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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo protocolli di coltura del legamento parontale umano (PDL) sferoidi cellulari da pellicole chitosane. La coltura degli sferoidi cellulari tridimensionali (3D) fornisce un'alternativa al sistema di coltura del polistirolo (TCPS) della coltura dei tessuti convenzionale.

Abstract

Le cellule del legamento parodontale (PDL) sono molto promettenti per la rigenerazione del tessuto parodontale. Convenzionalmente, le cellule PDL sono coltivate su substrati bidimensionali (2D) come il polistirolo di coltura dei tessuti (TCPS). Tuttavia, sono stati osservati cambiamenti caratteristici delle cellule PDL durante la coltura in vitro. Questo fenomeno è probabilmente dovuto al fatto che il TCPS 2D differisce dal microambiente tridimensionale in vivo (3D). Rispetto alle cellule coltivate su substrati 2D, le cellule coltivate in un microambiente 3D presentano maggiori somiglianze con le cellule in vivo. Pertanto, i modelli di coltura cellulare 3D forniscono un'alternativa promettente per la coltura cellulare monostrato 2D convenzionale. Per migliorare i modelli convenzionali di coltura cellulare PDL, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura cellulare 3D, che si basa sulla formazione di sferoidi delle cellule PDL su pellicole chitosane. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di coltura sferoide cellulare basati su pellicole chitosane. Il sistema di coltura 3D degli sferoidi cellulari PDL supera alcune delle limitazioni legate alla coltura convenzionale delle cellule monostrato 2D, e quindi può essere adatto per produrre cellule PDL con una maggiore efficacia terapeutica per la futura rigenerazione dei tessuti parodontali.

Introduzione

La parodontite, inizializzataprincipalmente dalla placca dentale 1, è caratterizzata dal danno dei tessuti parodontali tra cui legamento parontale (PDL), osso alveolar e cementum. Gli attuali trattamenti per la parodontite di solito riescono a prevenire il progresso della malattia attiva, ma la rigenerazione dei tessuti parodontali perduti rimane una sfida clinica. Recentemente, sono stati compiuti importanti progressi negli approcci basati sulle cellule per la rigenerazione del tessuto parodontale per superare gli inconvenienti dei trattamenti attuali2,3,4.

La nostra precedente revisione sistematica ha rivelato che le cellule PDL hanno mostrato un grande potenziale per la rigenerazione parodontale5. Convenzionalmente, le cellule PDL sono coltivate su substrati bidimensionali (2D) come il polistirolo di coltura dei tessuti (TCPS). Tuttavia, sono stati osservati cambiamenti caratteristici delle cellule PDL durante la coltura in vitro6. Questo fenomeno è probabilmente dovuto al fatto che il TCPS 2D differisce dal microambiente tridimensionale in vivo (3D)7. Rispetto alle cellule coltivate su substrati 2D, le cellule coltivate in un microambiente 3D presentano maggiori somiglianze con le cellule in vivo8. Pertanto, i modelli di coltura cellulare 3D forniscono un'alternativa promettente per la coltura cellulare monostrato 2D convenzionale.

Il metodo di coltura 3D convenzionale incapsula le cellule nei biomateriali 3D. Rispetto alle cellule incapsulate in biomateriali 3D, gli sferoidi cellulari imitano più da vicino la situazione in vivo perché gli sferoidi sono aggregati di cellule che crescono libere da materiali estranei9,10,11, 12.Si dice che gli sferoidi cellulari promuovevano le bioattività MSC attraverso la conservazione dei componenti della matrice extracellulare (ECM), tra cui fibronectina e laminina13. Per migliorare i modelli convenzionali di coltura cellulare PDL, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di coltura cellulare PDL 3D, che si basa sulla formazione di sferoidi di cellule PDL su pellicole chitosani14. La formazione di spheroid ha aumentato l'auto-rinnovamento e le capacità di differenziazione osteogenica delle cellule PDL14. Qui, presentiamo protocolli dettagliati di coltura di sferoidi delle cellule PDL basati su pellicole chitosane. Il sistema di coltura 3D degli sferoidi cellulari PDL supera alcune delle carenze legate alla coltura convenzionale delle cellule TCPS, e quindi può essere adatto per produrre cellule PDL con una maggiore efficacia terapeutica per la futura rigenerazione dei tessuti parodontali.

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Protocollo

Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico della Scuola e Ospedale di Stomatologia, Università di Tongji. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Isolamento delle celle PDL

  1. Rendere il mezzo di proliferazione per la coltura delle cellule PDL: mezzo di z-MEM integrato con 10% FCS e 100 U/mL penna/strep.
  2. Preparare un contenitore con ghiaccio per trasferire i terzi molari isolati.
  3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave.
  4. Estrarre il normale impatto umano terzo molare da adulti (18-28 anni di età) presso la Clinica Dentale di Scuola e Ospedale di Stomatologia, Università Tongji.
  5. Collocare i terzi molari nel mezzo di proliferazione e trasferirli in laboratorio a 4 gradi centigradi.
  6. Collocare il dente estratto in un piatto Petri sterile da 100 mm, lavorando all'interno di una cappa a flusso laminare biorischio.
  7. Aggiungere 10 mL di PBS per lavare il dente estratto. Ripetere il passaggio di lavaggio due volte.
  8. Utilizzando un bisturi sterile, separare delicatamente il PDL dalla radice.
    NOTA: PDL deve essere raschiato dalla parte centrale della radice per evitare contaminazioni da tessuti gingival o apicali.
  9. Mitiga PDL in frammenti da 1-2 mm con l'aiuto di una lama del bisturi sterilizzata.
  10. Collocare i frammenti PDL in un flacone di coltura T-25, riempito con 3-4 mL di mezzo di proliferazione.
  11. Coltura i campioni in un'incubatrice a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 con aria umidizzata.
  12. Modificare il mezzo di coltura dopo la disoccupazione delle cellule PDL è stato osservato. Di solito ci vogliono 1-2 settimane per la crescita delle cellule PDL. Osservare la fuoriuscita delle cellule PDL attraverso un microscopio a contrasto di fase inversa.
  13. Cambiare il mezzo di coltura due volte a settimana in seguito.
  14. Quando le cellule PDL hanno raggiunto la confluenza, le cellule sub-colture al rapporto di 1:4 (passaggio 1).
  15. Osservare la crescita cellulare ogni giorno e cambiare il mezzo di coltura due volte alla settimana.
  16. Eseguire ogni passaggio successivo al rapporto di 1:4 dopo che le cellule raggiungono l'80% di confluenza. Utilizzare la terza e la quinta generazione di cellule PDL per il seeding delle cellule.

2. Preparazione di film chitosani

  1. Per la preparazione di una soluzione di acido acetico dell'1% (v/v), aggiungere 5 mL di acido acetico a 495 mL di acqua a doppia distillazione in un becher di vetro pulito.
  2. Per la preparazione della soluzione chitosan w/v, pesare 5 g di polvere chitosan (peso molecolare medio 400 kDa, 85% grado di acetilazione) e aggiungere a 495 mL di 1% (v/v) soluzione acetica.
  3. Mescolare la soluzione preparata per 24 ore con la sbarra e la piastra magnetica a 60 gradi centigradi.
  4. Autoclave la soluzione preparata per garantire la completa dissoluzione del chitosan.
    NOTA: l'esperimento può essere sospeso in questa fase.
  5. Per formare pellicole chitosane, aggiungere 1% w/v soluzione chitosan in piatti di polistirolo coltura dei tessuti (TCPS) a 0,25 mL /cm2. Ad esempio, aggiungere 0,5 mL di 1% w/v chitosan soluzione a un pozzo di 24 –well piastra.
  6. Piatti secchi TCPS in forno a 60 gradi centigradi per 24 ore per formare pellicole chitosane.
  7. Preparare 0,5 N di idrossido di sodio (NaOH). Mescolare 10 g di NaOH, un po 'alla volta, in un grande volume di acqua a doppia distillazione utilizzando la barra di agitazione magnetica, e quindi diluire la soluzione per fare 0,5 L.
    NOTA: Aggiungere NaOH all'acqua --non aggiungere acqua al NaOH solido. Non toccare NaOH! Potrebbe causare ustioni chimiche.
  8. Neutralizzare i film chitosani con 0,5 N NaOH. Aggiungere 0,5 mL di 0,5 N N NaOH soluzione a un pozzo di 24-bene piastra per 2 ore.
  9. Lavare le pellicole chitosane tre volte con acqua a doppia distillazione.
    NOTA: l'esperimento può essere sospeso in questa fase.
  10. Prima della semina cellulare, sterilizzare i piatti rivestiti di chitosan 24 pozzi nel 70% di alcol durante la notte a temperatura ambiente.
  11. Sciacquare le piastre rivestite di chitosano tre volte con PBS a temperatura ambiente.
  12. Sterilizzare le piastre rivestite di chitosano per trattamento sotto luce ultravioletta durante la notte a temperatura ambiente.

3. Semina delle cellule

  1. Soluzione pbS media di proliferazione precalda e soluzione trypsin/EDTA a 37 gradi centigradi.
  2. Eliminare il supernatante dal flacone di coltura cellulare T-75.
  3. Lavare le celle PDL confluenti con 10 mL di soluzione PBS.
  4. Eliminare la soluzione PBS.
  5. Aggiungere 1 mL di soluzione trypsin/EDTA al flacone di coltura cellulare T-75.
  6. Incubare cellule con soluzione trypsin/EDTA per 3 min a 37 gradi centigradi.
  7. Terminare il processo di digestione della trypsin aggiungendo 3 mL di proliferazione medio a T-75 fiaschetta coltura cellulare.
  8. Trasferire la sospensione cellulare preparata in un tubo di centrifuga conica da 15 mL.
  9. Centrifugare la sospensione per 5 min a 300 x g e temperatura ambiente.
  10. Eliminare il supernatante dal tubo di centrifuga conica da 15 mL e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 500 .
  11. Conta le celle PDL con un emocitometro.
  12. Cellule PDL di semi alla densità di 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104e 6 x 104 celle/cm2.
  13. Coltura cellule PDL su pellicole chitosan in un'incubatrice a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 con aria umidificata.
  14. Cambiare il mezzo di coltura due volte a settimana in seguito.
  15. Nei giorni 1, 2, 3, 4 e 5, osservare la morfologia cellulare ogni giorno attraverso un microscopio a contrasto di fase inversa.

4. Sopravvivenza cellulare

  1. Dopo 1, 3 e 6 giorni di coltura, determinare la sopravvivenza delle cellule utilizzando un kit di vitalità/citotossicità commerciale.
  2. In un tubo da 15 mL, preparare 2 mL di una soluzione fresca di 2 mM calcein-AM e 4 mM ethidium homodimer in PBS vortice per 5 s.
    NOTA: Mantenere il processo all'oscuro.
  3. Rimuovere il mezzo di coltura e lavare gli sferoidi in PBS.
  4. Incubare sferoidi in di PBS contenente 2 mM calcein-AM e 4 mM etidium homodimer per 30 min a temperatura ambiente al buio.
  5. Sciacquare sferici due volte in PBS. Per gli sferoidi di un pozzo di 24 pozze, utilizzare 2 mL di PBS per ogni volta.
  6. Osservare i campioni utilizzando un microscopio a fluorescenza utilizzando un ingrandimento 10x o 20x.

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Risultati

Utilizzando l'attuale protocollo, sono stati formati con successo sferoidi cellulari PDL. La figura 1 ha mostrato che le cellule sospese o gli sferoidi invece delle cellule attaccate sono stati osservati principalmente sulle pellicole chitosane. Per la densità di semina di 0,5 x 104 cellule/cm2,le cellule PDL collegate sono state occasionalmente trovate il giorno 1 e 3, e gli sferoidi delle cellule PDL sono stati raramente osservati. Al...

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Discussione

Il presente studio ha introdotto un sistema di coltura cellulare 3D per superare alcune limitazioni legate alla coltura convenzionale delle cellule monostrato 2D. Secondo il protocollo, gli sferoidi cellulari PDL sono stati formati con successo culcolando le cellule sui film chitosani. Il nostro studio precedente ha riferito che la formazione di sferoidi ha aumentato l'auto-rinnovamento e le capacità di differenziazione osteogenica delle cellule PDL14. Invece di utilizzare un enzima per raccoglie...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo studio è stato sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (NSFC 81700978), dai Fondi di Ricerca Fondamentali per le Università Centrali (1504219050), dalla Natural Science Foundation di Shanghai (17-R1432800) e dal Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
α-MEMGibco11900-073
acetic acid Sigma-Aldrich64197
Cell culture flask 25 cm2Corning430639
Cell culture flask 75 cm2Corning430641
ChitosanHeppe Medical Chitosan GmbH/molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%
FCSGibco26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity KitMolecular ProbesL3224
NaOHSigma-Aldrich1310732
PBSKeyGen Biotech KGB5001
pen/strepGibco15140-122
Trypsin/EDTA KeyGen Biotech KGM25200
15 mL conical centrifuge tubeCorning430790
24-well plateCorning3524

Riferimenti

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