JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولات زراعة رباط اللثة البشري (PDL) كرويرويدالخلية من قبل أفلام شيتوسان. توفر ثقافة الكرويات الخلوية ثلاثية الأبعاد (3D) بديلاً عن نظام ثقافة البوليسترين التقليدي للأنسجة (TCPS).

Abstract

الرباط اللثة (PDL) الخلايا تحمل وعدا كبيرا لتجديد الأنسجة اللثة. تقليديا، يتم زرع خلايا PDL على ركائز ثنائية الأبعاد (2D) مثل الأنسجة المستزرعة البوليستيرين (TCPS). ومع ذلك، لوحظت تغييرات مميزة من خلايا PDL أثناء الثقافة في المختبر. هذه الظاهرة ربما لأن TCPS 2D يختلف عن البيئة الدقيقة ثلاثية الأبعاد (3D) في الجسم الحي. بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة على ركائز 2D، والخلايا المزروعة في بيئة صغيرة 3D تظهر المزيد من أوجه التشابه مع الخلايا الحية. ولذلك، توفر نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد بديلاً واعداً لثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الـ 2D التقليدية. لتحسين نماذج ثقافة الخلايا PDL التقليدية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد، والتي تقوم على تشكيل كروي لخلايا PDL على أفلام الشيتوسان. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة ثقافة كروية الخلية على أساس أفلام شيتوسان. نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد من الكرويات الخلوية PDL التغلب على بعض القيود المتعلقة التقليدية 2D وحيد الطبقة خلية الثقافة، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج خلايا PDL مع فعالية علاجية معززة لتجديد الأنسجة اللثة في المستقبل.

Introduction

يتميز داء اللثة، الذي تهيئته بشكلرئيسي لوحة الأسنان 1، بتلف الأنسجة اللثة بما في ذلك الرباط اللثةي (PDL)، وعظم السنخية، والأسمنت. العلاجات الحالية لداء اللثة عادة ما تكون ناجحة في منع تقدم المرض النشط، ولكن تجديد الأنسجة اللثة المفقودة لا يزال تحديا سريريا. في الآونة الأخيرة، تم إحراز تقدم هام في النهج القائمة على الخلايا لتجديد الأنسجة اللثة للتغلب على عيوب العلاجات الحالية2،3،4.

كشفت مراجعتنا المنهجية السابقة أن خلايا PDL أظهرت إمكانات كبيرة لتجديد اللثة5. تقليديا، يتم زرع خلايا PDL على ركائز ثنائية الأبعاد (2D) مثل الأنسجة المستزرعة البوليستيرين (TCPS). ومع ذلك، لوحظت تغييرات مميزة من خلايا PDL خلال الثقافة في المختبر6. هذه الظاهرة ربما لأن TCPS 2D يختلف عن في الحي 3-الأبعاد (3D) microenvironment7. بالمقارنة مع الخلايا المستزرعة على ركائز 2D، والخلايا التي تزرع في بيئة صغيرة 3D تظهر المزيد من أوجه التشابه إلى الخلايا في الجسم الحي8. ولذلك، توفر نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد بديلاً واعداً لثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الـ 2D التقليدية.

أسلوب الثقافة التقليدية 3D هو تغليف الخلايا في المواد الحيوية 3D. مقارنة مع الخلايا مغلفة في المواد الحيوية 3D، وكروية الخلوية تحاكي الوضع في الجسم الحي بشكل أوثق لأن الكرويدات هي مجاميع من الخلايا التي تنمو خالية من المواد الأجنبية9،10،11، 12. وتفيد التقارير أن الكرويات الخلوية تشجع الأنشطة البيولوجية MSC عن طريق الحفاظ على مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) بما في ذلك الفيبرونيكتين والصفيحين13. لتحسين نماذج ثقافة الخلية PDL التقليدية، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة ثقافة الخلية 3D PDL، والذي يقوم على تشكيل كروي من خلايا PDL على أفلام شيتوسان14. زيادة تشكيل كروي ة تجديد الذات والقدرات التمايز ية العظام من الخلايا PDL14. هنا، نقدم بروتوكولات مفصلة PDL الخلية كروية ثقافة استنادا إلى أفلام شيتوسان. نظام الثقافة ثلاثية الأبعاد من الكرويات الخلوية PDL التغلب على بعض أوجه القصور المتعلقة التقليدية ثقافة خلايا TCPS، وبالتالي قد تكون مناسبة لإنتاج خلايا PDL مع فعالية علاجية معززة لتجديد الأنسجة اللثة في المستقبل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في المدرسة ومستشفى الطب، جامعة تونغجي. وقدم جميع المرضى موافقة خطية مستنيرة.

1. عزل الخلية PDL

  1. جعل الانتشار وسيلة لثقافة خلايا PDL: α-MEM المتوسطة تكمل هاف 10٪ FCS و 100 U / مل القلم / العقدية.
  2. إعداد حاوية مع الثلج لنقل الأضراس الثالثة معزولة.
  3. تعقيم الأدوات الجراحية باستخدام الأوتوكلاف.
  4. استخراج الإنسان الطبيعي أثرت الأضراس الثالثة من البالغين (18-28 سنة من العمر) في عيادة طب الأسنان من المدرسة ومستشفى الطب، جامعة تونغجي.
  5. ضع الأضراس الثالثة في وسط الانتشار ونقلها إلى المختبر عند 4 درجة مئوية.
  6. ضع السن المستخرج في طبق بتري معقم 100 مم، ويعمل داخل غطاء محرك السيارة لتدفق الصفيحات اللامترية.
  7. إضافة 10 مل من PBS لغسل الأسنان المستخرجة. كرر خطوة الغسيل مرتين.
  8. باستخدام مشرط معقم، افصل PDL بلطف عن الجذر.
    ملاحظة: يجب كشط PDL من الجزء الثالث الأوسط من الجذر لتجنب التلوث من أنسجة الجنجة أو القبلي.
  9. فرم PDL إلى شظايا 1-2 ملم مع مساعدة من شفرة مشرط معقمة.
  10. ضع شظايا PDL في قارورة T-25 الثقافية، مليئة بـ 3-4 مل من وسط الانتشار.
  11. ثقافة العينات في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 مع الهواء humidified.
  12. تغيير الوسط الثقافة بعد لوحظ تشجير خلايا PDL. يستغرق عادة 1-2 أسابيع لنمو خلايا PDL. لاحظ نمو خلايا PDL عبر المجهر العكسي للمرحلة المتباينة.
  13. تغيير الوسط الثقافة مرتين في الأسبوع بعد ذلك.
  14. عندما وصلت خلايا PDL إلى التقاء، خلايا الثقافة الفرعية بنسبة 1:4 (مرور 1).
  15. مراقبة نمو الخلايا يوميا وتغيير الوسط الثقافي مرتين في الأسبوع.
  16. أداء كل مرور لاحق في نسبة 1:4 بعد تحقيق الخلايا 80% التقاء. استخدام الجيل الثالث إلى الخامس من خلايا PDL لبذر الخلايا.

2. إعداد أفلام شيتوسان

  1. لإعداد 1٪ (v / v) حل حمض الخليك، إضافة 5 مل من حمض الخليك إلى 495 مل من الماء المقطر المزدوج في كوب الزجاج النظيف.
  2. لإعداد 1٪ ث / الخامس محلول شيتوسان، تزن 5 غرام من مسحوق شيتوسان (متوسط الوزن الجزيئي 400 كدا، 85٪ درجة من الأسيتيل) وإضافة إلى 495 مل من 1٪ (v / v) حل حمض الخليك.
  3. حرك الحل المعد لمدة 24 ساعة مع شريط التحريك ولوحة التحريك المغناطيسي ة على درجة حرارة 60 درجة مئوية.
  4. الأوتوكلاف الحل المعد لضمان حل كامل من شيتوسان.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتاً في هذه المرحلة.
  5. لتشكيل أفلام شيتوسان، إضافة 1٪ ث / الخامس محلول شيتوسان في الأنسجة البوليسترين (TCPS) أطباق في 0.25 مل / سم2. على سبيل المثال، أضف 0.5 مل من محلول الشيتوسان 1% إلى بئر واحد من 24 - لوحة جيدة.
  6. أطباق الـ TCPS الجافة في الفرن عند 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة لتكوين أفلام شيتوسان.
  7. إعداد 0.5 ن هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم). حرك 10 غرام من الـ NaOH، قليلا ً في كل مرة، إلى كمية كبيرة من الماء المقطر المزدوج باستخدام شريط التحريك المغناطيسي، ثم قم بتخفيف المحلول لجعل 0.5 لتر.
    ملاحظة: إضافة الناو إلى الماء--لا تضيف الماء إلى الناوة الصلبة. لا تلمس الناوة! يمكن أن يسبب حروقاً كيميائية
  8. تحييد الأفلام شيتوسان مع 0.5 ن النوت النوت. أضف 0.5 مل من 0.5 ن النوة الحل إلى بئر واحد من 24 جيدا لوحة لمدة 2 ساعة.
  9. غسل أفلام شيتوسان ثلاث مرات مع الماء المقطر المزدوج.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتاً في هذه المرحلة.
  10. قبل البذر الخلية، تعقيم الألواح 24 بئر المغلفة شيتوسان في 70٪ الكحول بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  11. شطف الصفائح المغلفة بتشيتوسان ثلاث مرات مع PBS في درجة حرارة الغرفة.
  12. تعقيم الصفائح المغلفة بتشيتوسان عن طريق العلاج تحت الأشعة فوق البنفسجية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.

3. البذر الخلية

  1. قبل التدفئة انتشار المتوسطة الحل PBS والحل تريبسين / EDTA إلى 37 درجة مئوية.
  2. تخلص من القارورة المنسّبة من قارورة T-75.
  3. غسل خلايا PDL مع 10 مل من الحل PBS.
  4. تجاهل الحل PBS.
  5. إضافة 1 مل من الحل التربسين / EDTA إلى T-75 قارورة ثقافة الخلية.
  6. تحضن الخلايا مع الحل التربسين / EDTA لمدة 3 دقائق في 37 درجة مئوية.
  7. إنهاء عملية الهضم من التربسين عن طريق إضافة 3 مل من انتشار المتوسطة إلى T-75 قارورة ثقافة الخلية.
  8. نقل تعليق الخلية المعدة إلى أنبوب الطرد المركزي مخروطي 15 مل.
  9. جهاز طرد مركزي تعليق لمدة 5 دقائق في 300 x ز ودرجة حرارة الغرفة.
  10. تخلص من الناستانت الفائق من أنبوب الطرد المركزي المخروطي 15 مل وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من وسط الانتشار.
  11. عدد خلايا PDL مع مقياس للهيم.
  12. خلايا بذور PDL في كثافات 0.5x 10 4، 1 x 104،3 x 104،و 6 X 104 خلايا/سم2.
  13. خلايا PDL الثقافة على الأفلام شيتوسان في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 مع الهواء المرطب.
  14. تغيير الوسط الثقافة مرتين في الأسبوع بعد ذلك.
  15. في الأيام 1، 2، 3، 4، و 5، لاحظ مورفولوجيا الخلية يوميا عن طريق المجهر التباين المرحلة معكوس.

4. بقاء الخلية

  1. بعد 1، 3، و 6 أيام من الثقافة، تحديد بقاء الخلايا باستخدام مجموعة قابلة للحياة التجارية/السمية الخلايا.
  2. في أنبوب 15 مل، إعداد 2 مل من محلول جديد من 2 m calcein-AM و 4 m هوموديمر إثييوم في PBS عن طريق دوامة ل5 ق.
    ملاحظة: الاحتفاظ بالعملية في الظلام.
  3. إزالة المتوسطة الثقافة وغسل كروية في PBS.
  4. إنتباردات كروية في من [ببس] يحتوي 2 [م] [كلسين-م] و4 [م] [إتهيديوم] [هومودير] ل 30 [مين] في غرفة درجة حرارة في الظلام.
  5. شطف كروية مرتين في PBS. لكرويرويدس من بئر واحد من لوحة 24 جيدا، واستخدام 2 مل من PBS في كل مرة.
  6. لاحظ العينات باستخدام المجهر الفلورسنت باستخدام 10X أو 20X التكبير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام البروتوكول الحالي، تم تشكيل كرويات خلايا PDL القابلة للحياة بنجاح. ويبين الشكل 1 أن الخلايا المعلقة أو الكروية بدلا ً من الخلايا المرفقة لوحظت أساسا ً في أفلام الشيتوسان. لكثافة البذر من 0.5 X 104 خلايا / سم2، تم العثور على خلايا PDL المرفقة ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وقد أدخلت هذه الدراسة نظام ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتغلب على بعض القيود المتعلقة بثقافة الخلايا الأحادية الطبقة ذات الطبقة 2D التقليدية. وفقا للبروتوكول، تم تشكيل spheroids PDL الخلوية بنجاح من قبل الخلايا زراعة على أفلام الشيتوسان. وأفادت دراستنا السابقة أن تشكيل كروي زاد من قدرات التجد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد رعت هذه الدراسة المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 81700978)، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (1504219050)، ومؤسسة العلوم الطبيعية في شنغهاي (17ZR1432800)، ومشروع شنغهاي للاستكشاف الطبي ( 17411972600).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMGibco11900-073
acetic acid Sigma-Aldrich64197
Cell culture flask 25 cm2Corning430639
Cell culture flask 75 cm2Corning430641
ChitosanHeppe Medical Chitosan GmbH/molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%
FCSGibco26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity KitMolecular ProbesL3224
NaOHSigma-Aldrich1310732
PBSKeyGen Biotech KGB5001
pen/strepGibco15140-122
Trypsin/EDTA KeyGen Biotech KGM25200
15 mL conical centrifuge tubeCorning430790
24-well plateCorning3524

References

  1. Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
  2. Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
  3. Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
  4. Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
  5. Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
  6. Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
  7. Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
  8. Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
  9. Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
  10. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  11. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  12. Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
  13. Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
  14. Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
  15. Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
  16. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
  17. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  18. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357(2016).
  19. Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
  20. Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
  21. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  22. Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
  23. Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
  24. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  25. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
  26. Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

148

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved