Análise experimental do engulfment do Thymocyte de apoptotic por macrófagos

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo para preparar timócitos apoptóticos e macrófagos peritoneais e para analisar a eficiência do macrófagos e do bloqueio inibidor-negociado específico do engulfment apoptóticas dos timócitos. Este protocolo tem uma aplicação larga no afastamento Cell-negociado de outras partículas que incluem grânulos e bactérias artificiais.

Resumo

A apoptose celular é um processo natural e desempenha um papel crítico no desenvolvimento embrionário, na regulação homeostática, na indução da tolerância imune e na resolução da inflamação. O acúmulo de detritos apoptóticos no corpo pode desencadear respostas inflamatórias crônicas que levam a doenças auto-imunes sistêmicas ao longo do tempo. O afastamento de pilha apoptóticas danificado foi implicado em uma variedade de doenças auto-imunes. A depuração apoptótica é um processo complexo raramente detectado em condições fisiológicas. Envolve receptores de superfície abundantes e moléculas de sinalização. Estudar o processo de liberação de células apoptóticas fornece mecanismos moleculares perspicazes e respostas biológicas subsequentes, o que pode levar ao desenvolvimento de novas terapêuticas. Aqui, nós descrevemos protocolos para a indução de thymocytes apoptóticas, a preparação de macrófagos peritoneais, e a análise do afastamento de pilha apoptóticas pelo fluxo citometria e pela microscopia. Todas as células serão submetidas a apoptose em um determinado estágio, e muitas células residenciais e circulantes podem captação de detritos apoptóticos. Portanto, o protocolo descrito aqui pode ser usado em muitas aplicações para caracterizar a ligação e a ingestão de células apoptóticas por muitos outros tipos de células.

Introdução

Nosso corpo gera 1-10 bilhões de células apoptóticas em uma base diária. Um número tão grande de pilhas apoptóticas deve ser cancelado de uma maneira que as respostas imunes permaneçam quiescentes. Para garantir o despejo de células apoptóticas em tempo hábil, inúmeros tipos de células residentes no tecido e células circulantes desenvolvem mecanismos para engolfo células apoptóticas¹. A regulação disfuncional da apoptose tem sido implicada no início e progressão de várias doenças inflamatórias e autoimunidade². A apoptose também desempenha um papel crítico na patogênese do desenvolvimento do câncer e sua subsequente resistência aos tratamentos convencionais^3,4. A remoção de células apoptóticas geralmente promove uma resposta anti-inflamatória, que pode estar ligada à tolerância imunológica⁵. A violação do afastamento de pilha apoptóticas conduz o Self-imunização e contribui ao desenvolvimento de doenças auto-imunes sistemáticas em seres humanos e em ratos⁶.

Quando as células passam por apoptose, elas expõem a fosfatidilserina (PtdSer) do folheto interno ao folheto externo da membrana. O PtdSer será então reconhecido pelos fagócitos através de receptores de superfície. Mais de uma dúzia de receptores foram identificados para reconhecer e/ou facilitar o engulfment de células apoptóticas. Em geral, há pelo menos três tipos de receptores de superfície envolvidos na depuração celular apoptótica: receptores tethering, reconhecem células apoptóticas; fazer cócegas nos receptores, iniciar o engulfment; os receptores de chaperoning, facilitam o processo inteiro⁷. As tirosina cinases do receptor TAM (TAM RTKs) consistem em Tyro-3, AXL e Mer e são expressas principalmente por células mielóides do sistema imunológico⁸. A função primária de TAM RTKs é servir como receptores tethering, facilitando a remoção fagocítica de células apoptóticas e detritos. Nosso grupo tem estudado o afastamento de pilha apoptóticas negociado Tam no ajuste da autoimunidade por muitos anos. A proteína de crescimento protéico dependente de vitamina K 6 (Gas6) e proteína S (prós) vincula e ativa os receptores de Tam^9,10. Gas6 é produzido no coração, rins e pulmões. ProS é produzido principalmente no fígado¹¹. TAM reconhece de células apoptóticas de tal forma que o N-terminal de Gas6/ProS se liga ao PtdSer em uma célula apoptótica e o C-terminal de Gas6/ProS se liga aos receptores TAM que ancorados na superfície dos fagócitos. Juntamente com os outros receptores, a engulfment de células apoptóticas ocorre¹². Embora o Mer possa se vincular tanto aos ligantes ProS e Gas6, descobrimos que Gas6 parece ser o único ligador para a fagocitose de macrófagos mediada por Mer de células apoptóticas, que podem ser bloqueadas pelo anticorpo anti-Mer¹³. Os macrófagos são fagócitos profissionais. O afastamento rápido de pilhas apoptóticas por macrófagos é importante para a inibição da inflamação e de respostas auto-imunes de encontro aos antígenos intracelular. A tirosina quinase do receptor de Mer é crítica para o engulfment do macrófago e o afastamento eficiente de pilhas apoptóticas¹⁴. No baço do camundongo, Mer expressa principalmente sobre a zona marginal e os macrófagos corpóreos¹³.

O protocolo aqui apresentado descreve um método básico para induzir a apoptose celular e demonstrar formas de mensurar o processo e a eficiência da eferocitose. Estes protocolos podem prontamente ser adaptados para estudar o macrófagos por outros tipos da pilha no engulfment de pilhas apoptóticas de origens diferentes.

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Protocolo

Camundongos experimentais foram criados e mantidos em nossa colônia de camundongos. Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com as diretrizes do Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade de Cincinnati.

1. preparação de CFSE rotulados timócitos apoptóticos

1. Eutanizar dois ratos C57/B6 ingênuos por inalação de CO₂ por 10 min e dissecar para abrir a cavidade torácica, remover (puxar) o Timo com fórceps curvo de ponta fina no prato de Petri de cultura de tecido contendo 10 ml de meio RPMI1640.
2. Obtenha a única suspensão da pilha moendo o Timo inteiro de encontro a duas extremidades geadas das corrediças do microscópio e filtre então a suspensão com o filtro da pilha de 100 μm.
3. Colete a suspensão de 10 ml de timo em um tubo de 50 ml e centrifugue em 300 x g por 5 minutos.
4. Retire o sobrenadante, ressuscitem em 40 mL de 1X PBS, e contagem de números de células com um Hemocytometer.
5. Centrifugue a 300 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
6. Ressuspender em 20 mL de 1X PBS em um tubo de 50 mL como uma única suspensão da pilha com até 2 x 10⁸ pilhas (se mais de 2 x 10⁸ pilhas, Ressuspender o descanso das pilhas em uns outros 20 ml de 1 x PBS em um tubo diferente de 50 ml).
7. Faça 5 μM de CFSE em igual volume (20 mL) de 1X PBS em um tubo separado de 50 mL introduzindo 40 μL de solução de estoque CFSE (2,5 mM) em 20 mL de 1X PBS e misture bem invertendo o tubo 2-3 vezes.
8. Adicione os 20 mL de CFSE da etapa 1,7 no 20 mL da suspensão da pilha da etapa 1,6 (a concentração final de CFSE é agora 2,5 μM).
   Nota: para cada suspensão de célula de 20 mL, é necessário um tubo de 20 mL de CFSE.
9. Inverta o tubo da mistura da pilha e do CFSE 2-3 vezes e incubar a mistura no escuro na temperatura ambiente por um máximo de 2 minutos, a seguir pare a reação adicionando 10 mL do soro Calor-Inactivated do cavalo.
10. Centrifugue a mistura do tubo de 50 mL em 300 x g por 5 minutos na temperatura ambiente.
    Nota: se a rotulagem CFSE for bem-sucedida, o pellet de células se tornará amarelo claro na cor.
11. Retire o sobrenadante e ressuscitem o pellet celular em 40 mL de 1X PBS e contagem de números de células com um Hemocytometer.
12. Centrifugue a suspensão celular a 300 x g durante 5 min e descarte o sobrenadante.
13. Lave novamente a pastilha celular com 40 mL de meio RPMI1640.
14. Remova as células sobrenadantes e ressuscitem com meio de cultura de tecido RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calor inativado), 20 mM de glutamina e 1x Pen/Strep) em uma concentração de 7 x 10⁶ células/ml em um prato de cultura de tecido de 100 mm.
    Nota: se forem obtidas mais células, será necessário um prato de cultura de tecido de 100 mm separado.
15. Adicionar estaurosporina na cultura da suspensão da pilha em uma concentração final de 1 μm e cultura para 4 h em 37 ° c em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o co₂de 5%.

2. preparação de macrófagos peritoneais

1. Injete dois camundongos C57B6 (ou qualquer rato manipulado por genes no laboratório) intraperitonealmente com 1 mL de tioglicato de 3% envelhecido no dia 0.
2. Eutanizar os camundongos no dia 5 como na etapa 1,1, cortar e descascar abrir a pele abdominal, mas deixar o peritônio intacto. Lave a cavidade peritoneal empurrando rapidamente 10 mL de tampão de lavagem (RPMI1640, 2% FBS, 0, 4% EDTA) na cavidade peritoneal usando uma seringa de 10 mL unida com uma agulha de 18 G.
3. Recupere o tampão de lavagem lentamente com a mesma agulha/seringa e colete o tampão de lavagem em um tubo de 50 mL (detalhes referem-se ao artigo¹⁵do laboratório da Janssen).
4. Lave o gavagem peritoneal duas vezes com 1X PBS, Ressuspender os macrófagos peritoneais no meio de cultura do tecido RPMI1640 em uma densidade de 2 x 10⁶ Cells/ml e alíquota 500 μl em cada poço da placa 24-well. Deixe a placa em uma incubadora da cultura do tecido para 2 h.
5. Remova as células flutuantes aspirando e substituindo com 500 μL de meio de cultura fresca, duas vezes.
6. Opcionalmente, adicione o inibidor de tirosina do receptor TAM, RXDX-106, em concentrações indicadas nas legendas de figura em cada poço da cultura de macrófago e incubar por mais 2 h.

3. co-cultura de macrófagos peritoneais com timócitos apoptóticos

1. Colete timócitos apoptóticos do passo 1 e lave três vezes com meio RPMI1640. A eficiência da indução apoptótica pode ser medida nesta fase com o kit Anexin V/7-AAD.
2. Distribuir 0-12 x 10⁶ células (em meio 500 μL) em cada poço das culturas de macrófago do protocolo #2, de acordo com o arranjo experimental (por exemplo, veja a Figura 1). Isso faz com que todo o volume de cultura de 1 mL em cada poço da placa de 24 poços. Adicione o anticorpo de obstrução na cultura imediatamente antes da adição de thymocytes apoptóticas.
3. Cultura a mistura da pilha em 37 ° c por 4 h em uma incubadora da cultura do tecido fornecida com o CO₂de 5%.
4. Lave cada poço da cultura com 1X PBS (contendo 500 μM de EDTA) duas vezes para remover as células apoptóticas de flutuação livre.
5. Manchar os macrófagos ligados à placa com CD11b-PE nesta fase.
   1. Lave os macrófagos ligados à placa com tampão de coloração (1X PBS, 1% BSA) uma vez.
   2. Adicionar 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE em cada poço.
   3. Incubar a placa a 4 ° c durante 20 min.
   4. Lave cada poço da placa três vezes com o amortecedor de coloração.
   5. Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder a placa para análise de imagem o microscópio fluorescente.
6. Alternativamente, separe os macrófagos ligados à placa adicionando 1 mL de lidocaína a 1% em PBS e incubando por 10 min a 37 ° c.
7. Separe os macrófagos ligados à placa com pipetagem repetida.
8. Transfira a suspensão de macrófago para um tubo FACS de 5 mL de fundo redondo de cada poço da placa de 24 poços.
9. Centrifugador a 300 x g durante 5 min.
10. Retire o sobrenadante e adicione 200 μL de tampão de coloração contendo 2 μL de CD11b-PE (1:200 diluição no tampão de coloração).
11. Incubar a suspensão da célula no tampão de coloração a 4 ° c durante 20 min.
12. Lave a suspensão da célula duas vezes com o tampão de coloração.
13. Adicionar 200 μL de tampão de coloração e proceder para a análise de FACS com um citômetro do fluxo e para analisar para a porcentagem de macrófagos do positividade de CFSE.

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Resultados

Análise do engulfment macrófago-negociado peritoneal de thymocytes apoptóticas. Macrófagos peritoneais e células apoptóticas foram preparadas e cocultivadas conforme descrito no protocolo. Os macrófagos foram destacados e corados com anticorpo CD11b conjugado PE por 20 min no gelo. Os macrófagos foram então lavados e processados em um citometro de fluxo. Como visto, não há nenhum macrófago positivo de CFSE no quadrante inferior direito quando nenhuma célula apoptótica foi adicionada na cult...

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Discussão

A apoptose é um processo de morte celular altamente conservado que envolve muitas cascatas de sinal e induz expressão protéica, secreção e transporte. A apoptose é frequentemente associada a alterações morfológicas celulares¹⁷. Células apoptóticas liberam ativamente citocinas e quimiocinas que atraem fagócitos para migrar para o local e iniciar o processo de engulfment, uma via extremamente complexa controle apertado¹⁸. Por outro lado, a morte celular necrótica...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.