Формирование сферонтальных связок человека сфероиды на chitosan Фильмы

Резюме

Здесь мы представляем протоколы культивирования человеческих пародонтальных связок (PDL) клеточных сфероипов по пленкам хитозана. Культура трехмерных (3D) клеточных сфероидов является альтернативой обычной системе культуры тканей (TCPS).

Аннотация

Клетки пародонтальной связки (PDL) имеют большие перспективы для регенерации тканей пародонта. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Тем не менее, характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре. Для улучшения традиционных моделей культуры клеток PDL мы недавно разработали метод 3D-культуры клеток, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана. Здесь мы представляем подробные протоколы клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые ограничения, связанные с обычной 2D монослойной клеточной культуры, и, таким образом, может быть пригодным для производства PDL клеток с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации ткани пародонта.

Введение

Пародонтит, инициализированный главным образом зубной налет¹, характеризуется повреждением пародонтальных тканей, включая пародонтальные связки (PDL), альвеолярной кости и цемента. Текущие методы лечения пародонтита, как правило, успешно предотвращают прогресс активного заболевания, но регенерация потерянных тканей пародонта остается клинической проблемой. В последнее время был достигнут значительный прогресс в клеточных подходах к регенерациитканей пародонта, чтобы преодолеть недостатки текущих методов лечения 2,^3,4.

Наш предыдущий систематический обзор показал, что PDL клетки показали большой потенциал для регенерации пародонта⁵. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Однако характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro⁶. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды⁷. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo^8. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре.

Обычный метод 3D-культуры инкапсулирует клетки в 3D биоматериалах. По сравнению с клетками, инкапсулированными в 3D биоматериалах, клеточные сфероиды более тесно имитируют ситуацию in vivo, потому что сфероиды являются агрегатами клеток, растущих свободными от посторонних материалов^{9,10,11, 12}. Сообщается, что клеточные сфероиды способствовали биоактивности MSC путем сохранения внеклеточных матричных (ECM) компонентов, включая фибронектин и ламинин¹³. Для улучшения обычных моделей культуры клеток PDL, мы недавно разработали метод культуры 3D PDL, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана¹⁴. Сфероидное образование увеличило способность самообновления и остеогенной дифференциации клеток PDL^14. Здесь мы представляем подробные протоколы pdL клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые недостатки, связанные с обычной культурой клеток TCPS, и, таким образом, может быть пригодным для производства клеток PDL с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации тканей пародонта.

протокол

Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике школы и больницы стоматологии Университета Тонджи. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие.

1. Изоляция клеток PDL

1. Сделайте средство распространения для культуры клеток PDL: среда q-MEM дополнена 10% FCS и 100 U/mL пером/strep.
2. Подготовьте контейнер со льдом для передачи изолированных третьих моляров.
3. Стерилизовать хирургические инструменты с помощью автоклава.
4. Извлекайте нормальные людские повлиянные на третьи molars от взрослых (18-28 лет) на зубоврачебной клинике школы и стационара Stomatology, Университет Tongji.
5. Поместите третьи моляры в среду распространения и перенесите в лабораторию при 4 градусах Цельсия.
6. Поместите извлеченный зуб в стерильное 100 мм чашку Петри, работая в биоопасный ламинарный капот потока.
7. Добавьте 10 мл PBS для мытья извлеченного зуба. Повторите шаг стирки дважды.
8. С помощью стерильного скальпеля аккуратно отделите PDL от корня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PDL следует выцарапать из средней третьей части корня, чтобы избежать загрязнения от деснных или акических тканей.
9. Фарш PDL на 1-2-мм фрагменты с помощью стерилизованного лезвия скальпеля.
10. Поместите фрагменты PDL в культурную колбу Т-25, наполненную 3-4 мл среды распространения.
11. Культура образцов в инкубаторе при 37 градусах Цельсия в 5% CO₂ с увлажненным воздухом.
12. Изменение среды культуры после нарастания PDL клеток наблюдается. Это обычно занимает 1-2 недели для роста PDL клеток. Наблюдайте за ростом клеток PDL с помощью обратного фазового контрастного микроскопа.
13. Изменяйте среду культуры два раза в неделю после этого.
14. Когда клетки PDL достигли слияния, субкультурные клетки в соотношении 1:4 (проход 1).
15. Наблюдайте рост клеток ежедневно и меняйте среду культуры два раза в неделю.
16. Выполните каждый последующий проход в соотношении 1:4 после достижения клеток 80% слияния. Используйте клетки PDL от третьего до пятого поколения для посева клеток.

2. Подготовка хитозанов

1. Для приготовления раствора уксусной кислоты 1% (v/v) добавьте 5 мл уксусной кислоты до 495 мл двойной дистиллированной воды в чистый стеклянный стакан.
2. Для приготовления раствора 1% w/v хитозана, взвесьте 5 г порошка хитозана (средний молекулярный вес 400 кДа, 85% степени ацетилирования) и добавьте к 495 мл 1% (v/v) раствор уксусной кислоты.
3. Перемешать готовый раствор в течение 24 часов с перемешиванием бар и магнитной помешивая пластины при 60 градусах Цельсия.
4. Автоклав подготовленное решение для обеспечения полного растворения хитозана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе.
5. Для формирования хитозановых пленок добавьте 1% раствор хитозана в полистирол культуры тканей(TCPS) на 0,25 мл/см 2. Например, добавьте 0,5 мл 1% w/v хитозана раствор атакжем 24-ну.
6. Сухие tCPS блюда в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24 часов, чтобы сформировать пленки хитозана.
7. Подготовка 0,5 N гидроксида натрия (NaOH). Перемешать 10 г NaOH, немного за один раз, в большой объем двойной дистиллированной воды с помощью магнитного перемешать бар, а затем разбавить раствор, чтобы сделать 0,5 л.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить NaOH к воде - не добавляйте воду в твердых NaOH. Не трогайте NaOH! Это может вызвать химические ожоги.
8. Нейтрализовать пленки хитозана с 0,5 N NaOH. Добавьте 0,5 мл 0,5 N NaOH раствор атакжем 24-хорошо пластины в течение 2 часов.
9. Вымойте хитозан пленки три раза с двойной дистиллированной воды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе.
10. Перед посевом клеток, стерилизовать хитозан покрытием 24-колодцы пластины в 70% алкоголя на ночь при комнатной температуре.
11. Промыть хитозан покрытием пластин ы три раза с PBS при комнатной температуре.
12. Стерилизовать плиты с покрытием хитозана путем обработки под ультрафиолетовым светом на ночь при комнатной температуре.

3. Посев ячейки

1. Предварительно теплое средство распространения среднего решения PBS и трипсин /EDTA решение до 37 градусов по Цельсию.
2. Откажитесь от супернатанта из колбы т-75.
3. Вымойте сопливые PDL-клетки раствором PBS.
4. Откажитесь от решения PBS.
5. Добавьте 1 мл раствора трипсина/ЭДТА в колбу т-75.
6. Инкубировать клетки с раствором трипсина/ЭДТА в течение 3 мин при 37 градусах Цельсия.
7. Прекратите процесс пищеварения трипсина, добавив 3 мл пролиферации среднего к Т-75 клеточной культуры колбы.
8. Перенесите подготовленную подвеску ячейки в коническую центрифугу мощностью 15 мл.
9. Centrifuge подвески в течение 5 мин при 300 х г и комнатной температуры.
10. Откажитесь от супернатанта из конической центрифуги 15 мл и повторно приостановите действие клеточной гранулы в 500 л среды распространения.
11. Подсчитайте клетки PDL гемоситометром.
12. Клетки семян PDL при плотности 0,5х 10 4, 1 х 10^4,3 x 10⁴и 6 x 10⁴ клетки/см^2.
13. Культура PDL клеток на пленках хитозана в инкубаторе при 37 градусах По Цельсию в 5% CO₂ с увлажненным воздухом.
14. Изменяйте среду культуры два раза в неделю после этого.
15. В дни 1, 2, 3, 4 и 5, наблюдать морфологию клеток ежедневно через обратный контрастный микроскоп фазы.

4. Выживание клеток

1. После 1, 3 и 6 дней культуры, определить выживание клеток с помощью коммерческой жизнеспособности / цитотоксичности комплект.
2. В трубке 15 мл приготовьте 2 мл свежего раствора 2 мМ кальцийн-АМ и 4 мМ имхидийного омодимера в PBS путем вихря на 5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите процесс в темноте.
3. Удалите среду культуры и мыть сфероиды в PBS.
4. Инкубировать сфероиды в PBS, содержащий 2 мМ кальцийн-АМ и 4 мМ эфидий гомогимер в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
5. Промыть сфероиды дважды в PBS. Для сфероидов из одной скважины из 24-колодца, используйте 2 мл PBS для каждого времени.
6. Наблюдайте за образцами с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью 10x или 20x увеличения.

Результаты

С помощью настоящего протокола успешно сформировались жизнеспособные сфероиды PDL-клеток. Рисунок 1 показал, что подвесные клетки или сфероиды вместо прикрепленных клеток в основном наблюдались на пленках хитозана. Для плотности посева 0,5 х 10⁴ кле...

Обсуждение

Настоящее исследование ввело систему 3D-культуры клеток для преодоления некоторых ограничений, связанных с обычной 2D монослойной клеточной культурой. Согласно протоколу, клеточные сфероиды PDL успешно формировались культивированием клеток на хитозановых пленках. Наше предыдущее иссл?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM	Gibco	11900-073
acetic acid	Sigma-Aldrich	64197
Cell culture flask 25 cm2	Corning	430639
Cell culture flask 75 cm2	Corning	430641
Chitosan	Heppe Medical Chitosan GmbH	/	molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%
FCS	Gibco	26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Molecular Probes	L3224
NaOH	Sigma-Aldrich	1310732
PBS	KeyGen Biotech	KGB5001
pen/strep	Gibco	15140-122
Trypsin/EDTA	KeyGen Biotech	KGM25200
15 mL conical centrifuge tube	Corning	430790
24-well plate	Corning	3524