Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Resumen

La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.

Introducción

Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas¹. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad². La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales^3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica⁵. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones⁶.

Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso⁷. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario⁸. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM^9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado¹¹. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce¹². Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer¹³. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas¹⁴. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles¹³.

El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.

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Protocolo

Ratones experimentales fueron criados y mantenidos en nuestra colonia de ratones. Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati.

1. preparación de los timocitos apopónticos etiquetados como CFSE

1. Eutanasia dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO₂ durante 10 min y diseccionar para abrir la cavidad torácica, remover (extraer) el timo con fórceps curvados de punta fina en un plato de Petri de cultivo de tejido que contenga 10 ml de medio RPMI1640.
2. Obtenga la suspensión de una sola célula moliendo todo el timo contra dos extremos esmerilados de los portaobjetos del microscopio y luego filtre la suspensión a través del colador de células de 100 μm.
3. Recoja la suspensión de timus de 10 mL en un tubo de 50 mL y centrifugue a 300 x g durante 5 min.
4. Retire el sobrenadante, resupend en 40 mL de 1x PBS, y cuente los números celulares con un hemociómetro.
5. Centrifugar a 300 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.
6. Resuspendio en 20 mL de 1x PBS en un tubo de 50 mL como una suspensión de célula única con hasta 2 x 10⁸ células (si más de 2 x 10⁸ células, Resuspender el resto de las células en otros 20 ml de 1 x PBS en un tubo de 50 ml diferente).
7. Hacer 5 μM de CFSE en el mismo volumen (20 mL) de 1x PBS en un tubo separado de 50 mL pipeteando 40 μL de la solución de la bolsa de CFSE (2,5 mM) en 20 mL de 1x PBS y mezclar bien invirtiendo el tubo 2-3 veces.
8. Añadir los 20 mL de CFSE del paso 1,7 en los 20 mL de suspensión celular del paso 1,6 (la concentración final de CFSE es ahora de 2,5 μM).
   Nota: para cada suspensión de celda de 20 mL, se necesita un tubo de CFSE de 20 mL.
9. Invierta la célula y el tubo de mezcla de CFSE 2-3 veces e incube la mezcla en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de 2 min, luego detenga la reacción añadiendo 10 mL de suero de caballo inactivado por calor.
10. Centrifugar la mezcla de tubos de 50 mL a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: Si el etiquetado CFSE es exitoso, el pellet de células se convertirá en color amarillo claro.
11. Retire el sobrenadante y resuspender el pellet de células en 40 mL de 1x PBS y cuente los números celulares con un hemociómetro.
12. Centrifugar la suspensión celular a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
13. Lavar el pellet de la célula de nuevo con 40 mL de medio RPMI1640.
14. Retire el sobrenadante y las células de resuspendio con RPMI1640 medio de cultivo de tejido (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% de FBS (calor inactivado), 20 mM de glutamina y 1x Pen/Strep) a una concentración de 7 x 10⁶ células/ml en un plato de cultivo de tejido de 100 mm.
    Nota: si se obtienen más células, se necesita un plato de cultivo de tejido de 100 mm por separado.
15. Añadir staurosporina en el cultivo de la suspensión celular a una concentración final de 1 μM y cultivo durante 4 h a 37 ° c en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO₂.

2. preparación de los macrófagos peritoneales

1. Inyectar dos ratones C57B6 (o cualquier ratón manipulado por genes en el laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL de tioglycollato envejecido al 3% en el día 0.
2. Eutanasia los ratones en el día 5 como en el paso 1,1, corte y cáscara abrir la piel abdominal pero dejar el peritoneo intacto. Enjuague la cavidad peritoneal empujando rápidamente 10 mL de tampón de lavado (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) en la cavidad peritoneal utilizando una jeringa de 10 mL unida con una aguja de 18 G.
3. Recupere el tampón de lavado lentamente con la misma aguja/jeringa y recoja el tampón de lavado en un tubo de 50 mL (los detalles se refieren al artículo¹⁵del laboratorio de Janssen).
4. Lavar el gavaje peritoneal dos veces con 1x PBS, resuspender los macrófagos peritoneal en RPMI1640 medio de cultivo de tejido a una densidad de 2 x 10⁶ células/ml y alícuota 500 μL en cada pozo de la placa de 24-well. Dejar la placa en una incubadora de cultivo de tejido durante 2 h.
5. Retire las células flotantes aspirando y reemplazando con 500 μL de medio de cultivo fresco, dos veces.
6. Opcionalmente, añadir inhibidor de la tirosina del receptor TAM, RXDX-106, en las concentraciones indicadas en las leyendas de la figura en cada pozo de la cultura macrófagos e incubar para otro 2 h.

3. cocultivo de macrófagos peritoneal con timocitos apopónticos

1. Recoger los timocitos apopónticos del paso 1 y lavar tres veces con RPMI1640 medio. La eficiencia de la inducción apopóntica se puede medir en esta etapa con el kit anexion V/7-AAD.
2. Distribuir 0-12 x 10⁶ células (en 500 μl medio) en cada pozo de los cultivos de macrófagos de protocolo #2, de acuerdo con la disposición experimental (por ejemplo, ver figura 1). Esto hace que todo el volumen de cultivo de 1 mL en cada pozo de la placa de 24-well. Añadir el anticuerpo de bloqueo en la cultura inmediatamente antes de la adición de los timocitos apopónticos.
3. Cultivo de la mezcla celular a 37 ° c durante 4 h en una incubadora de cultivo de tejidos suministrada con 5% de CO₂.
4. Lave cada pozo de la cultura con 1x PBS (que contiene 500 μM EDTA) dos veces para eliminar las células apopónticas de flotación libre.
5. Mancha los macrófagos atados con placas con CD11b-PE en esta etapa.
   1. Lave los macrófagos atados con placas con tampón de tinción (1x PBS, 1% BSA) una vez.
   2. Añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE en cada pozo.
   3. Incubar la placa a 4 ° c durante 20 min.
   4. Lave cada pozo de la placa tres veces con el tampón de tinción.
   5. Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder a la placa de análisis de imagen bajo el microscopio fluorescente.
6. Alternativamente, separe los macrófagos ligados a placas añadiendo 1 mL de lidocaína al 1% en PBS e incubando durante 10 min a 37 ° c.
7. Separe los macrófagos encuadernado en placa con pipeteo repetitivo.
8. Transfiera la suspensión de macrófagos a un tubo FACS de 5 mL de fondo redondo individual de cada pozo de la placa de 24-well.
9. Centrifugar a 300 x g durante 5 min.
10. Extraer el sobrenadante y añadir 200 μL de tampón de tinción que contenga 2 μL de CD11b-PE (dilución 1:200 en tampón de tinción).
11. Incubar la suspensión celular en tampón de tinción a 4 ° c durante 20 min.
12. Lavar la suspensión de la célula dos veces con tampón de tinción.
13. Añadir 200 μL de tampón de tinción y proceder al análisis de FACS con un CITOMETRO de caudal y analizar el porcentaje de macrófagos positividad de la CFSE.

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Resultados

Análisis de la enfaración peritoneal de los timocitos apópticos por macrófagos. Los macrófagos y las células apopónticas peritoneal se prepararon y cocultivaron como se describe en el protocolo. Los macrófagos fueron separados y manchados con el anticuerpo anti-CD11b de PE conjugada durante 20 min en hielo. Los macrófagos fueron lavados y procesados en un CITOMETRO de flujo. Como se ve, no hay macrófago positivo de CFSE en el cuadrante inferior derecho cuando no se agregaron células apopóntic...

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Discusión

La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular¹⁷. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto¹⁸. Por otro lado, la...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.