Experimentelle Analyse des Apoptotic Thymozyte Engulfment durch Macrophagen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Vorbereitung von apoptotischen Thymozyten und peritonealen Makrophagen vor und analysieren die Effizienz der Eskrozytose und die spezifische hemmungsvermittelte Blockierung apoptotischer Thymozyten-Verengungen. Dieses Protokoll hat eine breite Anwendung in der zellvermittelten Räumung anderer Partikel, einschließlich künstlicher Perlen und Bakterien.

Zusammenfassung

Die Zellapoptose ist ein natürlicher Prozess und spielt eine entscheidende Rolle bei der embryonalen Entwicklung, der homöostatischen Regulierung, der Immuntoleranzinduktion und der Auflösung von Entzündungen. Die Ansammlung von apoptotischen Schutt im Körper kann chronisch entzündliche Reaktionen auslösen, die im Laufe der Zeit zu systemischen Autoimmunerkrankungen führen. Die gestörte Apoptotikzellfreiheit wurde in eine Vielzahl von Autoimmunerkrankungen verwickelt. Die Apoptotikabstände sind ein komplexer Prozess, der selten unter physiologischen Bedingungen entdeckt wird. Es handelt sich um reichlich Oberflächenrezeptoren und Signalmoleküle. Die Untersuchung des Prozesses der apoptotischen Zellfreiheit bietet aufschlussreiche molekulare Mechanismen und anschließende biologische Reaktionen, die zur Entwicklung neuer Therapeutika führen können. Hier beschreiben wir Protokolle zur Induktion von apoptotischen Thymozyten, zur Herstellung von peritonealen Makrophagen und zur Analyse der apoptotischen Zellfreiheit durch Strömungszytometrie und Mikroskopie. Alle Zellen werden sich in einem bestimmten Stadium einer Apoptose unterziehen, und viele Wohn-und Umlaufzellen können apoptotische Trümmer aufnehmen. Daher kann das hier beschriebene Protokoll in vielen Anwendungen verwendet werden, um die apoptotische Zellbindung und-einnahme durch viele andere Zelltypen zu charakterisieren.

Einleitung

Unser Körper erzeugt 1-10 Milliarden apoptotische Zellen täglich. Eine so große Anzahl apoptotischer Zellen muss so geklärt werden, dass die Immunreaktionen ruhig bleiben. Um die rechtzeitige Freigabe von apoptotischen Zellen zu gewährleisten, entwickeln zahlreiche Arten von Gewebezellen und zirkulierenden Zellen Mechanismen, um apoptotische Zellenzu verschlingen. Die Dysfunktionale Regulierung der Apoptose wurde in den Beginn und das Fortschreiten verschiedener entzündlicher Erkrankungen und der Autoimmunität2 in den Körper verwickelt. Die Apoptose spielt auch eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Krebsentwicklung und ihrer anschließenden Resistenz gegen konventionelle Behandlungen^3,4. Das Entfernen von apoptotischen Zellen fördert in der Regel eine entzündungshemmende Reaktion, die mit der immunologischen Toleranz in Verbindung gebracht werden kann 5. Die Störung der apoptotischen Zellfreiheit treibt die Selbstironie voran und trägt zur Entwicklung systemischer Autoimmunerkrankungen sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen bei.

Wenn sich die Zellen einer Apoptose unterziehen, setzen sie das Phosphatidylserin (PtdSer) vom inneren Flugblatt zum äußeren Merkblatt der Membran aus. PtdSer wird dann durch Oberflächenrezeptoren durch Phagozyten erkannt. Mehr als ein Dutzend Rezeptoren wurden identifiziert, um die Verengung von apoptotischen Zellen zu erkennen und zu erleichtern. In der Regel sind mindestens drei Arten von Oberflächenrezeptoren in den apoptotischen Zellabstand involviert: Tethering-Rezeptoren, Apoptotikzellen erkennen; Tickling-Rezeptoren, Auflösung auslösen; Begleitrezeptoren, erleichtern den gesamten^{Prozess 7.} TAM-Rezeptor-Tyrosinkinasen (TAM RTKs) bestehen aus T yro-3, Axl und M er und werdenvor allem durch myeloide Zellen des Immunsystems8 ausgedrückt. Die primäre Funktion von TAM RTKs ist es, als innimmende Rezeptoren zu dienen, was die phagozytische Entfernung von apoptotischen Zellen und Schutt erleichtert. Unsere Fraktion hat seit vielen Jahren die Behandlung von TAM vermittelter apoptotischer Zellfreiheit im Rahmen der Autoimmunität untersucht. Das Vitamin K-abhängige Proteinwachstum verhaftet spezifisches Protein 6 (Gas6) und Protein S (ProS) bindet^undaktiviert TAM-Rezeptoren 9,10^. Gas6 wird im Herzen, in den Nieren und in der Lunge produziert. ProS wird hauptsächlich in der Leber 11^produziert. TAM erkennt die apoptotischen Zellen so, dass das N-Terminal von Gas6/ProS auf einer apoptotischen Zelle an den PtdSer bindet und das C-Terminal von Gas6/ProS an TAM-Rezeptoren bindet, die auf der Oberfläche von Phagozyten verankert sind. Zusammen mit den anderen Rezeptoren erfolgt die Verengung der apoptotischen Zellen 12. Obwohl Mer sowohl an die Liganden ProS als auch Gas6 binden kann, haben wir festgestellt, dass Gas6 der einzige Ligand für die von der Mer-vermittelten Makrophage-Phagozytose^derapoptotischen Zellen zu sein scheint, die durch den Anti-Mer-Antikörper 13 blockiert werden kann. Makrophagen sind professionelle Phagozyten. Die schnelle Räumung von apoptotischen Zellen durch Makrophagen ist wichtig für die Hemmung von Entzündungen und Autoimmunreaktionen gegen intrazelluläre Antigene. Die Mer-Rezeptor-Tyrosinkinase ist entscheidend für die Makrophage-Gravur und die effiziente Räumung der apoptotischen Zellen 14. In der Maus-Milz drückt Mer vor allem auf die Randzone^undgreifbare Körpermakrophagen 13.

Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt eine grundlegende Methode, um die Zellapoptose zu induzieren und Wege aufzuzeigen, wie der Prozess und die Effizienz der Eskrozytose gemessen werden können. Diese Protokolle können leicht angepasst werden, um die Eerozytose durch andere Zelltypen in der Verengung von apoptotischen Zellen unterschiedlicher Herkunft zu untersuchen.

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Protokoll

In unserer Mäusekolonie wurden experimentelle Mäuse gezüchtet und gepflegt. Alle Tierarbeiten wurden nach den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Universität von Cincinnati durchgeführt.

1. Zubereitung von CFSE mit Apoptotic Thymozyten gekennzeichnet

1. Zwei naive C57/B6-Mäuse mit CO₂ -Inhalation für 10 min und Sekt, um die Brusthöhle zu öffnen, entfernen (ziehen) den Thymus mit gekrümmten Feinspitzen-Zangen in die Gewebekultur Petrischale mit 10 ml RPMI1640-Medium.
2. Erhalten Sie eine Einzelzellaufhängung, indem Sie den gesamten Thymus an zwei gefrosteten Enden der Mikroskop-Dias schleifen und dann die Aufhängung durch 100 μm Zellstrainer filtern.
3. Sammeln Sie die 10-mL-Thymianaufhängung in ein 50 mL Rohr und Zentrifuge mit 300 x g für 5 min.
4. Entfernen Sie den Supernatant, erneuern Sie die Zahl der Supernatanten in 40 mL von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.
5. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min und entfernen Sie den Supernatant.
6. Wiederbelebung in 20 mL von 1x PBS in einem 50 mL-Rohr als Einzelzellaufhängung mit bis zu 2 x 10⁸ Zellen (wenn mehr als 2 x 10⁸ Zellen, den Rest der Zellen in weiteren 20 mL von 1 x PBS in einem anderen 50 mL-Rohr wiederbeleben).
7. Machen Sie 5 μM CFSE in gleichem Volumen (20 mL) von 1x PBS in einem separaten 50 mL-Rohr, indem Sie 40 μL CFSE-Lager-Lösung (2,5 mM) in 20 mL von 1x PBS pipettieren und gut vermischen, indem Sie das Rohr 2-3 Mal umkehren.
8. Fügen Sie die 20 mL CFSE von Schritt 1.7 in die 20 mL Zellaufhängung ab Schritt 1.6 (die Endkonzentration von CFSE beträgt jetzt 2,5 μM) hinzu.
   Hinweis: Für jede 20 mL-Zellaufhängung wird eine 20 mL CFSE-Röhre benötigt.
9. Das Zell-und CFSE-Gemischrohr 2-3 Mal umdrehen und das Gemisch im Dunkeln bei Raumtemperatur für maximal 2 Minuten inkubieren, dann die Reaktion stoppen, indem man 10 ml wärmeinaktiviertes Pferdeserum hinzufügt.
10. Zentrifuge das 50 mL Röhrengemisch bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    Hinweis: Wenn die CFSE-Kennzeichnung erfolgreich ist, wird das Zellpellet hellgelb.
11. Entfernen Sie das Supernatant und erneuern Sie das Zellpellet in 40 ml von 1x PBS und zählen Sie die Zellzahlen mit einem Hämozytometer.
12. Die Zellaufhängung auf 300 x g für 5 min zentrifugen und das Supernatant abwerfen.
13. Das Zellpellet wieder mit 40 ml RPMI1640-Medium waschen.
14. Entfernen Sie die Supernatant-und Wiederbelebungszellen mit RPMI1640 Gewebekulturmedium (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (Hitze inaktiviert), 20 mM-Glutamin und 1x Pen/Strep) bei einer Konzentration von 7 x 10⁶ cells/mL in einer 100-mm-Gewebekulturschale.
    Achtung: Wenn mehr Zellen gewonnen werden, wird eine separate 100-mm-Gewebekulturschale benötigt.
15. Mit einer Endkonzentration von 1 μM und einer 4 h igen Kultur bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator, der mit 5% CO₂geliefert wird, fügt man die alteineswörende Kultur in die Zellaufhängung ein.

2. Zubereitung von Peritonealmakrophagen

1. Injektieren Sie zwei C57B6-Mäuse (oder alle genmanipulierten Mäuse im Labor) intraperitoneal mit 1 mL von 3% gealterter Thioglykollekate am Tag 0.
2. Sterbebegleitung der Mäuse bei Tag 5 wie in Schritt 1.1, schneiden und schälen die Bauchhaut, aber lassen Sie das Peritoneum intakt. Spülen Sie die Peritonealhöhle, indem Sie schnell 10 ml Waschpuffer (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) in die Peritonealhöhle mit einer 10 mL-Spritze drücken, die mit einer 18-G-Nadel befestigt ist.
3. Den Waschpuffer langsam mit der gleichen Nadle/Spritze abholen und den Waschpuffer in ein 50 mL-Rohr einsammeln (Details siehe Janssen Laborartikel 15).
4. Waschen Sie die Peritonealgavage zweimal mit 1x PBS, erneuern Sie die peritonealen Makrophagen in RPMI1640 Gewebekulturmedium in einer Dichte von 2 x 10 6 cells/mL und Aliquot 500 μL in jeden Brunnen der 24-Well-Platte. Lassen Sie die Platte in einem Gewebekultur-Inkubator für 2 Stunden.
5. Entfernen Sie die schwimmenden Zellen, indem Sie die schwimmenden Zellen saugen und durch 500 μL frisches Kulturmedium ersetzen, zweimal.
6. Optional wird der TAM-Rezeptor-Tyrosinkemhirus RXDX-106 in den in den Figurenlegenden angegebenen Konzentrationen in jeden Brunnen der Makrophage-Kultur und Inkubat für weitere 2 Stunden eingefügt.

3. Ko-Kultur der peritonealen Makrophagen mit apoptotischen Thymozyten

1. Sammeln Sie apoptotische Thymozyten aus Schritt 1 und waschen Sie dreimal mit RPMI1640-Medium. Die Effizienz der apoptotischen Induktion lässt sich in dieser Phase mit dem Annexin V/7-AAD-Kit messen.
2. Verteilen Sie 0-12 x 10⁶ Zellen (im 500 μL-Medium) in jede StröAnhängschaft der Makrophage-Kulturen aus dem Protokoll #2 entsprechend der Versuchsanordnung (siehe Abbildung 1). Das macht das gesamte Kulturvolumen von 1 mL in jedem Brunnen der 24-Well-Platte aus. Den blockierenden Antikörper unmittelbar vor dem Zusatz von apoptotischen Thymozyten in die Kultur einfügen.
3. Kultur die Zellmischung bei 37 ° C für 4 h in einer Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO₂versorgt.
4. Waschen Sie jeden Brunnen der Kultur mit 1x PBS (mit 500 μM EDTA) zweimal, um die frei schwebenden apoptotischen Zellen zu entfernen.
5. In dieser Phase können Sie die plattengebundenen Makrophagen mit CD11b-PE festigen.
   1. Waschen Sie die plattengebundenen Makrophagen einmal mit dem Färbepuffer (1x PBS, 1% BSA).
   2. Fügen Sie 200 μL Fleckenpuffer hinzu, der 2 μL CD11b-PE enthält.
   3. Die Platte bei 4 ° C 20 min umbauen.
   4. Mit dem Färbepuffer den einzelnen Blechbrunnen dreimal waschen.
   5. Fügen Sie 200 μL Färbepuffer hinzu und fahren Sie die Platte für die Bildanalyse unter dem Leuchtstoffmikroskop fort.
6. Alternativ können Sie die plattengebundenen Makrophagen abtrennen, indem Sie 1 mL mit 1 ml Lidocain in PBS hinzufügen und bei 37 ° C 10 Minuten inkubieren.
7. Plattiert gebundene Makrophagen mit wiederholter Pipettierung lösen.
8. Übertragen Sie die Makrophage-Aufhängung in ein individuelles 5-mL-Rundboden-FACS-Rohr aus jedem Brunnen der 24-well-Platte.
9. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
10. Entfernen Sie das Supernatant und fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu, der 2 μL von CD11b-PE (1:200 Verdünnung im Färbepuffer) enthält.
11. Die Zellaufhängung im Färbepuffer bei 4 ° C 20 min inspucken.
12. Waschen Sie die Zellaufhängung zweimal mit Färbepuffer.
13. Fügen Sie 200 μL Färspuffer hinzu und gehen Sie mit einem Flow-Cytometer zur FACS-Analyse über und analysieren Sie den Anteil der CFSE-Positivitätsmakrophagen.

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Ergebnisse

Analyse der peritonealen makrophage-vermittelten Verengung von apoptotischen Thymozyten. Peritoneale Makrophagen und apoptotische Zellen wurden wie im Protokoll beschrieben vorbereitet und mitkultiviert. Macrophagen wurden abgetrennt und mit PE-konjugierten Anti-CD11b-Antikörper für 20 Minuten auf Eis befleckt. Makrophagen wurden dann gewaschen und in einem Strömungszytometer verarbeitet. Wie man sieht, gibt es kein positives Makrophage in der unteren rechten Seite, wenn keine apoptotischen Zellen in ...

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Diskussion

Apoptose ist ein hochkonservierter Zelltod Prozess, der viele Signalkaskaden mit sich bringt und Proteinausdruck, Sekretion und Transport hervorruft. Die Apoptose wird oft mit den Veränderungen der Zellmorphologie 17 in Verbindung gebracht. Apoptotische Zellen setzen aktiv Zytokine und Chemokine frei, die Phagozyten anziehen, um auf die Website zu migrieren und den Prozess der Enge einzuleiten, ein extrem komplexer Pfad unter strenger Kontrolle¹⁸. Auf der anderen Seite set...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ack lysing buffer	GIBCO	A10492
Annexin V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
Anti-Mer antibody	R&D Systems	BAF591
CD11b-PE (clone M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	Sigma-Aldrich	D-2650
EDTA (0.5 mM)	GIBCO	15575-020
FACS tubes	BD Biosciences	352017
Frosted slides	Fisher Scientific	12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated)	Invitrogen	26050088
Lidocaine	Sigma-Aldrich	L-5647	Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x	Corning	21040CV
RPMI-1640	Corning	10040CV
RXDX-106	Selleck Chemicals	CEP-40783
Staurosprine (100mg)	Fisher Scientific	BP2541-100	Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified	BD Biosciences	243010	Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.