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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de células individuales de islotes pancreáticos humanos aislados utilizando una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basada en gotas.

Resumen

Los islotes pancreáticos comprenden células endocrinas con patrones distintivos de expresión hormonal. Las células endocrinas muestran diferencias funcionales en respuesta a condiciones normales y patológicas. El objetivo de este protocolo es generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina con el uso de una tecnología de secuenciación de ARN microfluídico basada en gotas. Estos datos se pueden utilizar para construir el perfil de expresión génica de cada tipo de célula endocrina en condiciones normales o específicas. El proceso requiere un manejo cuidadoso, una medición precisa y un riguroso control de calidad. En este protocolo, describimos pasos detallados para la disociación, secuenciación y análisis de datos de islotes pancreáticos humanos. Los resultados representativos de unas 20.000 células de islet único humano demuestran la aplicación exitosa del protocolo.

Introducción

Los islotes pancreáticos liberan hormonas endocrinas para regular los niveles de glucosa en sangre. Cinco tipos de células endocrinas, que difieren funcional y morfológicamente, están implicados en este papel esencial: las células producen glucagón, insulina de células, somatostatina de células de células PP, polipéptido pancreático de células PP y células de la ghrelina1. La generación de perfiles de expresión génica es un enfoque útil para caracterizar las células endocrinas en condiciones normales o específicas. Históricamente, todo el perfil de expresión génica del islet se generó utilizando microarray y secuenciación de ARN de próxima generación2,3,4,5, 7 , 8. Aunque todo el transcriptoma de islet es informativo para identificar las transcripciones específicas de órganos y los genes candidatos a la enfermedad, no logra descubrir la heterogeneidad molecular de cada tipo de célula de isla. La técnica de microdisección de captura láser (LCM) se haaplicado para obtener directamente tipos de células específicas de los islotes 9,10,11,12, pero se queda corto de pureza de la célula objetivo Población. Para superar estas limitaciones, se ha utilizado la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para seleccionar poblaciones específicas de células endocrinas, como las células13,14,15,16 , 17 , 18. Por otra parte, Dorrell y otros utilizaron un enfoque de clasificación facS basado en anticuerpos para clasificar las células en cuatro subpoblaciones19. Las células de los isletes ordenadas por FACS también se pueden chapar para la secuenciación de ARN de células individuales; sin embargo, los métodos basados en placas se enfrentan a desafíos en escalabilidad20,21,22.

Para generar datos de transcriptoma de alta calidad y a gran escala de cada tipo de célula endocrina, aplicamos tecnología microfluídica a las células de los isletes humanos. La plataforma microfluídica genera datos de transcriptoma a partir de un gran número de células individuales de una manera escalable, de alto rendimiento, alta calidad y escalable23,24,25,26,27. Además de revelar las características moleculares de un tipo de célula capturada en una gran cantidad, la plataforma microfluídica altamente escalable permite la identificación de tipos de células raras cuando se proporcionan suficientes células. Por lo tanto, la aplicación de la plataforma a los islotes pancreáticos humanos permitió perfilar células de ghrelina-secreting, un tipo de célula endocrina rara con función poco conocida debido a su escasez28. En los últimos años, varios estudios han sido publicados por nosotros y otros informando datos de transcriptoma a gran escala de islotes humanos utilizando la tecnología29,30,31,32, 33. Los datos están a disposición del público y recursos útiles para que la comunidad de islote estudie la heterogeneidad de células endocrinas y su implicación en las enfermedades.

Aquí, describimos un protocolo de secuenciación de ARN microfluídico microfluídico basado en gotas, que se ha utilizado para producir datos de transcriptoma de aproximadamente 20.000 células de islos humanos, incluyendo las células de ", ", ", ", ", ", ", "y" y una proporción más pequeña de células no endocrinas 32. El flujo de trabajo comienza con islotes humanos aislados y representa los pasos de disociación de células de islotes, captura de una sola célula y análisis de datos. El protocolo requiere el uso de islotes recién aislados y se puede aplicar a los islotes de los seres humanos y otras especies, como los roedores. Con este flujo de trabajo, se pueden crear atlas de celda de islet imparciales y completos bajo línea base y otras condiciones.

Protocolo

1. Disociación de isla humana

  1. Obtener islotes humanos aislados de donantes de órganos cadáveres de ambos sexos, con edades entre 15 y 80 años, sin enfermedades preexistentes, a menos que se requieran islotes de donantes con datos demográficos específicos para el propósito del estudio.
    1. Después del aislamiento, haga que los islotes aislados se mantengan en la instalación de cultivo de tejidos durante 2-3 días en el proveedor. A menudo se tarda más de 1 día en hacerse visibles los daños en los islos.
    2. Coloque los islotes en una botella y sumerja completamente en el medio del isla. Llevarlo al laboratorio por envío nocturno.
    3. Obtenga la cantidad equivalente de islotes (IEQ) de los islotes enviados del proveedor de islotes.
  2. Recuperar islotes del envío el día de la llegada del islotes. Realice este paso utilizando una capucha para minimizar la posibilidad de contaminación.
    1. Enfriar el medio de isla completo (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-Strep, 2 mM de glutamina) en nevera.
    2. Transfiera los islotes de la botella a un tubo cónico de 50 ml.
    3. Agregue 10 ml de medios de islotes completos preenfriados al frasco vaciado para lavar los islotes restantes. Transfiera el soporte al tubo cónico.
    4. Centrifugar el tubo a 200 x g durante 2 min para recuperar islotes. Aspirar el sobrenadante dejando alrededor de 1-2 mL medios con el pellet.
    5. Resuspenda los islotes con medios de islotes completos preenfriados. Basado en el IEQ proporcionado por el proveedor, agregue 12 ml de medios por 5000 IEQ.
    6. Vierta los islotes en los medios en un plato de cultivo de tejido no tratado de 10 cm. Incubar durante la noche en una incubadora de cultivos tisulares a 37 oC con un 5% deCO2 en el aire atmosférico.
  3. Islotes disociados como se muestra a continuación. Realice este paso después de la incubación durante la noche.
    1. Precalentamiento completo de medios de isla y solución de disociación celular.
    2. Preparar 1pbS que contenga 0,04% de BSA a temperatura ambiente.
    3. Cuente y recoja a mano 200-300 islotes utilizando una pipeta P200 y transfiera los islotes a un tubo cónico de 15 ml que contenga medios de islotes completos precalentados de 5 ml.
    4. Recoger los islotes por centrifugación a 200 x g durante 2 min. Aspirar suavemente el sobrenadante sin perturbar el pellet en la parte inferior.
    5. Añadir 1.0 mL solución de disociación celular precalentada y interrumpir el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Incubar los islotes a 37oC durante 9-11 min. Cada pipeta de 3 minutos hacia arriba y hacia abajo lentamente durante 10 s para disociar las células en células individuales.
    6. Una vez que las células del islet estén bien disociadas y la solución se vuelva turbia, agregue medios de islet completos de 9 ml y filtre a través de un colador de celda de 30 m en un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    7. Lave el tubo y el colador celular con medios de islotes completos de 2 ml para recoger los islotes restantes y agregarlo al mismo tubo.
    8. Recoger las células por centrifugación a 400 x g durante 5 min.
    9. Aspirar suavemente los medios y resuspender el pellet celular en 5 ml 1x PBS que contenga 0,04% de BSA (PBS-BSA).
    10. Filtrar a través de un nuevo colador de células de 30 m en un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 400 x g durante 5 minutos para recoger las células.
    11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 200-300 sl 1x solución PBS-BSA.
    12. Mida la concentración celular y ajuste el volumen a una concentración final de 400-500 células/ L.

2. Control de calidad de la suspensión de una sola célula

  1. Determine la concentración celular utilizando un contador de células automatizado basado en fluorescencia34.
    1. Mezclar células de 10 ml con AO/DAPI de 0,5 ml. Las pipetas se mezclan bien. Cargue 10,5 l en la diapositiva y ejecute el ensayo de recuento de celdas para determinar el recuento y la viabilidad.
    2. Diluir y/o filtrar la suspensión celular según sea necesario en función del recuento de células.

3. Partición de una sola célula utilizando un chip microfluídico. Siga el protocolo del fabricante de chips microfluídicos35.

  1. Lleve 3' perlas de gel y reactivos de transcripción inversa (RT) a temperatura ambiente (>30 min). Reconstituya la imprimación RT en el búfer TE si es necesario.
  2. Prepare la mezcla maestra RT en un tubo de unión baja como se describe en la Tabla1.
  3. Determine el número de celdas que se introducirán para cada muestra. Calcule el volumen de suspensión de celda (X) necesario para entregar el número de celda de destino deseado. El volumen calculado de agua libre de nucleasas para añadir a cada muestra será de 33,8-X de L.
  4. Para que cada muestra se particione, añada agua libre de nucleasas de 33,8-X X en un tubo de tira de PCR de 0,2 ml. A continuación, agregue una mezcla maestra de 66,2 l a cada tubo de tira. No agregue las células al tubo de la tira en este punto. Pipetear suavemente para mezclar. Coloque los tubos de tiras preparados sobre hielo.
  5. Coloque un chip microfluídico en una caja de viruta. Orientar la caja de viruta asegurando que los pozos de aceite (fila etiquetada 3) estén más cerca de la persona que realiza el experimento.
  6. Si ejecuta menos de 8 muestras, utilice 50% de glicerol para rellenar los canales no utilizados en el siguiente orden:
    1. Añadir 90 l de glicerol al 50% de glicerol en los pozos de la fila 1 para todos los canales no utilizados.
    2. Añadir 40 s de 50% de glicerol en los pozos de la fila 2 para todos los canales no utilizados.
    3. Añadir 270 l de glicerol al 50% de glicerol en los pozos de la fila 3 para todos los canales no utilizados.
  7. Enganche las cuentas de gel en un vórtice. Vortex a toda velocidad durante 30 s. Toque la tira en la parte superior del banco varias veces para recoger cuentas. Confirme que no hay burbujas presentes.
  8. Agregue X l de células en los tubos de tiras preparados. Pipeta para mezclar 5 veces. Sin desechar las puntas de la pipeta, transfiera 90 ml de mezcla celular a la fila 1 del chip.
  9. Espere 30 s y, a continuación, cargue 40 s de perlas de gel en la fila 2. Pipetear muy lentamente para este paso. Dispensar 270 l de aceite de partición a los pozos de la fila 3.
  10. Enganche la junta de la viruta a las pestañas del soporte de la viruta. Coloque el soporte de chip montado en el dispositivo de particionamiento de una sola celda y pulse el botón de ejecución.
  11. Retire inmediatamente el soporte de viruta montado al finalizar el funcionamiento.
  12. Retire la junta de la viruta del soporte, abra la caja de la viruta en un ángulo de 45o y retire 100 s de la emulsión del chip en una placa de plástico azul de 96 pocillos.

4. Amplificación de ADNc de una sola célula. Siga el protocolo del fabricante de chips microfluídicos35.

  1. Transcripción inversa.
    NOTA: Realice este paso bajo una capucha limpia sólo pcR para evitar la contaminación microbiana y de otro tipo del ADNC no amplificado.
    1. Selle la placa azul de 96 pocillos con un sello de papel de aluminio en un sellador de placas calentada.
    2. Ejecuta la reacción de transcripción inversa en un ciclor térmico de la siguiente manera: 53oC durante 45 min a 85oC durante una retención de 5 min a 4 oC.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC hasta 72 h.
  2. Purificación post-RT
    1. Lleve las perlas magnéticas de unión a ácido nucleico y las perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico a temperatura ambiente y vórtice para volver a suspender. En este punto, descontese el búfer de limpieza de muestras durante 10 minutos a 65 oC. Lleve todos los demás reactivos a temperatura ambiente y vórtice.
    2. Prepare los buffers tal y como se muestra en de las Tablas 2 y Tablas3.
  3. Romper químicamente la emulsión y purificar.
    1. Para ello, retire suavemente el sello de la lámina de la placa.
    2. Dispensar 125 ml de reactivo de ruptura de emulsión rosa en cada emulsión. Espere 1 min y, a continuación, transfiera todo el volumen a un tubo de tira limpio de 0,2 ml. Asegúrese de que haya una capa de clara y una capa de color rosa en el tubo de la tira.
    3. Retire 125 l de la capa rosa de la parte inferior del tubo de la tira sin perturbar la capa transparente. Es normal que un pequeño volumen (-15 l) de la capa rosa permanezca en el tubo.
    4. Añadir 200 l de mezcla de limpieza de la Tabla 2 al tubo de tira e incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Transfiera el tubo de tira a un soporte magnético y deje que la solución se despeje. Retire el sobrenadante y deseche, luego lave las perlas con 80% de etanol dos veces. Deje que las perlas se sequen durante 1 min.
    6. Retire el tubo de la tira del imán y agregue 35,5 l de solución de elución de la Tabla 3 a las perlas. Pipetear para resuspender las perlas en la solución. Incubar durante 2 min a temperatura ambiente.
    7. Transfiera el tubo de tira a un soporte magnético y deje que la solución se despeje. Retire el ADNc purificado del tubo de tira y dispérdalo para limpiar los tubos de tira de 0,2 ml.
  4. Amplifica rinde el ADNc.
    1. Prepare la mezcla maestra de amplificación en la Tabla4, a continuación.
    2. Añadir 65 s de mezcla maestra de amplificación de ADNc a cada muestra. Colocar el tubo de la tira en un ciclor térmico y ejecutar el siguiente programa: 98 oC 3 min a 15 ciclos de [98 oC 15 s a 67 s 20 s a 72 oC 1 min] a 72 oC 5 minutos a 4 oC de retención
      NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC durante un máximo de 72 h.
    3. Purificar el ADNc amplificado con 0.6x de tamaño de ácido nucleico selección de perlas magnéticas. Lavar dos veces con 80% de etanol y elute con 40,5 l.
    4. Ejecute el cDNA de control de calidad utilizando electroforesis de gel automatizada y el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia36,37.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden sostenerse a 4 oC durante un máximo de 72 h o a -20 oC indefinidamente.

5. Construcción de bibliotecas de secuenciación

  1. Tagmentación y limpieza de cDNA38.
    1. Normalizar el ADNc a 50 ng en 20 s del volumen total. La cuantificación exacta es fundamental en este paso.
    2. Haga la mezcla de etiquetas en la Tabla 5 y la alícuota de 30 l a cada muestra de ADNc de 20 l sobre hielo. Coloque las muestras en el ciclor térmico y ejecute el protocolo de etiquetación: 55 oC 5 min a 10 oC de retención.
    3. Realice la limpieza del ADNes tagmented usando las columnas38. Agregue un búfer de unión de ADN de 180 l a cada muestra. Transfiera 230 l a una columna de giro.
    4. Centrifugar a 1300 x g durante 2 min y desechar el flujo.
    5. Lavar dos veces con un tampón de lavado de ADN de 300 ml. Centrifugar 2 min adicionales a 1300 x g para garantizar la eliminación del etanol.
    6. Eluir elAD tagmentado purificado añadiendo 31 sl de tampón de elución a la columna e incubar a temperatura ambiente durante 2 min.
    7. Centrífuga durante 2 min a 1300 x g para recuperar el producto purificado.
  2. PCR de índice de ejemplo.
    1. Elija códigos de barras que no se superpongan durante una ejecución de secuenciación multiplexada.
    2. Haga una mezcla maestra de PCR de índice de muestra como se muestra en la Tabla6.
    3. Añadir 60 l de mezcla maestra de PCR de índice de muestra a 30 l de la muestra purificada.
    4. Añadir 10 ml de un índice de muestra de 20 m y 4 oligoes a cada muestra (índice de registro utilizado). El volumen total de reacción es ahora de 100 l.
    5. Colocar en un ciclor térmico con la tapa fijada a 105oC. Ejecutar el siguiente programa: 98 oC 45 s a 12-14 ciclos de [98 oC 20 s a 54 s a 72 oC 20 s] a 72 oC 1 min a 4 oC de retención.
      NOTA: Este es un punto de parada seguro. Las muestras pueden aguantar a 4oC hasta 72 h.
  3. Purifique las bibliotecas con doble limpieza de cuentas.
    1. Añadir 100 l de perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico a la muestra y mezclar bien con una pipeta. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
    2. Transfiera a un imán y déjelo reposar hasta que la solución se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.
    3. Lavar dos veces con 200 ml de etanol al 80%.
    4. Secar las perlas en el imán durante 2 min. Retire del imán y agregue 50,5 ml de EB Buffer al pellet de perla. Pipeta para volver a suspender las perlas en el búfer.
    5. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Pasar a un imán y dejar reposar durante 2 min. Transfiera 50 l de muestra eluida a un tubo de tira limpia.
    6. Añadir perlas magnéticas de selección de tamaño de ácido nucleico de 40 l a la muestra e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transfiera a un imán y deje que la solución se despeje. Retire y deseche el sobrenadante.
    7. Lavar dos veces con 125 s l de etanol al 80%.
    8. Secar las perlas en el imán durante 2 min. Retire del imán y agregue 60,5 ml de EB Buffer al pellet de perla. Pipeta para volver a suspender las perlas en el búfer.
    9. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. Transferir a un imán y dejar reposar durante 2 min. Transfiera 50 l de muestra eluida a un tubo de tira limpia. Esta es la biblioteca final.
    10. Sostenga las muestras a 4 oC durante un máximo de 72 h o a -20 oC indefinidamente. Tenga en cuenta que este es un punto de parada seguro.
  4. Cuantifique y ejecute el control de calidad de las bibliotecas finales utilizando electroforesis de gel automatizada y el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia36,37. Diluir las muestras 1:10 antes de ejecutar el control de calidad.

6. Secuenciación de bibliotecas

  1. Normalizar cada muestra a secuenciar a 2 ng/L y agrupación de 3 l de cada muestra normalizada juntas.
  2. Mida la concentración de la piscina con el ensayo de cuantificación de ADN basado en fluorescencia37.
  3. Diluir la piscina a 0,25 ng/L.
  4. Desnaturalizar la piscina de la siguiente manera: 12 l de muestra agrupada diluida (0,25 ng/L) + 1 l de control de ADN (1 nM), 2 l de búfer EB + 5 l de NaOH (0,4 N). Dejar que esta incubación durante 5 min, luego añadir 10 sL de 200 mM Tris pH 8.0.
  5. Cargue 4,05 s en 1345,95 ht1. Cargue 1,3 ml en el cartucho del secuenciador y ejecute de acuerdo con las directrices del fabricante39 utilizando una receta de secuenciación con 26 ciclos (Lectura 1) + 8 ciclos (i7 Index) + 0 ciclos (i5 Index) + 55 ciclos (Lectura 2).

7. Alineación de lectura (Archivo suplementario 1)

  1. Ejecute Cell Ranger (v2.0.0) para demultiplexar archivos de llamada base sin procesar (BCL) generados por la secuenciación en archivos FASTQ. Alinee los archivos FASTQ con el ensamblaje humano del genoma B37.3 y el modelo de gen UCSC para obtener la cuantificación de la expresión.
  2. Control de calidad de alineación.
    1. Genere métricas de alineación y compruebe las bases Q30, la fracción de código de barras válida, la fracción de lectura asociada a la celda, la fracción de lectura asignada y las lecturas detectadas en cada celda.
    2. Examine la gráfica de clasificación del código de barras para asegurarse de que la separación de los códigos de barras asociados a la celda y el fondo.

8. Análisis de datos (Archivo Suplementario 2)

  1. Control de calidad celular y preproceso.
    1. Excluya las células con < 500 genes detectados, < 3000 número total de identificador molecular único (UMI), > 0,2 puntuación de viabilidad como se describió anteriormente32. Ajuste los cortes de acuerdo con los tipos de tejido y células.
    2. Retire los dobletes.
      1. Evaluar los cinco genes de la hormona endocrina (glucagón - GCG, insulina - INS, somatostatina - SST, polipéptido pancreático - PPYy ghrelina - GHRL) para el patrón de expresión bimodal (modo de alta y baja expresión) utilizando R paquete mclust40.
      2. Retire las células que expresan más de un gen hormonal, es decir, con dos o más genes hormonales en el modo de alta expresión.
    3. Normalizar la expresión génica por el UMI total y multiplicar por el factor de escala de 10.000 a nivel celular utilizando el paquete R Seurat41.
    4. Eliminar genes detectados en menos de 3 células.
    5. Detectar genes variables utilizando la expresión media y la dispersión de todas las células. Ajuste los cortes de acuerdo con los tipos de tejido y células.
  2. Realice el análisis del componente principal con los genes variables. Clúster de celdas con el número seleccionado de componentes principales. Derivar genes enriquecidos de cúmulo de células comparando un cúmulo de células con el resto de las células.

Resultados

El flujo de trabajo de secuenciación de ARN de una sola célula consta de tres pasos: disociar islotes humanos intactos en suspensión de una sola célula, capturar células individuales utilizando una tecnología basada en gotas y analizar datos de ARN-seq (Figura1). En primer lugar, los islotes humanos adquiridos fueron incubados de la noche a la mañana. Los islotes intactos se examinaron bajo el microscopio (Figura2A). La in...

Discusión

Las tecnologías de una sola célula desarrolladas en los últimos años proporcionan una nueva plataforma para caracterizar los tipos celulares y estudiar la heterogeneidad molecular en islotes pancreáticos humanos. Adoptamos un protocolo de aislamiento microfluídico de una sola célula basado en gotas y análisis de datos para estudiar islotes humanos. Nuestro protocolo produjo con éxito datos de secuenciación de ARN de más de 20.000 células de islotes humanos individuales con variaciones relativamente pequeñas ...

Divulgaciones

Todos los autores son empleados y accionistas de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.

Agradecimientos

Ninguno

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

Referencias

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