היווצרות של חניכיים האדם ברצועה הספרואידים תא על סרטים Chitosan

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים של culturing ברצועה חניכיים האדם (PDL) תא spheroids על ידי סרטים chitosan. תרבות של הספרואידים תלת ממדיים (3D) הסלולר מספק אלטרנטיבה של מערכת התרבות הקונבנציונלית פוליסטירן מרקמת רקמה (TCPS).

Abstract

ברצועה חניכיים (PDL) תאים להחזיק הבטחה גדולה להתחדשות רקמת חניכיים. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה. תופעה זו היא כנראה משום שהדו הדו שונה ממיקרו-vivo תלת-מימדי (3D). בהשוואה לתאים בעלי מצעים דו-ממדיים, תאים שגדלו בתצוגה מיקרוסביבתית תלת-ממדית דומים יותר לתאים vivo. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות התא 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על סרטים chitosan. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות התאית המבוססת על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על חלק מן המגבלות הקשורות תרבות התאים 2D קונבנציונאלי מונאולייר, ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת עבור התחדשות רקמות העתיד חניכיים.

Introduction

חניכיים, מאותחל בעיקר על ידי רובד דנטלי¹, מאופיין בנזק של רקמות חניכיים כולל ברצועה חניכיים (PDL), מכתשיים העצם, ו המלט. הטיפולים הנוכחיים עבור חניכיים מצליחים בדרך כלל במניעת ההתקדמות של המחלה הפעילה, אבל התחדשות של רקמות חניכיים איבד נשאר אתגר קליני. לאחרונה, התקדמות חשובה נעשתה בגישות מבוססות תא עבור התחדשות רקמות חניכיים כדי להתגבר על החסרונות של הטיפולים הנוכחיים^2,3,4.

סקירה שיטתית הקודם שלנו חשף כי תאים PDL הראה פוטנציאל גדול התחדשות חניכיים⁵. באופן מקובל, תאים PDL הם מתורבתים על דו מימדי (2D) מצעים כגון פוליסטירן מעור הרקמה (TCPS). עם זאת, שינויים אופייניים של תאים PDL נצפו במהלך תרבות מבחנה⁶. תופעה זו היא ככל הנראה משום TCPS 2D שונה מן תלת מימדי (3D) מיקרוסביבה⁷. בהשוואה לתאים המתורבתות ב-2D מצעים, תאים הגדלים בתצוגה מיקרוסביבה 3D דומה יותר לתאים vivo⁸. לכן, מודלים של תרבית תאים תלת-ממדיים מספקים חלופה מבטיחה לתרבות התאים הקונבנציונלית של 2D מונאולייר.

שיטת התרבות התלת-ממדית המקובלת היא encapsulating תאים באמצעות ביואריאלס תלת-ממדיים. לעומת תאים שעברו אנקפסולציה ב ביואריאלס 3d, spheroids הסלולר לחקות את המצב vivo באופן הדוק יותר מכיוון spheroids הם אגרגטים של תאים הגדלים ללא חומרים זרים^{9,10,11, 12}. מדווחים כי מכשירי הסלולר הסלולריים קידמו את הפעילות הביויוטית באמצעות שימור הרכיבים המתכלים (ecm), כולל פינבאקטין ולמינציה ב^-13. כדי לשפר את המסורת המקובלת של התרבות התאית, פיתחנו לאחרונה שיטת התרבות של תא PDL 3D, אשר מבוססת על היווצרות ספרואיד של תאים PDL על chitosan סרטים¹⁴. היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים PDL¹⁴. כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים של התרבות PDL מפורט ספרואיד מבוסס על סרטים chitosan. מערכת התרבות התלת-ממדית של PDL תאית הסלולר להתגבר על כמה חסרונות הקשורים בתרבות התא TCPS ובכך עשוי להיות מתאים להפקת תאים PDL עם יעילות טיפולית משופרת להתחדשות רקמת חניכיים עתידיים.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה של בית הספר ובית החולים לרפואת שיניים, אוניברסיטת טונגג'י. כל המטופלים סיפקו הסכמה מושכלת בכתב.

1. בידוד תא PDL

1. להפוך בינונית התפשטות עבור התרבות של תאים PDL: α-הגברת מדיום שיושלם עם 10% FCS ו 100 U/mL עט/דלקת.
2. הכן מכולה עם קרח כדי להעביר טוחנות שלישי מבודדים.
3. לעקר כלי ניתוח באמצעות החיטוי.
4. לחלץ מטוחנות שלישי השפיעו על האדם הרגיל ממבוגרים (18-28 שנים של גיל) במרפאת השיניים של בית הספר ובית החולים לרפואת שיניים, אוניברסיטת טונגג'י.
5. מניחים את הטוחנות השלישי לתוך המדיום ההתפשטות ומעבירים למעבדה ב -4 ° c.
6. מניחים את השן מחולץ בצלחת פטרי 100 מ"מ סטרילי, עובד בתוך מכסה הזרם הביולוגי למינארי.
7. הוסף 10 מ ל של PBS לשטוף את השן מחולץ. חזור על צעד הכביסה פעמיים.
8. באמצעות אזמל סטרילי, הפרד בעדינות את ה-PDL מהשורש.
   הערה: PDL צריך להיות מגורד מהחלק השלישי האמצעי של השורש כדי למנוע זהום של חניכיים או רקמות פסגה.
9. האוהב PDL לתוך 1-2-mm שברי בעזרת להב אזמל מעוקר.
10. מניחים שברי PDL ב T-25 בקבוקון תרבות, מלא 3-4 mL של בינוני התפשטות.
11. תרבות הדגימות בחממה ב-37 ° c ב-5% CO₂ עם מחולל אוויר.
12. לשנות את בינונית התרבות לאחר הצמיחה של תאים PDL נצפתה. זה בדרך כלל לוקח 1-2 שבועות עבור מוצלח של תאים PDL. לראות את הצמיחה של תאים PDL באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות השלב ההופכי.
13. שנה את מדיום התרבות פעמיים בשבוע לאחר מכן.
14. כאשר תאים PDL הגיעו למפגש, תאי תת תרבות ביחס של 1:4 (מעבר 1).
15. צפו בצמיחת התאים מדי יום ושינו את מדיום התרבות פעמיים בשבוע.
16. בצע כל מעבר הבא ביחס של 1:4 לאחר התאים להשיג 80% המפגש. השתמש השלישי לדור החמישי של תאים PDL עבור זריעת תאים.

2. הכנת סרטים chitosan

1. לקראת הכנת 1% (v/v) חומצה אצטית הפתרון, להוסיף 5 מ ל של חומצה אצטית 495 mL של מים כפולים מזוקקים בגביע זכוכית נקייה.
2. לקראת הכנת 1% w/v chitosan הפתרון, שוקל 5 גרם של אבקת chitosan (משקל מולקולרי ממוצע 400 kDa, 85% מידה של מרחלציה) ולהוסיף 495 mL של 1% (v/v) חומצה אצטית תמיסה.
3. מערבבים את הפתרון המוכן 24 שעות עם בר ערבוב ולוחית ערבוב מגנטית ב 60 ° c.
4. אוטוקלב את הפתרון המוכן כדי להבטיח פירוק מוחלט של chitosan.
   הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה.
5. כדי ליצור סרטים chitosan, להוסיף 1% w/v פתרון chitosan לתוך הרקמה התרבותית הרקמות (TCPS) מנות ב 0.25 mL/cm². לדוגמה, להוסיף 0.5 mL של 1% w/v chitosan פתרון אחד טוב של 24-טוב צלחת.
6. מנות TCPS יבשים בתנור ב-60 ° c למשך 24 שעות כדי ליצור סרטים chitosan.
7. הכינו 0.5 N נתרן הידרוקסיד (NaOH). מערבבים 10 גרם של NaOH, קצת בזמן, לתוך נפח גדול של מים כפולים מזוקקים באמצעות מעורר מגנטי בר, ולאחר מכן לדלל את הפתרון לעשות 0.5 L.
   הערה: הוספת NaOH אל המים--לא להוסיף מים NaOH מוצק. לא לגעת NaOH! . זה יכול לגרום לכוויות כימיות
8. לנטרל chitosan סרטים עם 0.5 N NaOH. הוסף 0.5 mL של 0.5 N NaOH פתרון אחד טוב של הצלחת 24-באר עבור 2 שעות.
9. רוחצים סרטים chitosan שלוש פעמים עם מים כפולים מזוקקים.
   הערה: ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה.
10. לפני זריעת תאים, לחטא את הצלחות chitosan מצופה 24-לחות ב-70% אלכוהול לילה בטמפרטורת החדר.
11. שטפו צלחות מצופות chitosan שלוש פעמים עם PBS בטמפרטורת החדר.
12. לחטא צלחות chitosan מצופה על ידי טיפול תחת אור אולטרה סגול לילה בטמפרטורת החדר.

3. זריעת תאים

1. פתרון PBS בינוני מחמם לפני ההפצה וטריפסין/EDTA ל37 ° c.
2. להיפטר סופרנטאנט מתוך בקבוקון תרבות התא T-75.
3. רוחצים תאים PDL שוטפת עם 10 מ ל של פתרון PBS.
4. מחק את פתרון ה-PBS.
5. הוסף 1 מ ל של טריפסין/EDTA פתרון T-75 בקבוקון תרבות התא.
6. מודחלת תאים עם טריפסין/EDTA פתרון עבור 3 דקות ב 37 ° c.
7. לסיים את תהליך העיכול של טריפסין על ידי הוספת 3 מ ל של הפצת בינוני T-75 בקבוקון תרבות התא.
8. העבר את השעיית התא המוכן לשפופרת צנטריפוגה בעלת 15 מ"ל.
9. צנטריפוגה את ההשעיה עבור 5 דקות ב 300 x g וטמפרטורת החדר.
10. להיפטר supernatant מ 15 mL צנטריפוגה שפופרת ו להשעות מחדש את הגלולה התא ב 500 μL של התפשטות בינונית.
11. ספירת תאים PDL עם הומוציטומטר.
12. זרע PDL תאים בצפיפות של 0.5 x 10⁴, 1 x 10⁴, 3 x 10⁴, ו 6 x 10⁴ תאים/cm².
13. תרבות PDL תאים על סרטים chitosan בחממה ב 37 ° c ב 5% CO₂ עם מחולל אוויר.
14. שנה את מדיום התרבות פעמיים בשבוע לאחר מכן.
15. בימים 1, 2, 3, 4, ו -5, בדוק את מורפולוגיה התא מדי יום באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות השלב ההופכי.

4. הישרדות תאים

1. לאחר 1, 3, ו 6 ימים של תרבות, לקבוע את ההישרדות של תאים באמצעות ערכת הכדאיות המסחרית/הרעלת ציטובית.
2. בצינור 15 מ ל, להכין 2 מ ל של פתרון טרי של 2 מ"מ calcein-AM ו 4 מ"מ הומודיום ההומודימר ב-PBS על ידי vortexing עבור 5 s.
   הערה: שמור את התהליך בחושך.
3. להסיר את המדיום תרבות ולשטוף spheroids ב-PBS.
4. מסגרות הספרות של ה-PBS המכילות 2 מ"מ calcein-AM ו 4 מילימטר אתידיום הומודימר עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
5. שטוף את הרורואידים פעמיים ב-PBS. עבור הספרואידים מבאר אחת של 24-באר, השתמש 2 מ ל של PBS עבור כל פעם.
6. צפו בדגימות באמצעות מיקרוסקופ של זריחה באמצעות הגדלה של 10x או 20x.

תוצאות

שימוש בפרוטוקול הנוכחי, מזהי תאים PDL הקיימים בהצלחה נוצרו. איור 1 הראה כי תאים מושעה או spheroids במקום תאים מחוברים נצפו בעיקר על סרטים chitosan. עבור צפיפות הזריעה של 0.5 x 10⁴ תאים/ס"מ², תאים pdl מצורפים נמצאו מדי פעם ביום 1 ו-3, ו-pdl החוליות של התא לא נצפו לעתי?...

Discussion

המחקר הנוכחי הציג מערכת התרבות תא תלת-ממד כדי להתגבר על מספר מגבלות הקשורות לתרבות התא 2D קונבנציונאלי מונאולייר. על פי הפרוטוקול, מזהי הסלולר PDL נוצרו בהצלחה על ידי תאי culturing על סרטים chitosan. המחקר הקודם שלנו דיווח כי היווצרות ספרואיד הגדילה את התחדשות עצמית ויכולות הבידול אוסטגניים של תאים P...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
α-MEM	Gibco	11900-073
acetic acid	Sigma-Aldrich	64197
Cell culture flask 25 cm2	Corning	430639
Cell culture flask 75 cm2	Corning	430641
Chitosan	Heppe Medical Chitosan GmbH	/	molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85%
FCS	Gibco	26140-079
Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit	Molecular Probes	L3224
NaOH	Sigma-Aldrich	1310732
PBS	KeyGen Biotech	KGB5001
pen/strep	Gibco	15140-122
Trypsin/EDTA	KeyGen Biotech	KGM25200
15 mL conical centrifuge tube	Corning	430790
24-well plate	Corning	3524