Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לייצר באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של נתונים הטרנססקריפט של תאים בודדים מבודדים איונים הלבלב האנושי באמצעות droplet-מבוססי microfluidic בודד מיקרופלוג של תא RNA רצף הטכנולוגיה.

Abstract

איונים הלבלב מהווים תאים אנדוקריניים עם דפוסי ביטוי הורמונים ייחודיים. התאים האנדוקריניים מציגים הבדלים פונקציונליים בתגובה לתנאים נורמליים ופתולוגיים. המטרה של פרוטוקול זה היא להפיק נתונים באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול של כל סוג תא האנדוקרינית עם שימוש של מיקרופלואידיc מבוססי-droplet המבוססת על טכנולוגיית הרצף RNA של תא יחיד. נתונים אלה יכולים להיות מנוצל כדי לבנות את הפרופיל ביטוי גנים של כל סוג תא האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. התהליך דורש טיפול זהיר, מדידה מדויקת ובקרת איכות קפדנית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים מפורטים עבור האדם הלבלב, ברצף וניתוח נתונים. תוצאות הנציג של כ 20,000 האדם תאים איון יחיד להפגין את היישום המוצלח של הפרוטוקול.

Introduction

איולי הלבלב לשחרר הורמונים אנדוקרינית לווסת את רמות הגלוקוז בדם. חמישה סוגי תאים אנדוקרינית, אשר שונים מבחינה פונקציונלית מורפולוגית, מעורבים תפקיד חיוני זה: α-תאים לייצר glucagon, β-תאים אינסולין, δ-תאים סוסטטין, PP תאים הלבלב polypeptide, ו ε-תאים גרלין1. ביטוי גנטי פרופיל הוא גישה שימושית כדי לאפיין את התאים האנדוקרינית בתנאים נורמליים או ספציפיים. היסטורית, כל ביטוי גנים איון פרופיל נוצר באמצעות microarray הדור הבא RNA רצף2,3,4,5,6,7 , 8. למרות איון שלם ההמרה הוא אינפורמטיבי כדי לזהות את האיבר הספציפי האיברים המועמדים גנים המועמד, זה לא מצליח לחשוף את טרוגניות המולקולרי של כל סוג תא איון. לכידת לייזר מיקרודיסקציה (lcm) טכניקה הוחל ישירות להשיג סוגי תאים ספציפיים מ איי9,10,11,12 אבל נופל קצר של טוהר התא ממוקד אוכלוסייה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, מיון תאים פלואורסצנטית המופעל (facs) נעשה שימוש כדי לבחור אוכלוסיות מסוימות של תאים אנדוקריניים, כגון α-ו β-תאים13,14,15,16 , מיכל בן 17 , 18. יתר על כן, dorrell ואח ' השתמשו בגישה המבוססת על נוגדן מיון facs לסווג β תאים לארבע אוכלוסיות משנה19. FACS-מיון תאים איון יכול גם להיות מצופה עבור רצפי RNA של תאים בודדים; עם זאת, השיטות המבוססות על הצלחת מתמודדות עם אתגרים במדרגיות20,21,22.

כדי להפיק באיכות גבוהה, בקנה מידה גדול נתונים הטרנססקריפט של כל סוג תא האנדוקרינית, אנו להחיל את הטכנולוגיה microfluidic לתאי איון האדם. פלטפורמת microflu, c מייצרת נתונים משני מספר גדול של תאים בודדים בתפוקה גבוהה, באיכות גבוהה ובצורה מדרגית,23,24,25,26,27. בנוסף חשיפת המאפיינים המולקולריים של סוג תא שנלכד בכמות גדולה, פלטפורמת microflu, מדרגיים במיוחד מאפשר זיהוי של סוגי תאים נדירים כאשר מספיק תאים מסופקים. מכאן, יישום של הפלטפורמה לאיונים הלבלב האנושי מותר על הפרופיל של ghrelin-הפרשה ε-תאים, סוג תא האנדוקרינית נדיר עם מעט הידוע בגלל המחסור שלה28. בשנים האחרונות, מספר מחקרים פורסמו על ידינו ואחרים מדווחים על נתונים בקנה מידה גדול של האיים האנושיים באמצעות טכנולוגיה29,30,31,32, 33. הנתונים הם זמינים לציבור משאבים שימושיים עבור הקהילה איון לחקור טרוגניות התא האנדוקרינית ואת המשתמע שלה במחלות.

כאן, אנו מתארים droplet-מבוססי מיקרופלואידיג המבוסס על פרוטוקול RNA, אשר שימש להפקת נתונים transcript של כ 20,000 תאים איון האדם כולל α-, β-, δ-, PP, ε-תאים, ושיעור קטן יותר של תאים שאינם אנדוקריניים 32. זרימת העבודה מתחיל עם איונים אנושיים בודדים ומתאר צעדים של דיסוציאציה תא איון, לכידת תא יחיד, ניתוח נתונים. הפרוטוקול דורש שימוש באיונים מבודדים טריים וניתן להחילם על איונים של בני אדם ומינים אחרים, כגון מכרסמים. באמצעות זרימת עבודה זו, משוחדת ואת האטלס התא המקיף איון תחת הבסיסית ותנאים אחרים ניתן לבנות.

Protocol

1. לדיסוציאציה של איון האדם

  1. השג איונים אנושיים מבודדים מתורמים איברים של גוויות של שני המין, הגילאים בין 15-80 שנים, ללא מחלות טרום קיימים, אלא אם כן האיים מתורמים עם דמוגרפיה ספציפית נדרשים למטרת המחקר.
    1. לאחר בידוד, יש איונים מבודדים שנשמרו במתקן תרבות הרקמה במשך 2-3 ימים על הספק. לעתים קרובות לוקח יותר מיום אחד נזקים איון להיות גלוי.
    2. מניחים את איונים בבקבוק לטבול אותו לחלוטין במדיום איון. . קח את זה למעבדה במשלוח לילה
    3. להשיג את הכמות המקבילה איון (IEQ) של האיים הנשלחים מן הספק איון.
  2. לשחזר איים מהמשלוח ביום ההגעה איון. לבצע צעד זה באמצעות ברדס כדי למזער את הסיכוי לזיהום.
    1. מגניב מדיה איון שלם (CMRL-1066, 10% (v/v) FBS, 1x Pen-דלקת, 2 מ"מ גלוטמין) במקרר.
    2. להעביר את האיים מן הבקבוק לשפופרת חרוט 50 mL.
    3. הוסף 10 מ"ל מקורר להשלים מדיה איון מלאה לבקבוק התרוקן כדי לשטוף את האיים הנותרים. העבר את המדיה לשפופרת החרוט.
    4. צנטריפוגה את הצינור ב 200 x g עבור 2 דקות כדי לשחזר איונים. מותיר את הסופרנטנט עוזב. בערך 1-2 mL עם הגלולה
    5. להשעות את איונים עם מדיות מראש מקורר להשלים מדיה. מבוסס על IEQ שסופקו על ידי הספק, להוסיף 12 מדיה mL לכל 5000 IEQ.
    6. יוצקים את איונים בתקשורת על מאכל 10 ס מ שאינו מטופל רקמת רקמה. מודטת לילה בחממה לתרבות רקמות ב 37 ° c עם 5% CO2 באוויר אטמוספרי.
  3. האיים הללו כמוצג להלן. בצע שלב זה לאחר הדגירה של הלילה.
    1. טרום חמים מדיה איון מלאה ופתרון דיסוציאציה של תאים.
    2. הכינו 1x PBS המכיל 0.04% BSA בטמפרטורת החדר.
    3. לספור וביד לבחור 200-300 איונים באמצעות מP200 הצינורות ולהעביר את איונים ל 15 מ"ל שפופרת חרוטי המכיל 5 מ ל להשלים מדיית איון מלאה.
    4. לאסוף את איונים על ידי צנטריפוגה ב 200 x g עבור 2 דקות. בעדינות מחלק את הסופרנטאנט. בלי להפריע לגלולה בתחתית
    5. הוסף 1.0 mL לפני החמם הפתרון הדיסוציאציה הנייד ולשבש את הגלולה על ידי ליטוף בעדינות למעלה ולמטה. מודקון את איונים ב 37 ° צ' עבור 9-11 דקות. כל 3 דקות מעלה ומטה לאט במשך 10 s כדי לנתק את התאים לתוך תאים בודדים.
    6. לאחר תאים איון הם הנתק הפתרון הופך מעונן, להוסיף 9 מ"ל מדיה איון להשלים ולסנן דרך מסננת תא 30 יקרומטר לתוך צינור חדש 15 mL.
    7. לשטוף את הצינור מסננת תא עם 2 מ"ל מדיה להשלים איון לאסוף את איונים שנותרו ולהוסיף לאותו צינור.
    8. לאסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות.
    9. בעדינות לאספירין מדיה ולהשעות מחדש את הגלולה תא ב 5 מ"ל 1x PBS המכיל 0.04% BSA (PBS-BSA).
    10. לסנן דרך מסננת חדש 30 יקרומטר תא לתוך שפופרת 15 mL ו צנטריפוגה ב 400 x g עבור 5 דקות לאסוף תאים.
    11. מריף את הסופרנטאנט ומשהה מחדש את הגלולה הסלולרית בתמיסה 200-300 μL 1x PBS-BSA.
    12. למדוד את ריכוז התא ולהתאים את עוצמת הקול לריכוז הסופי של 400-500 תאים/μL.

2. בקרת איכות של תא בודד

  1. קבע את ריכוז התא באמצעות מונה תאים מבוססי-פלואורסצנטית אוטומטי34.
    1. מערבבים 10 μL תאים עם 0.5 μL AO/DAPI. הפיפטה מתערבב ביסודיות. טען 10.5 μL אל השקופית והפעל את שיטת ספירת התאים כדי לקבוע ספירה ויכולת קיום.
    2. דלל ו/או סנן את השעיית התא בהתאם לצורך בהתאם לספירת התאים.

3. תא יחיד לחלוקה באמצעות שבב מיקרופלואידיג. בצע את הפרוטוקול מיצרן שבב microfluidic35.

  1. מביאים 3 ' מחרוזות ג'ל ותמלול הפוכה (RT) ריאגנטים לטמפרטורת החדר (> 30 דקות). במידת הצורך, יש ליצור מחדש את התחל במאגר ה-TE.
  2. הכינו את התמהיל הראשי של RT בשפופרת מאוגד נמוכה כפי שמתואר בטבלה 1.
  3. קבע את מספר התאים שיש להזין עבור כל דוגמה. לחשב את עוצמת ההשעיה של התא (X) הדרוש כדי לספק את מספר התא היעד הרצוי. הנפח המחושב של מים חינם nuclease להוסיף לכל מדגם יהיה 33.8-X μL.
  4. עבור כל דוגמה להיות מחולק למחיצות, הוסף 33.8-X μL nuclease-מים חינם לתוך שפופרת הרצועה 0.2 mL PCR. לאחר מכן, להוסיף 66.2 μL לערבב מאסטר לכל צינור רצועה. אל תוסיף את התאים לצינור החשפנות בשלב זה. . פיפטה בעדינות כדי לערבב מניחים את צינורות החשפנות המוכנים על הקרח.
  5. מניחים שבב מיקרופלואידיסי. לתוך קופסת שבבים האוריינט מארז השבב להבטחת בארות הנפט (שורה מתויג 3) הם הקרובים ביותר לאדם ביצוע הניסוי.
  6. אם הפעלת פחות מ-8 דגימות, השתמש ב-50% גליצרול כדי למלא ערוצים שאינם בשימוש בסדר הבא:
    1. הוסף 90 μL של 50% גליצרול לתוך הבארות בשורה 1 עבור כל הערוצים שאינם בשימוש.
    2. הוסף 40 μL של 50% גליצרול לתוך הבארות בשורה 2 עבור כל הערוצים שאינם בשימוש.
    3. הוסף 270 μL של 50% גליצרול לבארות בשורה 3 עבור כל הערוצים שאינם בשימוש.
  7. . הצמד את חרוזי ג'ל למערבולת מערבולת במהירות מלאה עבור 30 s. הקש על רצועת העליון ספסל מספר פעמים כדי לאסוף חרוזים. ודא כי אין בועות מתנה.
  8. הוסף X μL של תאים לתוך צינורות הסטריפ המוכנים. . פיפטה לערבב 5 פעמים מבלי להשליך את הפיפטה טיפים, להעביר 90 μL של תערובת התא לשורה 1 של השבב.
  9. לחכות 30 s, ואז לטעון 40 μL של חרוזי ג'ל לשורה 2. . הפיפטה לאט מאוד לשלב הזה לחלק 270 μL של מחיצות שמן לבארות של שורה 3.
  10. הוק את gasket השבב על הכרטיסיות של מחזיק השבב. הצב את מחזיק השבב התאספו לתוך המכשיר המחיצות תא יחיד ולחץ על לחצן הפעלה.
  11. הסר מיד את מחזיק השבב בעת השלמת ההפעלה.
  12. הסר את gasket שבב מן המחזיק, לפתוח את המארז שבב בזווית 45 °, ולהסיר 100 μL של אמולסיה מן השבב לתוך פלסטיק כחול 96 בצלחת.

4. תא יחיד הגברה cDNA. בצע את הפרוטוקול מיצרן שבב microfluidic35.

  1. . תעתיק הפוך
    הערה: בצע שלב זה תחת מכסה המנוע הנקי של ה-PCR בלבד, כדי למנוע מחיידקים וזיהומים אחרים של cDNA הבלתי מוגבר.
    1. חותם את הצלחת 96-ובכן כחול עם חותם לסכל על חותם צלחת מחומם.
    2. הפעל את תגובת התמלול הפוכה בציקלונט תרמית כדלקמן: 53 ° צ' עבור 45 דקות à 85 ° צ' עבור 5 דקות à 4 ° c להחזיק.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה. ניתן להחזיק דגימות ב-4 ° צ' עד 72 h.
  2. טיהור פוסט-RT
    1. להביא את חומצת גרעין מחייב חרוזים מגנטיים וחומצות גרעין גודל בחירה חרוזים מגנטיים לטמפרטורת החדר מערבולת כדי להשעות מחדש. בשלב זה, הפשרת מאגר ניקוי המדגם במשך 10 דקות ב-65 ° c. הביאו את כל הריאגנטים לטמפרטורת חדר ומערבולת.
    2. הכן את המאגרים כפי שמוצג בטבלאות 2 ובטבלאות 3.
  3. כימית לשבור את אמולסיה ולטהר.
    1. כדי לעשות זאת, להסיר בעדינות את החותם הנייר מלוחית.
    2. לחלק 125 μL של אמולסיה ורודה-שבירת מגיב לכל אמולסיה. המתן 1 דקות, ולאחר מכן להעביר את כל אמצעי האחסון לצינור נקי 0.2 mL. ודא שיש שכבה של ברור ושכבה של ורוד בצינור הרצועה.
    3. הסר 125 μL של השכבה הורודה מהחלק התחתון של שפופרת הרצועה מבלי להפריע לשכבה ברורה. זה נורמלי עבור נפח קטן (~ 15 μL) של השכבה הוורודה להישאר בתוך הצינור.
    4. הוסף 200 μL של שילוב ניקוי מטבלה 2 לצינור הרצועה והדגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
    5. העבר את צינורית הרצועה למעמד מגנטי ואפשר לפתרון להתבהר. הסר את supernatant ולמחוק, ואז לשטוף את החרוזים עם 80% אתנול פעמיים. הניחו לחרוזים להתייבש במשך 1 דקות.
    6. להסיר את שפופרת הרצועה מן המגנט ולהוסיף 35.5 μL של פתרון הימנעות מלוח 3 את החרוזים. פיפטה להשהות את החרוזים בתמיסה. דגירה עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר.
    7. העבר את צינורית הרצועה למעמד מגנטי ואפשר לפתרון להתבהר. הסר את cDNA מטוהרים מצינור הסטריפ ולחלק אותו לנקות 0.2 mL צינורות הרצועה.
  4. . להגביר את הדנ א
    1. להכין מיקס מאסטר הגברה בטבלה 4, להלן.
    2. הוסף 65 μL של cDNA הגברה מיקס בסיס לכל מדגם. הציבו את צינור החשפנות בציקלונט תרמי והפעל את התוכנית הבאה: 98 ° צ' 3 דקות à 15 מחזורים של [98 ° צ' ו 15 s à 67 ° צלזיוס של 72 20 ° c מעלות צלזיוס 1 דקות] à 72 ° c, 5 דקות à 4 מעלות צלזיוס
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה. הדגימות יכולות להכיל 4 ° c עד 72 h.
    3. לטהר את cDNA מוגבר עם 0.6 x חומצות גרעין בחירת גודל חרוזים מגנטיים. רוחצים פעמיים עם 80% אתנול ו elute עם 40.5 μL.
    4. הפעל את בקרת איכות cdna באמצעות אלקטרופורזה האוטומטי ג'ל וכימות דנ א מבוסס-DNA בדיקות36,37.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה. דגימות יכולות להכיל 4 ° צ' עד 72 h או ב-20 ° c עד אינסוף.

5. רצף בניית הספרייה

  1. טמנטציה וניקוי של cDNA38.
    1. לנרמל cDNA כדי 50 ng ב 20 μL של נפח הכולל. כימות מדויקת היא קריטית בשלב זה.
    2. הפוך את התמהיל מיקס בטבלה 5 ו-30 μl לכל 20 מדגם Μl cdna על הקרח. הכניסו את הדגימות לתוך הציקלונט התרמי והפעל את פרוטוקול הטמנטציה: 55 ° צלזיוס 5 דק ' 10 ° c להחזיק.
    3. בצע את הניקוי של cDNA שעברו באמצעות עמודות38. הוסף מאגר איגוד DNA של 180 μL לכל דוגמה. העבר 230 μL לעמודת ספין.
    4. צנטריפוגה ב 1300 x g עבור 2 דקות ולמחוק את הזרימה דרך.
    5. רוחצים פעמיים עם מאגר שטיפת DNA μL 300. צנטריפוגה 2 דקות נוספות ב 1300 x g כדי להבטיח הסרת אתנול.
    6. Elute מטוהר התגים cDNA על ידי הוספת 31 μL של מאגר הימנעות לעמודה ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות.
    7. צנטריפוגה עבור 2 דקות ב 1300 x g כדי לשחזר את המוצר מטוהר.
  2. המדד לדוגמה PCR.
    1. בחר ברקודים שאינם חופפים במהלך הפעלת רצף מרובב.
    2. הפוך מיקס בסיס לדוגמה של ה-PCR כמוצג בטבלה 6.
    3. הוסף 60 μL של שילוב מאסטר של מדד ה-PCR לדוגמה 30 μL של הדגימה הטהורה.
    4. הוסף 10 μL של 20 μM, 4-oligo לדוגמה מדד לכל מדגם (אינדקס רשומות בשימוש). נפח התגובה הכולל הוא כעת 100 μL.
    5. מניחים בתוך הציקלוניים תרמית כאשר המכסה מוגדר ל 105 ° c. הפעל את התוכנית הבאה: 98 ° c 45 s à 12-14 מחזורים של [98 ° צלזיוס 20 s ב54 ° c-30 º c בתוך מעלות צלזיוס של 20 ° c] à 72 ° צ' 1 מינימום 4 ° c.
      הערה: זוהי נקודת עצירה בטוחה. ניתן להחזיק דגימות ב-4 ° צ' עד 72 h.
  3. לטהר את הספריות עם חרוז כפול לנקות.
    1. הוסף 100 μL של חומצות גרעין גודל בחירת חרוזים מגנטיים למדגם לערבב ביסודיות עם פיפטה. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות.
    2. העבר למגנט ותן לו לעמוד עד שהפתרון יתבהר. הסר והשמט את הסופרנטאנט.
    3. לשטוף פעמיים עם 200 μL של 80% אתנול.
    4. יבש את החרוזים על המגנט עבור 2 דקות. להסיר מן המגנט ולהוסיף 50.5 μL של מאגר EB לגלולה חרוז. פיפטה כדי להשעות מחדש. את החרוזים במאגר
    5. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות. העברה למגנט ולתת לעמוד 2 דקות. העבר 50 μL של דגימת האלוטד לצינור ניקוי נקי.
    6. הוסף 40 μL גרעין חומצה בחירה בגודל חרוזים מגנטיים למדגם ו דגירה בטמפרטורת החדר עבור 5 דקות. העברה למגנט ולתת את הפתרון ברור. הסרה וביטול של סופרנטאנט.
    7. לשטוף פעמיים עם 125 μL של 80% אתנול.
    8. יבש את החרוזים על המגנט עבור 2 דקות. להסיר מן המגנט ולהוסיף 60.5 μL של מאגר EB לגלולה חרוז. פיפטה כדי להשעות מחדש. את החרוזים במאגר
    9. דגירה בטמפרטורת החדר עבור 2 דקות. העברה למגנט ולתת לו לעמוד 2 דקות. העבר 50 μL של דגימת האלוטד לצינור ניקוי נקי. . זו הספרייה האחרונה
    10. החזיקו דגימות ב-4 ° צ' עד ל72 h או ב-20 ° c עד אינסוף. שים לב שזוהי נקודת עצירה בטוחה.
  4. לכמת ולהפעיל בקרת איכות של ספריות הסופי באמצעות אלקטרופורזה האוטומטי ג'ל וכימות DNA המבוססת על קרינה בדיקות36,37. דלל את הדגימות 1:10 לפני הפעלת בקרת איכות.

6. רצף הספריות

  1. הנרמל כל דוגמה לדגימה ל-2 ng/μL ובריכה 3 μL של כל דוגמה מנורמלת יחד.
  2. למדוד את ריכוז הבריכה עם המבוססת על הקרינהבדיקת דנ א באמצעות ה37.
  3. לדלל את הבריכה כדי 0.25 ng/μL.
  4. הספרות בבריכה כדלקמן: 12 μL של מדגם במאגר מדולל (0.25 ng/μL) + 1 μL שליטה DNA (1 ננומטר), 2 מאגר μL EB + 5 μL NaOH (0.4 N). תן זה הדגירה עבור 5 דקות, ואז להוסיף 10 μL של 200 mM Tris pH 8.0.
  5. טען 4.05 μL לתוך 1345.95 μL, 1/0. טען 1.3 mL לתוך מחסנית ברצף ולרוץ על פי הנחיות היצרן של39 באמצעות מתכון רצף עם 26 מחזורים (לקרוא 1) + 8 מחזורים (i7 index) + 0 מחזורים (i5 index) + 55 מחזורים (לקרוא 2).

7. יישור קריאה (קובץ משלים 1)

  1. הפעל את הריינג ' ר (v 2.0.0) כדי demultiplex ולטיפלקס קריאה בסיס raw (BCL) קבצים שנוצרו על ידי רצף לתוך קבצי FASTQ. ליישר את הקבצים FASTQ כדי האדם B 37.3 הגנום ואת מודל הגנים UCSC כדי להשיג כימות ביטוי.
  2. בקרת איכות ליישור.
    1. צור מדדי יישור ובדוק Q30 בסיסים, שבר ברקוד תקף, שבר משויך לתא, שבר קריאה ממופה וקריאות שזוהו בכל תא.
    2. בדוק את מזימת דירוג הברקוד כדי לוודא שההפרדה בין ברקודים המשויכים לתא לבין הרקע.

8. ניתוח נתונים (קובץ משלים 2)

  1. בקרת איכות התא והליך מקדים.
    1. אל תכלול תאים עם < גנים שזוהו 500, < 3000 המספר הכולל של המזהה המולקולרי הייחודי (UMI), > 0.2 הכדאיות שתוארה בעבר32. כוונן את התפשטחשבתי לפי סוגי הרקמה והתאים.
    2. . להסיר כdoublets
      1. להעריך את חמשת גנים הורמון האנדוקרינית (glucagon- gcg, אינסולין- INS, סוסטטין- sst, פוליפטידים הלבלב- PPY, ו גרלין- ghrl) עבור תבנית ביטוי דו-אופנית (גבוהה ביטוי במצב נמוך) באמצעות R חבילה מקלורק40.
      2. הסרת תאים המבטאים יותר גן הורמון אחד, כלומר, עם שני גנים הורמון או יותר במצב ביטוי גבוה.
    3. לנרמל את ביטוי הגנים על ידי UMI הכולל ולהתרבות על ידי מקדם קנה המידה של 10,000 ברמת התא באמצעות חבילת R Seurat41.
    4. הסרת גנים שזוהו בפחות מ -3 תאים.
    5. זיהוי גנים משתנים באמצעות ביטוי ממוצע ופיזור של כל התאים. כוונן את התפשטחשבתי לפי סוגי הרקמה והתאים.
  2. בצע את ניתוח הרכיבים העיקריים עם הגנים המשתנים. אשכול תאים עם המספר הנבחר של רכיבים ראשיים. גזור גנים מועשרים באשכול התאים על-ידי השוואת אשכול תא אחד עם שאר התאים.

תוצאות

זרימת העבודה ברצף RNA של התא היחיד מורכבת משלושה שלבים: השעיית האיים האנושיים שלמים להשעיה של תא בודד, לכידת תאים בודדים באמצעות הטכנולוגיה מבוססת droplet, וניתוח של נתוני RNA-seq (איור 1). ראשית, האיים האנושיים הנרכשים. הוכנסו לפני הלילה האיים שלמים נבדקו תחת המיק?...

Discussion

טכנולוגיות חד-תאי שפותחו בשנים האחרונות מספקות פלטפורמה חדשה לאפיון סוגי תאים וטרוגניות מולקולרית לחקר באיים הלבלב האנושי. אימצנו פרוטוקול של מיקרופלואידיג בידוד תא בודד וניתוח נתונים כדי ללמוד איונים אנושיים. הפרוטוקול שלנו הפיק בהצלחה נתונים רצפי RNA של למעלה מ 20,000 תאים איון יחיד האדם ?...

Disclosures

כל המחברים הם עובדים ובעלי מניות של Regeneron פרמצבטיקה, Inc.

Acknowledgements

לא

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

References

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved