JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نقدم بروتوكولًا لتوليد بيانات نسخ عالية الجودة وواسعة النطاق لخلايا واحدة من جزر البنكرياس البشرية المعزولة باستخدام تقنية تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية المستندة إلى قطرات.

Abstract

تتكون جزر البنكرياس من خلايا الغدد الصماء ذات أنماط التعبير الهرموني المميزة. تظهر خلايا الغدد الصماء اختلافات وظيفية استجابة للظروف الطبيعية والمرضية. والهدف من هذا البروتوكول هو توليد بيانات عالية الجودة وواسعة النطاق لنسخ كل نوع من خلايا الغدد الصماء باستخدام تكنولوجيا تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية القائمة على قطرات. ويمكن استخدام هذه البيانات لبناء ملف تعريف التعبير الجيني لكل نوع من خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تتطلب العملية معالجة دقيقة، وقياس دقيق، ومراقبة صارمة للجودة. في هذا البروتوكول، نقوم بوصف الخطوات التفصيلية لانفصال جزر البنكرياس البشرية، والتسلسل، وتحليل البيانات. وتبين النتائج التمثيلية لنحو 000 20 خلية من خلايا الISlet البشرية المفردة التطبيق الناجح للبروتوكول.

Introduction

جزر البنكرياس الإفراج عن هرمونات الغدد الصماء لتنظيم مستويات الجلوكوز في الدم. وتشارك خمسة أنواع خلايا الغدد الصماء، والتي تختلف وظيفيا ومورفولوجية، في هذا الدور الأساسي: α-الخلايا تنتج الجلوكاجون، بيتا خلايا الأنسولين، δ-الخلايا somatostatin، PP خلايا البنكرياس الببتيد، والخلايا الغريلين1. تحديد سمات التعبير الجيني هو نهج مفيد لتوصيف خلايا الغدد الصماء في الظروف العادية أو المحددة. تاريخيا، تم إنشاء التنميط التعبير الجيني للعد كله باستخدام microarrayوالجيل التالي RNA تسلسل 2،3،4،5،6،7 , 8.على الرغم من أن النسخ الجزيرة كلها غنية بالمعلومات لتحديد النصوص الخاصة بالأعضاء والجينات مرشح المرض، فإنه يفشل في الكشف عن عدم التجانس الجزيئي لكل نوع من خلايا الجزيرة. تم تطبيق تقنية الالتقاط بالليزر microdissection (LCM) للحصول مباشرة على أنواع محددة من الخلايا منالجزر9و10و11و12 ولكنها لا ترقى إلى نقاء الخلية المستهدفة السكان. للتغلب على هذه القيود، تم استخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلور (FACS) لتحديد مجموعات خلايا الغدد الصماء المحددة، مثل خلايا αوβ13و14و15و16 , 17 سنة , 18-وعلاوة على ذلك، استخدم دوريل وآخرون نهجاً لفرز القوات المسلحة الكونغولية القائم على الأجسام المضادة لتصنيف خلايا بيتا إلى أربع مجموعات فرعية19. يمكن أيضا ً أن تكون خلايا جزيرة FACS التي تم فرزها مطلية بتسلسل الحمض النووي الريبي للخلايا المفردة. ومع ذلك، فإن الأساليب المستندة إلى لوحة تواجه تحديات في قابلية التوسع20،21،22.

لتوليد بيانات عالية الجودة وواسعة النطاق النسخ من كل نوع خلية الغدد الصماء، قمنا بتطبيق تكنولوجيا microfluidic على خلايا الإسداء البشري. منصة microfluidic يولد بيانات النسخ من عدد كبير من الخلايا المفردة في عالية الإنتاجية، عالية الجودة، وطريقة قابلة للتحجيم23،24،25،26،27. بالإضافة إلى الكشف عن الخصائص الجزيئية لنوع الخلية التي تم التقاطها في كمية كبيرة، تمكن منصة microfluidic عالية التحجيم تحديد أنواع الخلايا النادرة عند توفير خلايا كافية. وبالتالي، فإن تطبيق المنصة على جزر البنكرياس البشرية يسمح التنميط من الغريلين إفراز الخلايا، وهو نوع نادر من خلايا الغدد الصماء مع وظيفة معروفة قليلا بسبب ندرة28. في السنوات الأخيرة، تم نشر العديد من الدراسات من قبلنا وغيرها من الإبلاغ عن بيانات النسخ على نطاق واسع من الجزر البشرية باستخدام التكنولوجيا29،30،31،32، 33. وهذه البيانات متاحة للجمهور وموارد مفيدة لمجتمع الislet لدراسة عدم تجانس خلايا الغدد الصماء وآثارها في الأمراض.

هنا، نقوم بوصف بروتوكول تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية القائم على قطرات، والذي تم استخدامه لإنتاج بيانات النسخ من حوالي 20,000 خلية من خلايا الجزر البشرية بما في ذلك α-, β-δ-, PP, الخلايا, ونسبة أصغر من الخلايا غير الغدد الصماء 32-يبدأ سير العمل بالجزر البشرية المعزولة ويصور خطوات انفصال خلايا جزيرة جزيرة، والتقاط خلية واحدة، وتحليل البيانات. ويتطلب البروتوكول استخدام الجزر الصغيرة المعزولة حديثا، ويمكن تطبيقه على الجزر الصغيرة من البشر والأنواع الأخرى، مثل القوارض. باستخدام سير العمل هذا، يمكن بناء أطلس خلية ليستيب غير متحيز وشامل في ظل خطوط الأساس وغيرها من الظروف.

Protocol

1. تفكك الشهيالبشري

  1. الحصول على الجزر البشرية المعزولة من المتبرعين بأعضاء الجثث من أي من الجنسين، الذين تتراوح أعمارهم بين 15-80 سنة، دون أمراض موجودة من قبل ما لم تكن هناك حاجة إلى الجزر من الجهات المانحة ذات التركيبة السكانية المحددة لغرض الدراسة.
    1. بعد العزلة، وأبقى الجزر المعزولة في مرفق زراعة الأنسجة لمدة 2-3 أيام في المورد. غالباً ما يستغرق أكثر من يوم واحد لأضرار الشليس لتصبح مرئية.
    2. ضع الجزر في زجاجة واغمرها بالكامل في وسط جزيرة. أحضرها إلى المختبر عن طريق الشحن ة ليلاً
    3. الحصول على كمية مكافئة للجزيرة (IEQ) من الجزر المشحونة من مورد الجزر.
  2. استرداد الجزر من الشحنة في يوم وصول جزيرة. تنفيذ هذه الخطوة باستخدام غطاء محرك السيارة لتقليل فرصة التلوث.
    1. تبريد الوسائط كاملة islet (CMRL-1066، 10٪ (V / V) FBS، 1X القلم العقدية، 2 MM الجلوتامين) في الثلاجة.
    2. نقل الجزر من الزجاجة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
    3. أضف 10 مل من الوسائط الكاملة المبردة مسبقًا إلى الزجاجة الفارغة لغسل الجزر المتبقية. نقل وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي.
    4. طرد مركزي الأنبوب في 200 × ز لمدة 2 دقيقة لاسترداد الجزر. يستنشق supernatant ترك حوالي 1-2 مل وسائل الإعلام مع بيليه.
    5. إعادة تعليق الجزر مع وسائل الإعلام جزيرة كاملة قبل تبريدها. استناداً إلى IEQ المقدمة من قبل المورد، إضافة 12 مل وسائل الإعلام لكل 5000 IEQ.
    6. صب الجزر في وسائل الإعلام على طبق ثقافة الأنسجة غير المعالجة 10 سم. حضانة بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في الهواء في الغلاف الجوي.
  3. الجزر المنفصلة كما هو موضح أدناه. تنفيذ هذه الخطوة بعد الحضانة بين عشية وضحاها.
    1. قبل الدافئة كاملة الوسائط islet والخلايا حل التفكك.
    2. إعداد 1X PBS التي تحتوي على 0.04٪ BSA في درجة حرارة الغرفة.
    3. عد وانتقاء الجزر 200-300 باستخدام ماصة P200 ونقل الجزر إلى أنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 5 مل قبل تسخين وسائل الإعلام جزيرة كاملة.
    4. جمع الجزر عن طريق الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 2 دقيقة.
    5. إضافة 1.0 مل قبل تسخين الخلايا حل وتعطل بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. حضانة الجزر في 37 درجة مئوية لمدة 9-11 دقيقة. كل 3 دقائق ماصة صعودا وهبوطا ببطء لمدة 10 s لتقسيم الخلايا إلى خلايا واحدة.
    6. مرة واحدة يتم فصل خلايا islet بشكل جيد ويصبح الحل غائما، إضافة 9 مل وسائل الإعلام محطة كاملة وتصفية من خلال مصفاة خلية 30 ميكرومتر في أنبوب مخروطي جديد 15 مل.
    7. غسل أنبوب ومصفاة الخلية مع 2 مل وسائط جزيرة كاملة لجمع الجزر المتبقية وإضافة إلى نفس الأنبوب.
    8. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق.
    9. يستنشق بلطف وسائل الإعلام وإعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل 1X PBS تحتوي على 0.04٪ BSA (PBS-BSA).
    10. تصفية من خلال مصفاة خلية جديدة 30 ميكرومتر في أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق لجمع الخلايا.
    11. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه الخلية في 200-300 درجة مئوية 1X PBS-BSA الحل.
    12. قياس تركيز الخلية وضبط حجم إلى تركيز نهائي من 400-500 خلية / ميكرولتر.

2. خلية واحدة مراقبة الجودة تعليق

  1. تحديد تركيز الخلية باستخدام عداد الخلية الآلي القائم على الفلورة34.
    1. امزج 10 خلايا ميكرولتر مع 0.5 ميكرولتر AO/DAPI. مزيج الماصات جيدا. قم بتحميل 10.5 ميكرولتر على الشريحة وتشغيل اختبار عدد الخلايا لتحديد العدد والجدوى.
    2. تمييع و / أو تصفية تعليق الخلية حسب الضرورة على أساس عدد الخلايا.

3. تقسيم خلية واحدة باستخدام رقاقة microfluidic. اتبع بروتوكول من الشركة المصنعة رقاقة microfluidic35.

  1. جلب 3 'الخرز هلام والنسخ العكسي (RT) الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة (> 30 دقيقة). إعادة تشكيل التمهيدي RT في المخزن المؤقت TE إذا لزم الأمر.
  2. إعداد مزيج RT الرئيسي في أنبوب ربط منخفضة كما هو موضح في الجدول 1.
  3. تحديد عدد الخلايا التي سيتم إدخالها لكل عينة. حساب وحدة تخزين تعليق الخلية (X) اللازمة لتسليم رقم الخلية المستهدفة المطلوب. وسيكون الحجم المحسوب للمياه الخالية من النوكلإلى لإضافتها إلى كل عينة 33.8-X ميكرول.
  4. لتقسيم كل عينة، أضف 33.8-X ميكرول ماء خالي من النوكليس إلى أنبوب شريط PCR سعة 0.2 مل. ثم، إضافة 66.2 درجة مئوية مزيج الرئيسي إلى كل أنبوب الشريط. لا تقم بإضافة الخلايا إلى أنبوب الشريط في هذه المرحلة. ماصة بلطف لخلط. ضع أنابيب الشريط المعدة على الجليد.
  5. ضع رقاقة ميكروفلويديك في علبة رقاقة. توجيه حالة رقاقة ضمان آبار النفط (صف المسمى 3) هي الأقرب إلى الشخص الذي يقوم بالتجربة.
  6. إذا كان تشغيل أقل من 8 عينات، واستخدام 50٪ الجلسرين لملء القنوات غير المستخدمة بالترتيب التالي:
    1. إضافة 90 درجة مئوية من الجلسرين 50٪ في الآبار في الصف 1 لجميع القنوات غير المستخدمة.
    2. إضافة 40 درجة مئوية من الجلسرين 50٪ في الآبار في الصف 2 لجميع القنوات غير المستخدمة.
    3. إضافة 270 درجة مئوية من الجلسرين 50٪ في الآبار في الصف 3 لجميع القنوات غير المستخدمة.
  7. التقط حبات الجل في دوامة. دوامة بأقصى سرعة لمدة 30 ق. اضغط على الشريط على أعلى مقاعد البدلاء عدة مرات لجمع الخرز. تأكد من عدم وجود فقاعات.
  8. إضافة X μL من الخلايا في أنابيب الشريط المعدة. ماصة لخلط 5 مرات. دون التخلص من نصائح ماصة، نقل 90 درجة مئوية من خليط الخلية إلى الصف 1 من رقاقة.
  9. انتظر 30 ثانية، ثم قم بتحميل 40 درجة مئوية من حبات الجل إلى الصف 2. ماصة ببطء شديد لهذه الخطوة. الاستغناء عن 270 درجة مئوية من النفط تقسيم إلى آبار الصف 3.
  10. ربط طوقا رقاقة على علامات التبويب من حامل رقاقة. ضع حامل الشريحة المجمعة في جهاز تقسيم الخلية المفردة واضغط على زر التشغيل.
  11. قم بإزالة حامل الشريحة المجمعة على الفور عند الانتهاء من التشغيل.
  12. إزالة طوقا رقاقة من حامل، وفتح حالة رقاقة في زاوية 45 درجة، وإزالة 100 درجة مئوية من مستحلب من رقاقة في لوحة بلاستيكية زرقاء 96 جيدا.

4. خلية واحدة cDNA تضخيم. اتبع بروتوكول من الشركة المصنعة رقاقة microfluidic35.

  1. النسخ العكسي.
    ملاحظة: تنفيذ هذه الخطوة تحت غطاء محرك السيارة PCR نظيفة فقط لمنع التلوث الميكروبي وغيرها من cDNA غير تضخيم.
    1. ختم لوحة زرقاء 96 جيدا مع ختم احباط على لوحة ساخنة السدادة.
    2. تشغيل رد فعل النسخ العكسي في دورة الحرارية على النحو التالي: 53 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة à 85 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة à 4 درجة مئوية عقد.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن أن تعقد العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  2. تنقية ما بعد RT
    1. جلب الحمض النووي ملزمة الخرز المغناطيسي وحمض نووي حجم اختيار الخرز المغناطيسي إلى درجة حرارة الغرفة ودوامة لإعادة تعليق. عند هذه النقطة، إذابة المخزن المؤقت تنظيف عينة لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية. جلب جميع الكواشف الأخرى إلى درجة حرارة الغرفة ودوامة.
    2. إعداد المخازن المؤقتة كما هو موضح في الجداول 2 والجداول 3.
  3. كيميائيا كسر مستحلب وتنقية.
    1. للقيام بذلك، قم بإزالة ختم احباط بلطف من لوحة.
    2. الاستغناء عن 125 درجة مئوية من الكاشف الوردي كسر مستحلب في كل مستحلب. انتظر لمدة دقيقة واحدة، ثم نقل وحدة التخزين بأكملها إلى أنبوب قطاع 0.2 مل نظيفة. تأكد من وجود طبقة واضحة وطبقة من اللون الوردي في أنبوب الشريط.
    3. إزالة 125 درجة مئوية من الطبقة الوردية من الجزء السفلي من أنبوب الشريط دون إزعاج طبقة واضحة. فمن الطبيعي لوحدة صغيرة (~ 15 درجة مئوية) من الطبقة الوردية أن تبقى في الأنبوب.
    4. إضافة 200 درجة مئوية من مزيج تنظيف من الجدول 2 إلى أنبوب الشريط وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    5. نقل أنبوب الشريط إلى موقف المغناطيسي والسماح للحل لمسح. إزالة supernatant وتجاهل، ثم غسل الخرز مع الإيثانول 80٪ مرتين. السماح للحبات لتجف لمدة 1 دقيقة.
    6. إزالة أنبوب الشريط من المغناطيس وإضافة 35.5 درجة مئوية من محلول elution من الجدول 3 إلى الخرز. ماصة لإعادة تعليق الخرز في الحل. الحضانة لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
    7. نقل أنبوب الشريط إلى موقف المغناطيسي والسماح للحل لمسح. إزالة cDNA تنقية من أنبوب الشريط والاستغناء عنها لتنظيف أنابيب قطاع 0.2 مل.
  4. تضخيم cDNA.
    1. إعداد مزيج التضخيم الرئيسي في الجدول4، أدناه.
    2. إضافة 65 درجة مئوية من cDNA تضخيم ماجستير ميكس إلى كل عينة. ضع أنبوب الشريط في دورة حرارية وتشغيل البرنامج التالي: 98 °C 3 دقيقة à 15 دورات من [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 دقيقة] à 72 °C 5 دقيقة à 4 °C عقد
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن أن تعقد العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.
    3. تنقية cDNA تضخيم مع 0.6x حجم الحمض النووي اختيار الخرز المغناطيسي. يغسل مرتين مع الإيثانول 80٪ وelute مع 40.5 ميكرولتر.
    4. تشغيل cDNA مراقبة الجودة باستخدام الكهربائي هلام الآلي والفلورة القائمة على الحمض النووي الكم اختبار36،37.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن أن تعقد العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو في -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

5- تسلسل بناء المكتبة

  1. التأرّد وتنظيف cDNA38.
    1. تطبيع cDNA إلى 50 نانوغرام في 20 درجة مئوية من الحجم الإجمالي. الكم الدقيق أمر بالغ الأهمية في هذه الخطوة.
    2. جعل مزيج tagmentation في الجدول 5 وaliquot 30 ميكرولتر لكل عينة cDNA 20 ميكرولتر على الجليد. وضع العينات في دورة الحرارية وتشغيل بروتوكول tagmentation: 55 درجة مئوية 5 دقيقة à 10 درجة مئوية عقد.
    3. قم بتنظيف cDNA المُتاغّر باستخدام الأعمدة38. إضافة 180 μL الحمض النووي ربط المخزن المؤقت لكل عينة. نقل 230 ميكرولتر إلى عمود تدور.
    4. الطرد المركزي في 1300 × ز لمدة 2 دقيقة وتجاهل التدفق من خلال.
    5. اغسل مرتين مع 300 ميكرولتر الحمض النووي غسل العازلة. الطرد المركزي 2 دقيقة إضافية في 1300 × ز لضمان إزالة الإيثانول.
    6. Elute تنقية tagmented cDNA عن طريق إضافة 31 درجة مئوية من العازلة elution إلى العمود وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
    7. الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1300 × ز لاسترداد المنتج النقي.
  2. نموذج مؤشر PCR.
    1. اختر الرموز الشريطية التي لا تتداخل أثناء تشغيل تسلسل متعدد.
    2. قم بإجراء مزيج رئيسي لـ PCR فهرس نموذج كما هو موضح في الجدول 6.
    3. إضافة 60 درجة مئوية من عينة مؤشر PCR مزيج رئيسي إلى 30 درجة مئوية من العينة النقية.
    4. إضافة 10 ميكرولتر من فهرس عينة 20 درجة مئوية، 4-oligo إلى كل عينة (مؤشر السجل المستخدم). إجمالي حجم التفاعل هو الآن 100 درجة مئوية.
    5. توضع في دورة حرارية مع تعيين الغطاء إلى 105 درجة مئوية. تشغيل البرنامج التالي: 98 °C 45 s à 12-14 دورات من [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 دقيقة à 4 °C عقد.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة. يمكن أن تعقد العينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة.
  3. تنقية المكتبات مع حبة مزدوجة تنظيف.
    1. إضافة 100 درجة مئوية من حجم الحمض النووي اختيار الخرز المغناطيسي إلى العينة وتخلط جيدا مع ماصة. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    2. نقل إلى المغناطيس والسماح لها الوقوف حتى مسح الحل. إزالة وتجاهل supernatant.
    3. غسل مرتين مع 200 درجة مئوية من الإيثانول 80٪.
    4. تجفيف الخرز على المغناطيس لمدة 2 دقيقة إزالة من المغناطيس وإضافة 50.5 درجة مئوية من EB العازلة إلى بيليه حبة. ماصة لإعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت.
    5. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة نقل إلى المغناطيس والسماح الوقوف لمدة 2 دقيقة. نقل 50 درجة مئوية من عينة eluted إلى أنبوب قطاع نظيفة.
    6. إضافة 40 μL حمض نووي حجم اختيار الخرز المغناطيسي إلى العينة وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نقل إلى المغناطيس والسماح للحل واضحة. إزالة وتجاهل supernatant.
    7. غسل مرتين مع 125 درجة مئوية من الإيثانول 80٪.
    8. تجفيف الخرز على المغناطيس لمدة 2 دقيقة إزالة من المغناطيس وإضافة 60.5 درجة مئوية من EB العازلة إلى بيليه حبة. ماصة لإعادة تعليق الخرز في المخزن المؤقت.
    9. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة نقل إلى المغناطيس والسماح لها الوقوف لمدة 2 دقيقة. نقل 50 درجة مئوية من عينة eluted إلى أنبوب قطاع نظيفة. هذه هي المكتبة النهائية.
    10. عقد عينات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 72 ساعة أو في -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى. لاحظ أن هذه نقطة توقف آمنة.
  4. قياس وتشغيل مراقبة الجودة للمكتبات النهائية باستخدام الكهربائي هلام الآلي والفلورة المستندة إلى الحمض النووي قياس اختبار36،37. تخفيف العينات 1:10 قبل تشغيل مراقبة الجودة.

6 - تسلسل المكتبة

  1. تطبيع كل عينة ليتم تسلسلها إلى 2 نانوغرام / ميكرولتر وتجمع 3 ميكرولتر من كل عينة تطبيع معا.
  2. قياس تركيز تجمع مع الفلورة المستندة إلى الحمض النووي الكم فحص37.
  3. تمييع التجمع إلى 0.25 نانوغرام/ميكرولتر.
  4. تشويه المجمع على النحو التالي: 12 ميكرولتر من عينة مجمعة مخففة (0.25 نانوغرام/ميكرولتر) + 1 ميكرولتر التحكم في الحمض النووي (1 نانومتر)، 2 ميكرولتر EB العازلة + 5 ميكروهيدروكسيد الصوديوم (0.4N). دع هذا الحضانة لمدة 5 دقائق، ثم أضف 10 ميكرولتر من 200 mM Tris pH 8.0.
  5. قم بتحميل 4.05 ميكرولتر إلى 1345.95 ميكرولتر HT1. قم بتحميل 1.3 مل في خرطوشة جهاز التسلسل وتشغيله وفقًا للإرشادات الخاصة بالشركة المصنعة39 باستخدام وصفة تسلسل مع 26 دورة (قراءة 1) + 8 دورات (مؤشر i7) + 0 دورات (i5 Index) + 55 دورة (قراءة 2).

7. محاذاة القراءة (ملف تكميلي 1)

  1. تشغيل "الحارس الخلية" (v2.0.0) إلى demultiplex ملفات استدعاء الأساسية الأولية (BCL) التي تم إنشاؤها بواسطة التسلسل إلى ملفات FASTQ. محاذاة ملفات FASTQ إلى تجميع الجينوم البشري B37.3 ونموذج جين UCSC للحصول على التحديد الكمي للتعبير.
  2. مراقبة جودة المحاذاة.
    1. قم بإنشاء مقاييس المحاذاة وتحقق من قواعد Q30، وكسر الباركود الصحيح، وكسر القراءة المقترن بالخلية، وكسر القراءة المعيّن، والقراءة المكتشفة في كل خلية.
    2. فحص مؤامرة رتبة الباركود للتأكد من فصل الباركود المرتبطة بالخلية والخلفية.

8. تحليل البيانات (ملف تكميلي 2)

  1. مراقبة جودة الخلايا والعملية المسبقة.
    1. استبعاد الخلايا التي تحتوي على < 500 الجينات المكتشفة, < 3000 العدد الإجمالي للمعرّف الجزيئي الفريد (UMI), > 0.2 درجة صلاحية كما سبق وصفها32. ضبط القطع وفقا لأنواع الأنسجة والخلايا.
    2. إزالة doublets.
      1. تقييم الجينات هرمون الغدد الصماء الخمسة (الجلوكاجون - GCG، الأنسولين - INS، سوماتوستاتين - SST، ببتيد البنكرياس - PPY، وغريلين - GHRL)لنمط التعبير ثنائي الوسائط (وضع التعبير العالي والمنخفض) باستخدام R حزمة mclust40.
      2. إزالة الخلايا التي تعبر عن أكثر من جين هرمون واحد، أي مع اثنين أو أكثر من الجينات الهرمونية في وضع التعبير العالي.
    3. تطبيع التعبير الجيني بإجمالي UMI ومضاعفة عامل مقياس 10،000 على مستوى الخلية باستخدام R حزمة سورات41.
    4. إزالة الجينات المكتشفة في أقل من 3 خلايا.
    5. الكشف عن الجينات المتغيرة باستخدام متوسط التعبير وتشتت جميع الخلايا. ضبط القطع وفقا لأنواع الأنسجة والخلايا.
  2. إجراء تحليل المكون الرئيسي مع الجينات المتغيرة. خلايا نظام المجموعة مع العدد المحدد من المكونات الرئيسية. اشتقاق الجينات المخصبة من مجموعة الخلايا عن طريق مقارنة كتلة خلية واحدة مع بقية الخلايا.

النتائج

يتكون سير عمل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية من ثلاث خطوات: فصل الجزر البشرية السليمة إلى تعليق خلية واحدة، والتقاط خلاياواحدة باستخدام تقنية قائمة على قطرات، وتحليل بيانات RNA-seq (الشكل 1). أولاً، تم احتضان الجزر البشرية المكتسبة بين عشية وضحاها. ت?...

Discussion

توفر تقنيات الخلايا الواحدة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة منصة جديدة لتوصيف أنواع الخلايا ودراسة التغاير الجزيئي في جزر البنكرياس البشرية. اعتمدنا بروتوكول عزل الخلايا الواحدة الدقيقة المستندة إلى قطرات صغيرة وتحليل البيانات لدراسة الجزر البشرية. بروتوكولنا أنتج بنجاح الحمض النو?...

Disclosures

جميع المؤلفين هم من الموظفين والمساهمين في شركة Regeneron للمستحضرات الصيدلانية.

Acknowledgements

اي

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

References

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved