Analisi sperimentale di apoptotic thymocyte engulfment da macrofagi

Riepilogo

Qui, vi presentiamo un protocollo per preparare i timociti apoptotici e i macrofagi peritoneali e analizzare l'efficienza dell'efferocitosi e il blocco specifico inibitore-mediato di timociti apoptotici engulfment. Questo protocollo ha un'ampia applicazione nella clearance mediata da cellule di altre particelle, tra cui perle artificiali e batteri.

Abstract

L'apoptosi cellulare è un processo naturale e svolge un ruolo critico nello sviluppo embrionale, nella regolazione omeostatica, nell'induzione della tolleranza immunitaria e nella risoluzione dell'infiammazione. L'accumulo di detriti apoptotici nel corpo può innescare risposte infiammatorie croniche che portano a malattie immunitarie sistemiche nel tempo. Alterata clearance delle cellule apoptotiche è stata implicata in una varietà di malattie autoimmuni. La clearance apoptotica è un processo complesso raramente rilevato in condizioni fisiologiche. Si tratta di abbondanti recettori superficiali e molecole di segnalazione. Studiando il processo di clearance delle cellule apoptotiche fornisce meccanismi molecolari penetranti e successive risposte biologiche, che possono portare allo sviluppo di nuove terapie. Qui, descriviamo i protocolli per l'induzione di thymocytes apoptotici, la preparazione di macrofagi peritoneali, e l'analisi della clearance delle cellule apoptotiche da citometria di flusso e microscopia. Tutte le cellule subiscono l'apoptosi in un certo stadio, e molte cellule residenziali e circolanti possono captazione di detriti apoptotici. Pertanto, il protocollo qui descritto può essere utilizzato in molte applicazioni per caratterizzare l'associazione di cellule apoptotiche e l'ingestione da molti altri tipi di cellule.

Introduzione

Il nostro corpo genera 1-10 miliardi di cellule apoptotiche su base giornaliera. Tale numero elevato di cellule apoptotiche deve essere cancellato in modo che le risposte immunitarie rimangano quiescenti. Per garantire la clearance delle cellule apoptotiche in modo tempestivo, numerosi tipi di cellule residenti tessuto e cellule circolanti sviluppano meccanismi per inghiottire le cellule apoptotiche¹. La regolazione disfunzionale dell'apoptosi è stata implicata nell'insorgenza e nella progressione di varie malattie infiammatorie e autoimmunità². L'apoptosi svolge anche un ruolo critico nella patogenesi dello sviluppo del cancro e la sua conseguente resistenza ai trattamenti convenzionali^3,4. La rimozione delle cellule apoptotiche generalmente promuove una risposta antinfiammatoria, che può essere legata alla tolleranza immunologica⁵. La violazione della clearance delle cellule apoptotiche spinge l'auto-immunizzazione e contribuisce allo sviluppo di malattie autoimmuni sistemiche sia negli esseri umani che nei topi⁶.

Quando le cellule subiscono l'apoptosi, espongono la fosfatidilserina (PtdSer) dall'opuscolo interno al foglietto esterno della membrana. PtdSer sarà quindi riconosciuto dai fagociti attraverso i recettori superficiali. Oltre una dozzina di recettori sono stati identificati per riconoscere e/o facilitare l'fiamme di cellule apoptotiche. In generale, ci sono almeno tre tipi di recettori superficiali coinvolti nella clearance delle cellule apoptotiche: recettori tethering, riconoscono le cellule apoptotiche; solletico recettori, avviare engulfment; i recettori di da chaperon, facilitano l'intero processo⁷. Le tirosina chinasi del recettore TAM (RTK TAM) consistono in TYRO-3, AXL e Mer e sono espresse principalmente da cellule mieloidi del sistema immunitario⁸. La funzione primaria di TAM RTKs è quella di servire come recettori tethering, facilitando la rimozione fagocitica di cellule apoptotiche e detriti. Il nostro gruppo ha studiato la clearance della cellula apoptotica mediata da TAM nell'impostazione dell'autoimmunità per molti anni. La proteina K-dipendente dall'arresto della crescita proteica specifica 6 (Gas6) e proteina S (Pro) si lega e attiva i recettori Tam^9,10. Gas6 è prodotto nel cuore, nei reni e nei polmoni. Pro è prodotto principalmente nel fegato¹¹. TAM riconosce le cellule apoptotiche in modo tale che il N-terminale di Gas6/ProS si lega al PtdSer su una cellula apoptotica e il C-terminal di Gas6/ProS si lega ai recettori TAM che ancorati sulla superficie dei fagociti. Insieme con gli altri recettori, fiamme di cellule apoptotiche si verifica¹². Anche se Mer può legarsi sia ai ligandi Pro e Gas6, abbiamo scoperto che Gas6 sembra essere l'unico ligando per la fagocitosi di macrofage mediata da Mer di cellule apoptotiche, che può essere bloccata dall'anticorpo anti-Mer¹³. I macrofagi sono fagociti professionali. La clearance rapida delle cellule apoptotiche da parte dei macrofagi è importante per l'inibizione dell'infiammazione e delle risposte autoimmuni contro gli antigeni intracellulari. La tirosina chinasi del recettore del Mer è critica per l'fiamme macrofage e la clearance efficiente delle cellule apoptotiche¹⁴. Nella milza del topo, Mer si esprime principalmente sulla zona marginale e sui macrofagi corporei tangibili¹³.

Il protocollo presentato qui descrive un metodo di base per indurre l'apoptosi cellulare e dimostrare modi per misurare il processo e l'efficienza dell'efferocitosi. Questi protocolli possono essere facilmente adattati per studiare l'efferocitosi da altri tipi di cellule in fiamme di cellule apoptotiche di diverse origini.

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Protocollo

I topi sperimentali sono stati allevati e mantenuti nella nostra colonia di topi. Tutti i lavori sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università di Cincinnati.

1. preparazione di CFSE etichettati timociti apoptotici

1. Euthanize due topi C57/B6 naïve di CO₂ inalazione per 10 min e sezionare per aprire la cavità toracica, rimuovere (estrarre) il timo con pinze curve fine-Tip nella coltura tissutale Petri piatto contenente 10 ml di RPMI1640 medium.
2. Ottenere una sospensione a singola cellula rettificando l'intero Timo contro due estremità smerigliate dei vetrini del microscopio e quindi filtrare la sospensione attraverso 100 μm filtro a cellule.
3. Raccogliere la sospensione da 10 ml di timo in un tubo da 50 ml e centrifugare a 300 x g per 5 min.
4. Rimuovere il supernatante, risospendere in 40 mL di 1X PBS, e contare i numeri di cella con un emocytometro.
5. Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
6. Risospendere in 20 mL di 1X PBS in un tubo da 50 mL come una sospensione singola cellula con fino a 2 x 10⁸ cellule (se più di 2 x 10⁸ cellule, risospendere il resto delle cellule in un altro 20 ml di 1 x PBS in un diverso 50 ml tubo).
7. Fare 5 μM di CFSE in volume uguale (20 mL) di 1X PBS in un tubo separato 50 mL pipettando 40 μL di soluzione stock CFSE (2,5 mM) in 20 mL di 1X PBS e mescolare bene invertendo il tubo 2-3 volte.
8. Aggiungere i 20 mL di CFSE dal passo 1,7 nel 20 mL di sospensione cellulare dal passo 1,6 (la concentrazione finale di CFSE è ora 2,5 μM).
   Nota: per ogni sospensione cellulare da 20 mL, è necessario un 20 mL di tubo CFSE.
9. Invertire la cella e il tubo della miscela CFSE 2-3 volte e incubare la miscela al buio a temperatura ambiente per un massimo di 2 min, quindi arrestare la reazione aggiungendo 10 mL di siero di cavallo inattivato dal calore.
10. Centrifugare la miscela di provette 50 mL a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente.
    Nota: se l'etichettatura CFSE ha esito positivo, il pellet cellulare diventerà di colore giallo chiaro.
11. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di 1X PBS e contare i numeri di cella con un emocytometro.
12. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante.
13. Lavare nuovamente il pellet cellulare con 40 mL di media RPMI1640.
14. Rimuovere le cellule supernatanti e risospendere con il mezzo di coltura tissutale RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (calore inattivato), 20 mM di glutammina e 1x Pen/STREP) ad una concentrazione di 7 x 10⁶ cellule/ml in un piatto di coltura di tessuto di 100 mm.
    Nota: se si ottengono più cellule, sarà necessario un piatto di coltura tissutale separato di 100 mm.
15. Aggiungere la staurosporina nella coltura della sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 1 μM e la coltura per 4 h a 37 ° c in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO₂.

2. preparazione di macrofagi peritoneali

1. Iniettare due topi C57B6 (o qualsiasi topo manipolato dal gene in laboratorio) intraperitonealmente con 1 mL del 3% di tioglicicolato invecchiato al giorno 0.
2. Euthanize i topi al giorno 5 come al passo 1,1, tagliare e sbucciare aprire la pelle addominale, ma lasciare il peritoneo intatto. Sciacquare la cavità peritoneale spingendo rapidamente 10 mL di tampone di lavaggio (RPMI1640% FBS, 0,04% EDTA) nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL fissata con un ago da 18 G.
3. Recuperate lentamente il tampone di lavaggio con lo stesso ago/siringa e raccogliete il tampone di lavaggio in un tubo da 50 mL (i dettagli si riferiscono all'articolo¹⁵del Lab Janssen).
4. Lavare il gavaggio peritoneale due volte con 1x PBS, risospendere i macrofagi peritoneali nel mezzo di coltura tissutale RPMI1640 a una densità di 2 x 10⁶ cellule/ml e aliquota 500 μl in ogni pozzetto della piastra 24-well. Lasciare la piastra in un incubatore di coltura tissutale per 2 h.
5. Rimuovere le cellule galleggianti aspirando e sostituendo con 500 μL di mezzo di coltura fresco, due volte.
6. Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della tirosina del recettore TAM, RXDX-106, alle concentrazioni indicate nelle leggende figura in ogni pozzo della coltura macrofage e incubare per un altro 2 h.

3. co-coltura di macrofagi peritoneali con timociti apoptotici

1. Raccogliere i timociti apoptotici dal passo 1 e lavare tre volte con RPMI1640 medio. L'efficienza dell'induzione apoptotica può essere misurata in questa fase con il kit Annexin V/7-AAD.
2. Distribuire 0-12 x 10⁶ cellule (in 500 μl di media) in ogni pozzo delle colture di macrofage dal protocollo #2, secondo la disposizione sperimentale (ad esempio, vedere Figura 1). Questo rende l'intero volume di coltura di 1 mL in ogni pozzo della piastra 24-well. Aggiungere l'anticorpo bloccante nella coltura immediatamente prima dell'aggiunta di thymocytes apoptotici.
3. Coltura della miscela cellulare a 37 ° c per 4 h in un incubatore di colture tissutali fornito con 5% CO₂.
4. Lavare ogni pozzo della coltura con 1x PBS (contenente 500 μM EDTA) due volte per rimuovere le cellule apoptotiche libere galleggianti.
5. In questa fase, macchiare i macrofagi con CD11b-PE legati alla placca.
   1. Lavare i macrofagi a piastre con tampone di colorazione (1x PBS, 1% BSA) una volta.
   2. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE in ciascun pozzetto.
   3. Incubare la piastra a 4 ° c per 20 min.
   4. Lavare ogni pozzetto di piastra tre volte con il tampone di colorazione.
   5. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere con la piastra per l'analisi delle immagini sotto il microscopio fluorescente.
6. In alternativa, staccare i macrofagi legati alla placca aggiungendo 1 mL di lidocaina 1% in PBS e incubando per 10 min a 37 ° c.
7. Scollegare i macrofagi a piastre con il pipettaggio ripetuto.
8. Trasferire la sospensione di macrofage in un singolo tubo FACS a fondo rotondo da 5 mL da ciascun pozzetto della piastra 24-well.
9. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
10. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE (1:200 diluizione nel tampone di colorazione).
11. Incubare la sospensione cellulare nel tampone di colorazione a 4 ° c per 20 min.
12. Lavare due volte la sospensione cellulare con tampone di colorazione.
13. Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione e procedere all'analisi FACS con un citometro a flusso e analizzare la percentuale dei macrofagi di positività CFSE.

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Risultati

Analisi dell'fiamme peritoneale del macrofago mediato di thymocytes apoptotici. I macrofagi peritoneali e le cellule apoptotiche sono state preparate e co-coltivate come descritto nel protocollo. I macrofagi sono stati staccati e macchiati con l'anticorpo anti-CD11b di PE coniugato per 20 minuti sul ghiaccio. I macrofagi sono stati poi lavati ed elaborati in un citometro a flusso. Come si è visto, non esiste un macrofago positivo CFSE nel quadrante in basso a destra quando non sono state aggiunte cellul...

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Discussione

L'apoptosi è un processo di morte cellulare altamente conservato che coinvolge molte cascate di segnale e induce l'espressione proteica, la secrezione e il trasporto. L'apoptosi è spesso associata a cambiamenti della morfologia cellulare¹⁷. Le cellule apoptotiche rilasciano attivamente citochines e chemokine che attraggono i fagociti per migrare al sito e avviare il processo di engulfment, un percorso estremamente complesso sotto stretto controllo¹⁸. Dall'altro lato, la m...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.