著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を用いて、単体ヒト膵島から単一細胞の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するプロトコルを提示する。

要約

膵島は、特徴的なホルモン発現パターンを有する内分泌細胞からなる。内分泌細胞は、正常および病理学的状態に応答して機能的な違いを示す。このプロトコルの目的は、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシング技術を使用して、各内分泌細胞タイプの高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成することです。このようなデータは、正常または特定の条件で各内分泌細胞型の遺伝子発現プロファイルを構築するために利用することができる。このプロセスには、慎重な取り扱い、正確な測定、および厳格な品質管理が必要です。このプロトコルでは、ヒト膵島の解離、シーケンシング、およびデータ解析の詳細な手順について説明する。約20,000個のヒト単一のイレット細胞の代表的な結果は、プロトコルの正常な適用を実証する。

概要

膵島は、血糖値を調節するために内分泌ホルモンを放出します。機能的および形態的に異なる5つの内分泌細胞タイプは、この重要な役割に関与している:α細胞はグルカゴン、β細胞インスリン、δ細胞ソマトスタチン、PP細胞膵臓ポリペプチド、およびε細胞グレリン1を産生する。遺伝子発現プロファイリングは、正常または特定の状態で内分泌細胞を特徴付ける有用なアプローチである。歴史的に、全イレット遺伝子発現プロファイリングは、マイクロアレイと次世代RNAシーケンシング2、3、4、5、6、7を用いて生成された。,8.全てのイレットトランスクリプトームは、臓器特異的転写物および疾患候補遺伝子を同定するのに有益であるが、各イレット細胞型の分子不均一性を明らかにすることができない。レーザー捕捉微細解剖(LCM)技術は、島9、10、11、12から直接特定の細胞タイプを得るために適用されているが、標的細胞の純度に満ちばない人口。これらの制限を克服するために、蛍光活性化細胞選別(FACS)は、α細胞およびβ細胞13、14、15、16などの特定の内分泌細胞集団を選択するために使用されてきた。,17歳,18.さらに、Dorrellらは抗体ベースのFACS選別アプローチを用いてβ細胞を4つの亜集団19に分類した。FACSソートされたイレット細胞は、単一細胞のRNAシーケンシング用にメッキすることも可能です。しかし、プレートベースの方法は、スケーラビリティ20、21、22の課題に直面しています。

各内分泌細胞型の高品質で大規模なトランスクリプトームデータを生成するために、ヒトのイレット細胞にマイクロ流体技術を応用しました。マイクロ流体プラットフォームは、ハイスループット、高品質、スケーラブルな方法で多数の単一細胞からトランスクリプトームデータを生成します23,24,25, 26,27.大量に捕捉された細胞型の分子特性を明らかにするとともに、スケーラブルなマイクロ流体プラットフォームにより、十分な細胞が提供されたときに希少な細胞タイプを同定することができます。従って、ヒト膵島へのプラットフォームの適用は、グレリン分泌ε細胞のプロファイリングを可能にし、その希少性28に起因するほとんど知られていない機能を持つ稀な内分泌細胞型である。近年、技術29、30、31、32を用いたヒト島の大規模な転写データを報告する研究がいくつか出版されている。 33.このデータは、内分泌細胞の不均一性と疾患への影響を研究するために、公に入手可能で有用なリソースです。

ここでは、α-、β-、δ-、PP、ε細胞、および非内分泌細胞の小さな割合を含む約20,000個のヒトイヌアレット細胞のトランスクリプトームデータを生成するために使用されている液滴ベースのマイクロ流体単一細胞RNAシーケンシングプロトコルについて説明します。32.ワークフローは、孤立した人間の島から始まり、島細胞の解離、単一細胞のキャプチャ、およびデータ分析のステップを示しています。このプロトコルは、新たに分離された島を使用する必要があり、ヒトやげっ歯類などの他の種からの島に適用することができます。このワークフローを使用して、ベースラインおよび他の条件の下で公平で包括的な入り点細胞アトラスを構築することができる。

プロトコル

1. 人間のアイレット解離

  1. 研究目的のために特定の人口統計を有するドナーからの島が必要でない限り、15〜80歳の性別の死体臓器提供者から単離されたヒトの島を得る。
    1. 単離後、隔離された島をサプライヤーで2〜3日間組織培養施設に保管する。多くの場合、イレットの損傷が見えるようになるまでに1日以上かかります。
    2. ボトルに島を入れ、島培地に完全に浸します。夜間発送で研究室に持って行け
    3. 出荷された島の同等量 (IEQ) を、島の仕入先から入手します。
  2. 島到着日に出荷から島を回収します。汚染の可能性を最小限に抑えるためにフードを使用してこの手順を実行します。
    1. 完全なアイズルメディア(CMRL-1066、10%(v/v)FBS、1xペンストレップ、2mMグルタミン)を冷蔵庫で冷却します。
    2. ボトルから50 mLの円錐形チューブに島を移します。
    3. 空のボトルに10mLの予冷完了の完全な島の媒体を加えて残りの島を洗い流す。メディアを円錐形のチューブに移します。
    4. 200 x gでチューブを遠心分離し、2分間、島を回収します。ペレットで約1-2 mL培分を残して上清を吸引する。
    5. あらかじめ冷却された完全な島の媒体で島を再中断します。サプライヤーが提供する IEQ に基づいて、5000 IEQ ごとに 12 mL メディアを追加します。
    6. 10cmの非処理組織培養皿に培中に島を注ぎます。大気中の5%CO2で37°Cの組織培養インキュベーターで一晩インキュベートする。
  3. 以下に示すように、島を解離する。一晩インキュベーションの後にこの手順を実行します。
    1. 事前ウォーム完全なイレット培養および細胞解解。
    2. 室温で0.04%BSAを含む1x PBSを調調します。
    3. P200ピペットを使用して200-300の島を数え、5 mLの予め温められた完全な島の媒体を含む15 mLの円錐形の管に渡す。
    4. 200 x gで200xgで遠心分離して島を2分間集め、底部のペレットを邪魔することなく上清を静かに吸引する。
    5. 1.0 mLの予め温められた細胞の解離液を加え、上下にゆっくりとピペッティングしてペレットを破壊する。島を37°Cで9~11分間インキュベートします。3分ごとに上下にゆっくりと10sの細胞を単一の細胞に解離する。
    6. イレット細胞がよく解離され、溶液が濁ると、9 mLの完全な入り物培養物を追加し、30 μmセルストレーナーを通して新しい15 mL円錐管にフィルターを加えます。
    7. チューブとセルストレーナーを2mLの完全な島の培養物で洗浄し、残りの島を回収し、同じチューブに追加します。
    8. 400 x gで5分間遠心分離によって細胞を集める。
    9. メディアを穏やかに吸引し、0.04%BSA(PBS-BSA)を含む5 mL 1x PBSで細胞ペレットを再中断します。
    10. 新しい30 μmセルストレーナーを15 mLの円錐管にフィルターでフィルタリングし、遠心分離機を400 x gで5分間取り込み、細胞を集めます。
    11. 上清を吸引し、200-300 μL 1x PBS-BSA溶液で細胞ペレットを再中断します。
    12. 細胞濃度を測定し、400-500細胞/μLの最終濃度に体積を調整します。

2. シングルセルサスペンション品質管理

  1. 蛍光系自動細胞カウンター34を用いて細胞濃度を決定する。
    1. 10 μL セルを 0.5 μL AO/DAPI と混合します。ピペットミックスを徹底的に混ぜます。スライドに10.5 μLをロードし、セルカウントアッセイを実行して、カウントと生存率を判断します。
    2. セル数に基づいて、必要に応じてセル懸濁液を希釈またはフィルタリングします。

3. マイクロ流体チップを使用した単一セルパーティショニング。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。

  1. 3'ゲルビーズと逆転写(RT)試薬を室温(>30分)に持参してください。必要に応じて、TE バッファ内の RT プライマーを再構成します。
  2. 表 1で説明するように、低バインド チューブで RT マスター ミックスを準備します。
  3. 各サンプルに入力するセルの数を決定します。目的のターゲットセル数を提供するために必要なセル懸濁量(X)を計算します。各サンプルに添加するヌクレアーゼフリー水の計算量は33.8-X μLになります。
  4. 各サンプルを仕切る場合は、33.8-X μLヌクレス料フリー水を0.2 mL PCRストリップチューブに追加します。次に、各ストリップチューブに66.2 μLマスターミックスを追加します。この時点で、セルをストリップ チューブに追加しないでください。ピペットをやさしく混ぜます。準備されたストリップチューブを氷の上に置きます。
  5. マイクロ流体チップをチップケースに入れておきます。オイルウェル(3行)が実験を行う人に最も近いチップケースの向きを整えます。
  6. 8サンプル未満を実行する場合は、50%のグリセロールを使用して、次の順序で未使用のチャネルを充填します。
    1. 50%グリセロールの90 μLを、未使用のチャネルの行1のウェルに追加します。
    2. 50%グリセロールの40 μLを、未使用のチャネルの行2のウェルに追加します。
    3. 50%グリセロールの270 μLを、未使用のチャネルの行3のウェルに追加します。
  7. ゲルビーズを渦にスナップします。30 s. のフルスピードで渦は、ビーズを収集するために、ベンチトップのストリップを数回タップします。気泡が存在することを確認します。
  8. 準備されたストリップチューブにセルのX μLを追加します。ピペットを5回混ぜます。ピペットチップを捨てずに、90μLのセル混合物をチップの行1に移します。
  9. 30 s を待ってから、40 μL のゲルビーズを 2 行目にロードします。このステップのために非常にゆっくりとピペット。3列目の井戸に270 μLの仕切りオイルを分配します。
  10. チップガスケットをチップホルダーのタブに引っ掛けます。組み立てられたチップホルダーを単一セルパーティショニングデバイスに入れ、実行ボタンを押します。
  11. 実行完了時に組み立てられたチップホルダーを直ちに取り外します。
  12. ホルダーからチップガスケットを取り出し、チップケースを45°の角度で開き、チップから100μLのエマルジョンを青いプラスチック96ウェルプレートに取り外します。

4. 単一細胞cDNA増幅。マイクロ流体チップメーカー35からのプロトコルに従ってください。

  1. 逆転写
    注:クリーンなPCR専用フードの下でこの手順を実行して、増幅されていないcDNAの微生物やその他の汚染を防ぎます。
    1. 96ウェルブループレートを加熱プレートシーラーにホイルシールでシールします。
    2. 次のように熱サイクラーで逆転転写反応を実行します: 53 °C 45 分 à 85 °C 5 分 à 4 °C ホールド.
      注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。
  2. ポストRT精製
    1. 核酸結合磁気ビーズと核酸サイズ選択磁気ビーズを室温と渦に持ち込み、再停止します。この時点で、65°Cで10分間サンプルクリーンアップバッファを解凍します。他のすべての試薬を室温および渦に持ち込む。
    2. 表 2および表 3に示すように、バッファーを準備します。
  3. 化学的にエマルジョンを壊し、浄化します。
    1. これを行うには、プレートからホイルシールを静かに取り外します。
    2. 各エマルションに125 μLのピンクエマルション破断試薬を分配します。1 分間待ってから、ボリューム全体をクリーンな 0.2 mL ストリップ チューブに転送します。ストリップチューブに透明な層とピンクの層があることを確認します。
    3. 明確な層を妨げることなく、ストリップチューブの底からピンク層の125 μLを取り外します。ピンク層の少量(約15μL)がチューブ内に残るのは正常です。
    4. 表2から200μLのクリーンアップミックスをストリップチューブに加え、室温で10分間インキュベートします。
    5. ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。上清を取り出して廃棄し、80%エタノールでビーズを2回洗浄します。ビーズを1分間乾燥させます。
    6. 磁石からストリップチューブを取り出し、表3からビーズに35.5μLの溶出液を加えます。ピペットは、溶液中のビーズを再中断します。室温で2分間インキュベートします。
    7. ストリップチューブを磁気スタンドに移し、溶液をクリアします。精製したcDNAをストリップチューブから取り出し、0.2 mLのストリップチューブをきれいにするために分配します。
  4. cDNAを増幅します。
    1. 以下の表4で増幅マスターミックスを準備する。
    2. 各サンプルに65μLのcDNA増幅マスターミックスを追加します。ストリップチューブをサーマルサイクラーに入れ、次のプログラムを実行する:98 °C 3分の15サイクル[98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1分] à 72 °C 5分 4 °C ホールド
      注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72時間のための4°Cで保持することができる。
    3. 0.6倍の核酸サイズ選択磁気ビーズで増幅されたcDNAを浄化します。80%エタノールで2回洗浄し、40.5 μLで溶出します。
    4. 自動ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を使用して品質管理cDNAを実行します。
      注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72のか-20°Cで4°Cで保つことができる。

5. シーケンスライブラリ構築

  1. cDNA38のタグ付けとクリーンアップ .
    1. 総体積の20μLでcDNAを50ngに正規化します。この手順では、正確な定量が重要です。
    2. 表 5とアリコート 30 μL のタグ付けを、氷上の各 20 μL cDNA サンプルに合わせることができます。サンプルをサーマルサイクラーに入れ、タグ付けプロトコルを実行します:55 °C 5分à 10 °Cホールド。
    3. 列38を使用してタグ付き cDNA のクリーンアップを実行します。各サンプルに180 μLのDNA結合バッファーを追加します。230 μL をスピンカラムに転送します。
    4. 1300 x gで2分間遠心分離機を使用し、フロースルーを破棄します。
    5. 300 μL DNA洗浄バッファーで2回洗浄します。エタノール除去を確実にするために、1300 x gでさらに2分を遠心分離します。
    6. カラムに31μLの溶出バッファーを加えて精製したタグを精製し、室温で2分間インキュベートした。
    7. 精製された製品を回収するために1300 x gで2分間遠心分離機。
  2. サンプル インデックス PCR.
    1. 多重シーケンス実行中に重複しないバーコードを選択します。
    2. 表 6に示すように、サンプル インデックス PCR マスター ミックスを作成します。
    3. 精製サンプルの30 μLにサンプルインデックスPCRマスターミックスの60 μLを追加します。
    4. 各サンプルに20 μMの10 μL、4オリゴサンプルインデックスを追加します(使用されるレコードインデックス)。総反応量は100μLになりました。
    5. 蓋を105°Cに設定したサーマルサイクラーに入れます。次のプログラムを実行する:98 °C 45 s à 12-14 サイクル [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 分 à 4 °C ホールド。
      注: これは安全な停止ポイントです。サンプルは72までの72の間4 °Cで保持することができる。
  3. 二重ビーズクリーンアップでライブラリを浄化します。
    1. サンプルに100μLの核酸サイズ選択磁気ビーズを加え、ピペットと十分に混ぜます。室温で5分間インキュベートします。
    2. 磁石に移し、溶液がクリアされるまで放置します。上清を取り除いて捨てます。
    3. 80%エタノールの200 μLで2回洗います。
    4. 磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに50.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。
    5. 室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。
    6. 40μL核酸サイズ選択磁気ビーズを試料に加え、室温で5分間インキュベートし、磁石に移し、溶液を透明にします。上清を取り除いて廃棄します。
    7. 80%エタノールの125 μLで2回洗います。
    8. 磁石のビーズを2分間乾燥させ、磁石から取り出し、ビーズペレットに60.5 μLのEBバッファーを加えます。バッファ内のビーズを再中断するピペット。
    9. 室温で2分間インキュベート磁石に移し、2分間放置し、50μLのelutedサンプルをきれいなストリップチューブに移します。これが最後のライブラリです。
    10. 最大72時間、または-20°Cで4°Cでサンプルを無期限に保持します。これは安全な停止ポイントに注意してください。
  4. 自動化ゲル電気泳動および蛍光ベースのDNA定量アッセイ36、37を用いて最終ライブラリの品質管理を定量し、実行する。品質管理を実行する前に、サンプルを 1:10 に希釈します。

6. ライブラリのシーケンス

  1. 各サンプルを2 ng/μLに配列し、各正規化されたサンプルのプール3 μLを一緒に正規化します。
  2. 蛍光ベースのDNA定量アッセイ37でプール濃度を測定する。
  3. プールを 0.25 ng/μL に希釈します。
  4. プールを次のように変性:希釈プールサンプルの12 μL(0.25 ng/μL)+1 μL DNA制御(1 nM)、2 μL EBバッファー+ 5 μL NaOH(0.4N)。これを5分間インキュベートし、200 mMトリスpH 8.0の10 μLを加えます。
  5. 4.05 μL を 1345.95 μL HT1 にロードします。シーケンサーのカートリッジに1.3 mLをロードし、26サイクル(読み取り1)+8サイクル(i7インデックス)+0サイクル(i5インデックス)+55サイクル(読み取り2)のシーケンスレシピを使用して、製造元のガイドライン39に従って実行します。

7. 位置合わせを読み取る (補足ファイル 1)

  1. セル レンジャー (v2.0.0) を実行して、FASTQ ファイルへのシーケンスによって生成された未加工基本呼び出し (BCL) ファイルを多重化解除します。FASTQファイルをヒトB37.3ゲノムアセンブリおよびUCSC遺伝子モデルに合わせ、発現定量を得る。
  2. アライメント品質管理。
    1. 位置合わせメトリックを生成し、Q30 ベース、有効なバーコード分数、セル関連の読み取り分率、マップされた読み取り分率、および各セルで検出された読み取り値を確認します。
    2. バーコードランクプロットを調べて、セルに関連付けられたバーコードと背景の分離を確認します。

8. データ分析(補足ファイル2)

  1. 細胞の品質管理と前処理。
    1. < 500 検出された遺伝子を持つ細胞を除外し、< 3000 一意の分子識別子(UMI)の合計数、> 0.2 生存率スコアを前述の32.組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。
    2. ダレットを取り外します。
      1. Rを用いて5つの内分泌ホルモン遺伝子(グルカゴン - GCG、インスリン-INS、ソマトスタチン-SST、膵臓ポリペプチド-PPY、およびグレリン-GHRL)を評価し、Rを用いて二モーダル発現パターン(高発現および低発現モード)を評価する。 パッケージmclust40.
      2. 複数のホルモン遺伝子を発現する細胞、すなわち、高発現モードで2つ以上のホルモン遺伝子を発現する細胞を除去する。
    3. 全UMIによる遺伝子発現を正規化し、RパッケージSeurat41を用いて細胞レベルで10,000のスケール因子を乗算する。
    4. 3未満の細胞で検出された遺伝子を除去します。
    5. すべての細胞の平均発現と分散を使用して可変遺伝子を検出します。組織および細胞のタイプに従ってカットオフを調節する。
  2. 可変遺伝子を使用して主成分分析を実行します。選択した数の主成分を含むクラスターセル。1つの細胞クラスターと他の細胞を比較することにより、細胞クラスターを濃縮した遺伝子を導出する。

結果

単細胞RNAシーケンシングワークフローは、無傷のヒト島を単一細胞懸濁液に解離すること、液滴ベースの技術を用いて単一細胞を捕捉すること、およびRNA-seqデータを解析するという3つのステップで構成されています(図1)。まず、後天したヒト島を一晩インキュベートした。無傷の島を顕微鏡下で調べた(図2A)。解離された?...

ディスカッション

近年開発された単細胞技術は、細胞型を特徴付け、ヒト膵島の分子不均一性を研究する新しいプラットフォームを提供します。我々は、ヒトの島を研究するために、液滴ベースのマイクロ流体単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞単一細胞の単一細胞分離とデータ解析のプロトコルを採用した。我々のプロトコルは、配列の品質とバッチ効果の比較的小さな変動を持つ20,000以上の単一ヒトイス?...

開示事項

著者はいずれもリージェロン・ファーマシューティカルズ社の従業員および株主です。

謝辞

なし

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

参考文献

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

149RNA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved