JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لاعداد الخلايا الدهنية والضامة البريتونية وتحليل كفاءه افيروسيتوسيس والمثبطة المحددة بوساطة عرقله الخلايا الدهنية أحاطه. هذا البروتوكول لديه تطبيق واسعه في الخلية بوساطة أزاله الجزيئات الأخرى بما في ذلك الخرز الاصطناعي والبكتيريا.

Abstract

الخلية المبرمج هو عمليه طبيعيه ويلعب دورا حاسما في التنمية الجنينية ، وتنظيم التماثل ، والحث التسامح المناعي ، وحل التهاب. تراكم الحطام ابوتوتيك في الجسم قد يؤدي إلى الاستجابات التهابيه المزمنة التي تؤدي إلى امراض المناعة الذاتية الجهازية مع مرور الوقت. تم التورط في أزاله الخلايا الميتة المصابة بامراض المناعة الذاتية. أزاله ابوتوتيك هي عمليه معقده نادرا ما يتم الكشف عنها في ظل الظروف الفسيولوجية. انه ينطوي علي المستقبلات السطحية وفيرة واشاره جزيئات. دراسة عمليه أزاله الخلايا ابوتوتيك يوفر أليات الجزيئية الثاقبة والاستجابات البيولوجية اللاحقة ، والتي قد تؤدي إلى تطوير التداوي الجديدة. هنا ، ونحن وصف بروتوكولات لتحريض الخلايا الدهنية ، واعداد الضامة البريتوني ، وتحليل أزاله الخلايا ابوتوتيك عن طريق تدفق الخلوي والمجهر. وسوف تخضع جميع الخلايا المبرمج في مرحله معينه ، والعديد من الخلايا السكنية والمنتشرة يمكن امتصاص الحطام ابوتوتيك. ولذلك ، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف هنا في العديد من التطبيقات لتوصيف ربط الخلية ابوتوتيك والابتلاع بواسطة العديد من أنواع الخلايا الأخرى.

Introduction

جسمنا يولد 1-10 مليار خليه ابوتوتيك علي أساس يومي. يجب مسح مثل هذا العدد الكبير من الخلايا ابوتوتيك بطريقه ان الاستجابات المناعية لا تزال هادئه. لضمان أزاله الخلايا ابوتوتيك في الوقت المناسب ، وأنواع عديده من الخلايا المقيمة الانسجه والخلايا المتداولة تطوير أليات لابتلاع الخلايا ابوتوتيك1. وقد تورط تنظيم مختلة من موت الخلايا المبرمج في بداية وتطور مختلف الامراض التهابيه والحصانة الذاتية2. المبرمج أيضا يلعب دورا حاسما في التسبب في تطور السرطان ومقاومتها اللاحقة للعلاجات التقليدية3,4. أزاله الخلايا ابوتوتيك عموما يعزز استجابه مضاده للالتهابات ، والتي قد تكون مرتبطة بالتسامح المناعي5. اضطرابات أزاله الخلايا ابوتوتيك يدفع التمنيع الذاتي ويساهم في تطوير امراض المناعة المناعية الجهازية في كل من البشر والفئران6.

عندما الخلايا الخضوع للخلايا المبرمج, انها تعرض فوسفاتيديلسيرين (PtdSer) من النشرة الداخلية إلى النشرة الخارجية لغشاء. ثم سيتم التعرف علي PtdSer من قبل الخلايا الشحمية من خلال مستقبلات السطح. وقد تم تحديد أكثر من اثني عشر مستقبلا للاعتراف و/أو تسهيل أحاطه الخلايا الميتة. بشكل عام ، هناك ما لا يقل عن ثلاثه أنواع من المستقبلات السطحية المشاركة في أزاله الخلايا ابوتوتيك: مستقبلات الربط ، والتعرف علي الخلايا ابوتوتيك. المستقبلات دغدغه ، والشروع في أحاطه ؛ المستقبلات المشقوقة ، وتسهيل العملية برمتها7. [تام] مستقبلات [تيروزين] [كيناسيس] ([تام] [رتكس]) يتالف [ر] [ترو-3], [اكس], و [م] وعبر عن في الدرجة الاولي ب [ميلينويد] خلايا من ال [ايمون سستم]8. الوظيفة الرئيسية لل RTKs تام هو ان تكون بمثابه مستقبلات الربط ، وتسهيل أزاله الفاغميه من الخلايا ابوتوتيك والحطام. وقد درست مجموعتنا تام بوساطة أزاله الخلايا ابوتوتيك في وضع المناعة الذاتية لسنوات عديده. نمو البروتين المعتمدة علي فيتامين ك القبض علي بروتين محدد 6 (Gas6) والبروتين S (الإيجابيات) بربط وينشط مستقبلات تام9,10. يتم إنتاج Gas6 في القلب والكلي والرئتين. يتم إنتاج الإيجابيات أساسا في الكبد11. يدرك تام من الخلايا ابوتوتيك في مثل هذه الطريقة ان N-الطرفية من Gas6/الإيجابيات بربط PtdSer علي خليه ابوتوتيك والطرفية C من Gas6/الإيجابيات بربط مستقبلات تام التي ترتكز علي سطح الخلايا الشحمية. بالاضافه إلى المستقبلات الأخرى ، يحدث أحاطه الخلايا الميتة12. علي الرغم من ان مير يمكن ربط كل من الإيجابيات يغاندس و Gas6 ، وجدنا ان Gas6 يبدو ان الحرف الوحيد لالبلعمه مير بوساطة الضامة من الخلايا ابوتوتيك ، والتي يمكن حظرها من قبل المضادة--مير الأضداد13. الضامة هي البالعات المهنية. التخليص السريع للخلايا ابوتوتيك من قبل الضامة مهم لتثبيط التهاب والاستجابات المناعية الذاتية ضد المستضدات داخل الخلايا. مستقبلات مير التيروزين كيناز أمر بالغ الاهميه لأحاطه الضامة والتخليص الفعال للخلايا ابوتوتيك14. في الطحال الفار ، ويعبر مير أساسا علي المنطقة الهامشية والضامة الجسم ملموسه13.

يصف البروتوكول المعروض هنا أسلوبا أساسيا للحث علي الخلايا المبرمجة للخلايا ويوضح طرق قياس العملية وكفاءه افيروسيتوسيس. ويمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهوله لدراسة الافيروسيتوسيس من قبل أنواع الخلايا الأخرى في أحاطه خلايا ابوتوتيك من أصول مختلفه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تربيه الفئران التجريبية والحفاظ عليها في مستعمره الفئران لدينا. وقد أجريت جميع الاعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيواني (IACUC) التابعة لجامعه سينسيناتي.

1. اعداد CFSE المسمية الخلايا الدهنية ثيتوتيك

  1. موت ببطء اثنين من الفئران الساذجة C57/B6 بواسطة CO2 استنشاق لمده 10 دقيقه وتشريح لفتح تجويف الصدر ، وأزاله (سحب) الغدة الصعتريه مع ملقط غرامه الطرف المنحني في الانسجه ثقافة بتري طبق يحتوي علي 10 مل من RPMI1640 المتوسطة.
  2. الحصول علي تعليق خليه واحده عن طريق طحن الغدة الصعتريه كله ضد اثنين من نهايات متجمد من الشرائح المجهر ومن ثم تصفيه التعليق من خلال 100 μm مصفاه الخلية.
  3. جمع 10 مل تعليق الغدة الصعتريه في أنبوب 50 mL والطرد المركزي في 300 x ز لمده 5 دقائق.
  4. أزاله supernatant ، أعاده التعليق في 40 mL من 1x تلفزيوني ، والعد أرقام الخلايا مع مقياس الكريات الدموية.
  5. الطرد المركزي في 300 x ز ل 5 دقيقه وأزاله supernatant.
  6. أعاده التعليق في 20 مل من 1x تلفزيوني في أنبوب 50 mL كتعليق خليه واحده مع ما يصل إلى 2 × 108 الخلايا (إذا كان أكثر من 2 × 108 خلايا ، أعاده تعليق بقية الخلايا في آخر 20 مل من 1 × تلفزيوني في أنبوب مختلف 50 ml).
  7. جعل 5 μM من CFSE في حجم متساو (20 مل) من 1x تلفزيوني في أنبوب منفصل 50 mL عن طريق التنضيد 40 μL من محلول الأسهم CFSE (2.5 mM) في 20 مل من 1x تلفزيوني وتخلط جيدا عن طريق عكس الأنبوب 2-3 مرات.
  8. أضافه 20 مل من CFSE من الخطوة 1.7 إلى 20 مل من تعليق الخلية من الخطوة 1.6 (التركيز النهائي من CFSE هو الآن 2.5 μM).
    ملاحظه: لكل تعليق الخلية 20 مل ، وهناك حاجه إلى 20 مل من أنبوب CFSE.
  9. عكس الخلية وخليط CFSE أنبوب 2-3 مرات واحتضان الخليط في الظلام في درجه حرارة الغرفة لمده أقصاها 2 دقيقه ، ثم وقف رد الفعل عن طريق أضافه 10 مل من مصل الحصان الحرارة المعطلة.
  10. الطرد المركزي الخليط أنبوب 50 mL في 300 x ز ل 5 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    ملاحظه: إذا كانت العلامات CFSE ناجحه ، سوف تصبح الخلية بيليه الضوء الأصفر في اللون.
  11. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق علي بيليه الخلية في 40 mL من 1x تلفزيوني وأرقام الخلايا العد مع مقياس الكريات الدموية.
  12. الطرد المركزي تعليق الخلية في 300 x ز ل 5 دقيقه وتجاهل supernatant.
  13. يغسل الخلية بيليه مره أخرى مع 40 mL من RPMI1640 المتوسطة.
  14. أزاله ماده طافي وأعاده التعليق الخلايا مع RPMI1640 الانسجه الثقافة المتوسطة (RPMI1640 ، 20 مم hepes ، 10 ٪ (الحرارة المعطلة) ، 20 مم الجلوتامين ، و 1x القلم/العقديات) بتركيز 7 × 106 خلايا/مل في صحن ثقافة الانسجه مم 100.
    ملاحظه: إذا تم الحصول علي المزيد من الخلايا ، ستكون هناك حاجه إلى طبق منفصل للثقافة النسيجية 100 ملم.
  15. أضافه ستوروبوروين في ثقافة تعليق الخلية في تركيز النهائي من 1 μM والثقافة ل 4 ح في 37 درجه مئوية في حاضنه ثقافة الانسجه الموردة مع 5% CO2.

2. اعداد الضامة الصفاقي

  1. حقن اثنين من الفئران C57B6 (أو اي الفئران التلاعب الجينات في المختبر) داخل الصفاق مع 1 مل من 3% الذين تتراوح أعمارهم بين ثيوغليتيجمع في اليوم 0.
  2. موت ببطء الفئران في اليوم 5 كما في الخطوة 1.1 ، وقطع وقشر فتح الجلد في البطن ولكن ترك الصفاق سليمه. مسح التجويف البريتوني عن طريق دفع بسرعة 10 مل من العازلة غسل (RPMI1640 ، 2 ٪ ، 0.04 ٪ أدتا) في التجويف البريتوني باستخدام حقنه 10 مل مرفقه مع ابره 18 غرام.
  3. استرداد المخزن المؤقت يغسل ببطء مع نفس الابره/حقنه ، وجمع العازلة يغسل في أنبوب 50 mL (التفاصيل تشير إلى المادة المختبر Janssen15).
  4. غسل أنبوبي البريتوني مرتين مع 1x تلفزيوني, أعاده تعليق الضامة البريتوني في RPMI1640 الانسجه ثقافة المتوسطة في كثافة 2 × 106 خلايا/مل و قسامه 500 μl في كل بئر من لوحه 24 بئر. اترك الصحن في حاضنه لزراعه الانسجه لمده 2 ساعة.
  5. أزاله الخلايا العائمة عن طريق الشفط واستبدال مع 500 μL من الثقافة الطازجة المتوسطة ، مرتين.
  6. بشكل اختياري ، أضافه مثبطات تيروزين مستقبلات TAM ، RXDX-106 ، في تركيزات المشار اليها في الأساطير الرقم في كل بئر من ثقافة الضامة واحتضان لأخر 2 ح.

3. شارك في الثقافة الضامة البريتوني مع الخلايا الدهنية

  1. جمع الخلايا الميتة من الخطوة 1 ويغسل ثلاث مرات مع RPMI1640 المتوسطة. ويمكن قياس كفاءه الحث ابوتوتيك في هذه المرحلة مع المرفق الخامس/7-عاد عده.
  2. توزيع 0-12 x 106 خلايا (في 500 μl المتوسطة) في كل بئر من الثقافات الضامة من #2 البروتوكول ، وفقا للترتيب التجريبي (علي سبيل المثال ، انظر الشكل 1). وهذا يجعل حجم الثقافة كله من 1 مل في كل بئر من لوحه 24 بئر. أضافه الأجسام المضادة حظر في الثقافة مباشره قبل أضافه الخلايا الدهنية.
  3. ثقافة الخلية خليط في 37 [ك] ل 4 [ه] في نسيج ثقافة حاضنه يزود مع 5% [كو]2.
  4. غسل كل بئر من الثقافة مع 1x تلفزيوني (تحتوي علي 500 μM أدتا) مرتين لأزاله الخلايا الحرة العائمة ابوتوتيك.
  5. وصمه عار الضامة لوحه ملزمه مع CD11b في هذه المرحلة.
    1. غسل الضامة لوحه منضم مع العازلة تلطيخ (1x تلفزيوني ، 1 ٪ بوسني) مره واحده.
    2. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة التي تحتوي علي 2 μL CD11b في كل بئر.
    3. احتضان لوحه في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
    4. اغسل كل بئر من لوحه ثلاث مرات مع العازلة تلطيخ.
    5. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة والمضي قدما في لوحه لتحليل الصور تحت المجهر الفلورسنت.
  6. بدلا من ذلك ، فصل الضامة لوحه منضمة باضافه 1 مل من ليدوكائين 1 ٪ في التلفزيونية واحتضان لمده 10 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  7. افصل الضامة ذات اللوحة المنضمة باستخدام الأنابيب المتكررة.
  8. نقل الضامة التعليق إلى 5 مل الفردية جولة أسفل أنبوب FACS من كل بئر من لوحه 24 بئر.
  9. الطرد المركزي في 300 x g لمده 5 دقائق.
  10. أزاله ماده طافي وأضافه 200 μl من تلطيخ العازلة التي تحتوي علي 2 μl من CD11b (1:200 التخفيف في تلطيخ العازلة).
  11. احتضان تعليق الخلية في العازلة تلطيخ في 4 درجه مئوية لمده 20 دقيقه.
  12. غسل تعليق الخلية مرتين مع العازلة تلطيخ.
  13. أضافه 200 μL من تلطيخ العازلة والمضي قدما لتحليل FACS مع تدفق المضخم وتحليل لنسبه مئوية من الضامة الايجابيه CFSE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تحليل أحاطه الضامة البريتوني من الخلايا الدهنية. وقد أعدت الضامة البريتوني والخلايا ابوتوتيك وشارك في استزراع كما هو موضح في البروتوكول. وفصلت الضامة وملطخه PE المضادة لCD11b الجسم لمده 20 دقيقه علي الجليد. ثم تم غسل الضامة ومعالجتها في تدفق الخلوي. كما راينا, لا يوجد الضامة الايجابي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المبرمج هو عمليه الموت خليه المحفوظة للغاية التي تنطوي علي العديد من الشلالات اشاره ويدفع التعبير البروتين, إفراز, والنقل. المبرمج غالبا ما يرتبط مع التغيرات المورفولوجية الخلوية17. الخلايا ابوتوتيك الإفراج بنشاط السايتوكينات والكيميائية التي تجذب البالعات للهجرة إلى الموق...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويدعم البحث في مختبر شاو من قبل جائزه البحوث المبتكرة من كليه الطب والجائزة التجريبية كليه المبتدئين من قسم الطب الباطني ، جامعه سينسيناتي ومنح DK K01_095067 من NIDDK/المعاهد الوطنية للصحة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ack lysing bufferGIBCOA10492
Annexin V/7-AADBD Pharmingen559763
Anti-Mer antibodyR&D SystemsBAF591
CD11b-PE (clone M1/70)BD Pharmingen553311
CFSEInvitrogenC1157
DMSOSigma-AldrichD-2650
EDTA (0.5 mM)GIBCO15575-020
FACS tubesBD Biosciences352017
Frosted slidesFisher Scientific12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)Invitrogen26050088
LidocaineSigma-AldrichL-5647Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1xCorning21040CV
RPMI-1640Corning10040CV
RXDX-106Selleck ChemicalsCEP-40783
Staurosprine (100mg)Fisher ScientificBP2541-100Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer ModifiedBD Biosciences243010Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

References

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202(2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87(2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058(2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076(2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van 'T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319(2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001(2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561(2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748(2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved