 mm). Il est important de noter que, bien que nous ayons utilisé un microscope sur mesure, le protocole décrit ci-dessous peut être accompli sur n'importe quel microscope multiphoton disponible dans le commerce ainsi.
    1. Placez une goutte d'eau distillée entre l'objectif du microscope 25x, 1,05 NA et le verre de couverture de la fenêtre pour établir un contact optique.
    2. Utilisez l'oculaire du microscope pour se concentrer sur les zones avec des cellules tumorales fluorescentes près de la surface de la fenêtre.
    3. Trouvez les vaisseaux sanguins qui coulent et les macrophages étiquetés. Il est essentiel d'avoir des vaisseaux sanguins qui coulent pour évaluer la dynamique de la vascularisation.
    4. Passez le microscope en mode multiphoton.
    5. Fixez les limites supérieures et inférieures d'une série z, qui mesure environ 50 m.
      1. Définir la limite supérieure de la série Z en utilisant l'ajusteur de mise au point pour déplacer l'objectif à l'emplacement de départ souhaité, à la position la plus superficielle, et le marquage de cette position comme zéro dans le logiciel en cliquant sur le bouton Haut de position Z.
      2. Définir la limite inférieure de la série Z en déplaçant l'objectif à la couche la plus profonde (généralement 50-70 m à partir du haut pour les tumeurs plus petites) et en cliquant sur le bouton de fond de position Z.
      3. Définir la taille du z-step à 5 m.
    6. Cliquez sur le bouton time-Lapse et fixez l'intervalle de temps entre les acquisitions à au moins 10 s pour fournir suffisamment de temps pour reconstituer l'eau au-dessus de l'objectif objectif. Cela se fait manuellement avec une pipette de compression sur l'objectif pendant le long laps de temps.
    7. Retirez la seringue avec du PBS dans le cathéter de veine de la queue et remplacez-la par une autre seringue contenant le 155 kDa dextran-TMR (rhodamine tétraméthyle).
    8. Injecter 100 là de 155 kDa dextran-TMR par l'intermédiaire du cathéter de veine de queue.
    9. Après l'injection, remplacez la seringue TMR par la seringue PBS.
    10. Acquérir une imagerie en time-lapse z-pile en cliquant sur les boutons Z-Stack et Time-Lapse, puis en cliquant sur le bouton enregistrement.
    11. Injecter 50 L de PBS toutes les 30-45 min pour maintenir une hydratation adéquate de l'animal. Évitez d'injecter plus de 200 L à la fois car cela peut causer une surcharge de liquide.
  7. euthanasie
    1. Augmenter l'isoflurane à 5% et garder l'animal sous 5% isoflurane avec cône de nez en place jusqu'à 30 s après la respiration cesser.
    2. Retirez la souris de la scène.
    3. Effectuer la dislocation cervicale.
  8. Traitement d'image
    1. Chargez toutes les images dans ImageJ et formatez-les dans une hyperpile en 5 dimensions (x, y, z, t, et canal de couleur).
    2. Effectuer la séparation du chevauchement spectral (c.-à-d. : GFP et CFP) et l'élimination de la dérive x-y des hyperstacks en utilisant les méthodes établies38.
    3. Utilisez la luminosité et l'ajustement de contraste pour augmenter le niveau blanc du canal sanguin afin que le signal d'arrière-plan devient visible.
    4. Pour chaque tranche z, inspectez soigneusement chaque film pour déceler les signes de fuite vasculaire transitoire (une « rafale »). Exécution des films à des taux d'images rapides (40 fps) peut aider cette identification.
    5. Une fois qu'une rafale a été identifiée, retournez la luminosité de ce canal à un niveau normal et recadrez l'hyperpile dans cette région et z-slice.

2. Évaluation du dextran extravasculaire à l'aide de l'analyse des tissus fixes

  1. Préparation de la tumeur et de l'échantillon
    REMARQUE : La 2ème partie de ce protocole suppose que les tumeurs de sein ont été moissonnées à partir d'un modèle orthotopic de souris de greffe de carcinome de sein (c.-à-d. le MMTV-PyMT). Ce modèle pourrait être le même que celui décrit dans la 1ère partie du protocole, bien que les tumeurs fluorescentes ne soient pas nécessaires à ce stade.
    1. Après la fin du pipeline expérimental (c.-à-d. les traitements médicamenteux, etc.), effectuer une injection de queue-vaine de 100 oL de 10 mg/mL 155 kDa dextran-tetramethyl rhodamine, 1 h avant de sacrifier les souris.
    2. Sacrifiez les souris et récoltez les tumeurs du sein.
    3. Fixer les tumeurs dans 10% formaline pour 48-72 h et procéder à la paraffine-embedding.
    4. À l'aide d'un microtome, couper deux lames séquentielles de 5 m d'épaisseur à partir des tissus paraffinés (FFPE) fixés par la formaline. Une diapositive est utilisée pour tacher le dextran, tandis que l'autre sera utilisée pour effectuer TMEM triple-IHC, pour référence.
      REMARQUE : Le protocole triple-immunohistochemistry de TMEM a été décrit ailleurs 10.
  2. SI coloration et numérisation pour la première des deux sections séquentielles
    1. Soumettez des diapositives à un protocole standard de désaffinalisation. Cela comprend deux immersions subséquentes en xylène (10 min chacun), suivies d'une déshydratation dans des solutions d'alcool diluéenne (100 %, 95 %, 70 % et 50 % et 50 % d'EtOH en H2O pendant 2 min par immersion).
    2. Effectuer la récupération d'antigène en chauffant (près du point d'ébullition) les sections immergées dans du citrate (pH 6,0-ajusté) pendant 20 min.
    3. Laisser refroidir les échantillons à température ambiante pendant 15-20 min, puis laver en PBS 3x pendant 2 min chaque lavage.
    4. Bloquer pendant 60-90 min dans le tampon de blocage (10% FBS; 1% BSA; 0.0025% de la gélatine de peau de poisson; 0.05% PBST, c.-à-d. PBS avec 0.05% Tween-20).
    5. Incuber des échantillons avec un mélange d'anticorps primaires de rat et de lapin qui ciblent endomucinet et TMR, respectivement, puis laver dans PBST 3x, 2 min chacun.
    6. Incuber des échantillons avec un mélange d'anticorps secondaires d'âne contre le rat IgG (conjugué à Alexa-647) et le lapin IgG (conjugué à Alexa-488), puis laver en PBST 3x 2 min chacun.
    7. Effectuez une coloration DAPI de routine (c.-à-d. immersion dans la solution DAPI pendant 5-6 min), montez les diapositives à l'aide d'un support de montage « dur » sans glycérol et entreposez-les dans un endroit sombre jusqu'à la numérisation.
    8. Pour obtenir des résultats optimaux, numériser les diapositives sur un scanner de diapositives numérique.
  3. Analyse d'images
    1. Capturez 10 champs de haute puissance (HPF) par cas, en utilisant n'importe quel logiciel adapté à la pathologie numérique.
    2. Enregistrer les canaux Endomucin (rouge) et TMR (vert) séparément sous le nom de TIFF.
    3. À l'aide d'ImageJ, téléchargez les fichiers TIFF et convertissez-les en images 8 bits.
    4. Seuil les images 8 bits au niveau du contrôle négatif, et de générer deux images binarisées, montrant l'Endomucin et TMR "masques".
    5. À partir des outils binaires, sélectionnez Trous de remplissage sur le masque endodomucine.
    6. Générer et enregistrer les cinq régions d'intérêt suivantes: 1) L'image dextran seuilcomme "Dextran ROI" (ROI1), 2) l'image endodomptine seuil comme "Roi-roi vasculaire" (ROI2), 3) l'image inversée endomptine comme "Extravascular ROI" (ROI3), 4) le croisé " Extravascular ROI" et "Dextran ROI" image (ROI1 -ROI3) comme "Extravascular Dextran ROI" (ROI4), et 5) l'image entière comme "Roi-roi de tumeur" (ROI5).
    7. Divisez la zone ROI4 par la zone roi5 et multipliez par 100 pour générer la zone de pourcentage que le dextran extravasculaire couvre dans la tumeur entière.
    8. Répétez le processus pour 10-20 HPFs par cas (selon la disponibilité des tissus) et de générer une moyenne Extravascular Dextran (% zone) pour chaque cas.

Résultats

Les procédures expérimentales décrites dans cet article de protocole sont brièvement résumées et illustrées dans la figure 1A-C.

Pour mesurer la perméabilité vasculaire médiée par TMEM (« activité d'éclatement ») et pour réduire le bruit expérimental d'autres modes de perméabilité vasculaire (c.-à-d. transcellulaire et paracellulaire, comme expliqué dans l'introduction), nous avons effectué l'intraveineuse (i.v.) injection de...

Discussion

Ici, nous énoncions deux protocoles qui peuvent être appliqués pour visualiser et quantifier un type spécifique de perméabilité vasculaire qui est présent aux portes de TMEM et est associé à la perturbation des jonctions vasculaires serrées et adhérentes. Ce type de perméabilité vasculaire est transitoire et contrôlé par le complexe cellulaire tripartite TMEM, tel qu'expliqué ci-dessus5. La capacité d'identifier et de quantifier la perméabilité vasculaire TMEM-associée est cruc...

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne divulguent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

Nous tenons à remercier l'Installation d'imagerie analytique (AIF) de l'Albert Einstein College of Medicine pour son soutien en imagerie. Ce travail a été soutenu par des subventions du NCI (P30CA013330, CA150344, CA 100324 et CA216248), du SIG 1S10OD019961-01, du Gruss-Lipper Biophotonics Center et de son Programme d'imagerie intégrée, et de Ruth L. Kirschstein T32 de Montefiore pour l'étude du microenvironnement tumoral (CA200561).

GSK a co-écrit le manuscrit, réalisé l'imagerie pour la figure 1C et 3B, développé un protocole d'analyse des tissus fixes et analysé et interprété toutes les données; JMP a co-écrit le manuscrit et a effectué la chirurgie et l'imagerie intravitale pour la figure 1B,2C et 3A; LB et AC ont effectué la chirurgie et l'imagerie intravitale pour la figure 2B; RJ a effectué la chirurgie et l'imagerie intravitale pour la figure 2A; JSC a co-écrit le manuscrit et analysé et interprété toutes les données; MHO a co-écrit le manuscrit et analysé et interprété toutes les données; et DE a effectué la chirurgie et l'imagerie intravitale pour la figure 2D, a co-écrit le manuscrit, a développé l'analyse fixe des tissus et des protocoles d'imagerie intravitale, et a analysé et interprété toutes les données.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-rabbit IgG (Alexa 488)Life Technologies CorporationA-11034
Anti-rat IgG (Alexa 647)Life Technologies CorporationA-21247
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CitrateEng Scientific Inc9770
Cover Glass SlipsElectron Microscopy Sciences72296-08
Cyanoacrylate AdhesiveHenkel Adhesive1647358
DAPIPerkin ElmerFP1490
Dextran-Tetramethyl-RhodamineSigma AldrichT1287
DMEM/F12Gibco11320-033
Endomucin (primary antibody)Santa Cruz Biotechnologysc-65495
EnrofloxacinBayer84753076 v-06/2015
Fetal Bovine SerumSigma AldrichF2442
Fish Skin GelatinFisher ScientificG7765
Insulin SyringeBecton Dickinson309659
IsofluoraneHenry ScheinNDC 11695-6776-2
MatrigelCorningCB40234Artificial extracellular matrix
Needle (30 G)Becton Dickinson305128
Phosphate Buffered SalineLife Technologies CorporationPBS
Polyethylene TubingScientific Commodities IncBB31695-PE/1
Pulse OximeterKent ScientificMouseOx
Puralube Vet OintmentDechraNDC 17033-211-38
Quantum DotsLife Technologies CorporationQ21561MP
RubberMcMaster Carr1310N14
TMR (primary antibody)InvitrogenA6397
Tween-20MP BiologicalsTWEEN201
XyleneFisher Scientific184835

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