Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, bir damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisini kullanarak izole insan pankreatik izletden tek hücrelerin yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Pankreas adacıklar ayırt edici hormon ifade desenleri ile endokrin hücrelerin oluşur. Endokrin hücreler normal ve patolojik koşullara yanıt olarak fonksiyonel farklılıklar gösterir. Bu protokolün amacı, her endokrin hücre türünün yüksek kaliteli, büyük ölçekli transkriptom verilerini, damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama teknolojisinin kullanımı ile oluşturacaktır. Bu tür veriler, normal veya spesifik koşullarda her endokrin hücre türünün gen ifadesi profilini oluşturmak için kullanılabilir. Süreç dikkatli işleme, doğru ölçüm ve titiz kalite kontrolü gerektirir. Bu protokolde, insan pankreatik islet ayrışma, sıralama ve veri analizi için ayrıntılı adımlar açıklanmaktadır. Yaklaşık 20.000 insan tek Islet hücrelerinin temsili sonuçları protokol başarılı uygulama göstermektedir.

Giriş

Pankreas adacıklar kan şekeri düzeylerini düzenleyen endokrin hormonlar serbest. İşlevsel ve morfolojik olarak farklılık gösteren beş endokrin hücre türü, bu temel rolde yer almaktadırlar: α-hücreler glukagon, β-hücreler insülin, δ hücreleri somatostatin, PP hücreleri pankreatik polipeptid ve ε-hücreler ghrelin1. Gen ifadesi profil oluşturma, normal veya spesifik koşullarda endokrin hücrelerini karakterize etmek için yararlı bir yaklaşımdır. Tarihsel olarak, tüm Islet gen ifadesi profil oluşturma Mikroarray ve yeni nesil RNA sıralama2,3,4,5,6,7 kullanılarak oluşturuldu , 8. tüm Islet transkriptom organ özgü transkriptler ve hastalık aday genler tanımlamak için bilgilendirici olmasına rağmen, her Islet hücre türünün moleküler heterojenliği ortaya çıkarmak için başarısız olur. Lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tekniği, doğrudan belirli hücre türlerini elde etmek için uygulandı9,10,11,12 ama hedeflenen hücrenin saflık kısa düşüyor Nüfus. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, α-ve β-hücreler13,14,15,16 gibi spesifik endokrin hücre popülasyonları seçmek için floresans etkin hücre sıralama (FACS) kullanılmıştır. , 17 , 18. dahası, dorrell ve ark. β-hücrelerini dört alt nüfus olarak sınıflandırmak için antikor bazlı FACS sıralama yaklaşımı kullandı19. FACS-sıralanmış Islet hücreleri de tek hücrelerin RNA sıralamaları için kaplama olabilir; Ancak, plaka tabanlı Yöntemler ölçeklenebilirlik20,21,22zorluklarla karşı karşıya.

Her endokrin hücre türünün yüksek kalitede, büyük ölçekli transkriptom veri oluşturmak için, biz insan Islet hücrelerine mikrofluidik teknoloji uygulandı. Mikrofluidik platform, yüksek verimlilik, yüksek kalitede ve ölçeklenebilir bir şekilde23,24,25,26,27gibi çok sayıda tek hücreden transkriptom veri üretir. Büyük miktarda yakalanan bir hücre türünün moleküler özelliklerini açığa çıkarmanın yanı sıra, yüksek ölçeklenebilir mikrofluidik platform, yeterli hücre sağlanırken nadir hücre türlerinin tanımlanması sağlar. Bu nedenle, insan pankreatik izletlere platformun uygulanması ghrelin-salgısı ε-hücrelerin profilleme izin, onun kıtlık nedeniyle az bilinen fonksiyon ile nadir bir endokrin hücre türü28. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar bizim tarafımızdan yayınlandı ve diğerleri teknoloji kullanarak insan adacıklar büyük ölçekli transkriptom veri raporlama29,30,31,32, 33. Veriler, Islet topluluğunun endokrin hücre heterojenitesi ve hastalıklarında onun ima edilmesi için genel olarak kullanılabilir ve yararlı kaynaklardır.

Burada, yaklaşık 20.000 α-, β-, δ-, PP, ε-hücreler ve endokrin olmayan hücrelerin daha küçük bir kısmı gibi insan Islet hücrelerinin transkriptom veri üretmek için kullanılan bir damlacık tabanlı mikrofluidik tek hücreli RNA sıralama protokolü, tarif 32. iş akışı yalıtılmış insan izletleri ile başlar ve Islet hücre dissociation, tek hücreli yakalama ve veri analizi adımlarını gösterir. Protokol, taze izole edilen izletlerin kullanılmasını gerektirir ve insanlar ve kemirgenler gibi diğer türlerin izletlere uygulanabilir. Bu iş akışını kullanarak, temel ve diğer koşullar altında tarafsız ve kapsamlı Islet hücre Atlası inşa edilebilir.

Protokol

1. insan Islet ayrışma

  1. Her iki cinsiyet kadavra organ bağışçıları izole insan adacıklar elde, yaş arasında 15-80 yıl, önceden mevcut hastalıklar olmadan belirli demografik ile bağış adacıklar sürece çalışma amacı için gereklidir.
    1. İzolasyondan sonra, 2-3 gün boyunca doku kültürü tesisinde izole edilmiş izletlere sahiptir. Genellikle Islet hasar görünür hale için 1 günden fazla sürer.
    2. Bir şişe içinde adacıklar yerleştirin ve tamamen Islet ortamına batırın. Bir gecede gönderi ile laboratuara getirin.
    3. Islet tedarikçiden sevk edilen adacıklar Islet eşdeğer miktarı (IEQ) elde.
  2. Islet varış gününde sevkiyattan izletleri kurtarın. Kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için bir başlık kullanarak bu adımı gerçekleştirin.
    1. Bir buzdolabında tam Islet medya (CMRL-1066,% 10 (v/v) FBS, 1x pen-strep, 2 mM glutamin) serin.
    2. Bir 50 ml konik tüp için şişeden adacıklar aktarın.
    3. Kalan adayları yıkamak için boşaltılmış şişeye 10 mL ön soğutmalı komple Islet ortamı ekleyin. Medyayı Konik Tüpe aktarın.
    4. 200 x g 'de tüp santrifüjünü 2 dakika kurtarmak için izletlar. Pellet ile yaklaşık 1-2 ml medya bırakarak süpernatant aspirate.
    5. Ön soğutmalı tam Islet medyası ile adacıklar yeniden resuspend. Tedarikçi tarafından sağlanan ıEQ göre, 5000 ıEQ başına 12 mL medya ekleyin.
    6. 10 cm olmayan tedavi edilen doku kültürü çanak üzerinde medyada adacıklar dökün. Atmosferik havadaki% 5 CO2 Ile 37 °c ' de doku kültürü kuluçorda bir gecede Inküye yapın.
  3. Aşağıda gösterildiği gibi dissociate adacıklar. Gece kuluçağlama aşağıdaki bu adımı gerçekleştirin.
    1. Ön sıcak komple Islet medya ve hücre ayrışma çözüm.
    2. Oda sıcaklığında% 0,04 BSA içeren 1x PBS hazırlayın.
    3. P200 pipet kullanarak 200-300 adacıklar sayma ve el pick ve 5 ml ön ısıtılmış komple Islet medya içeren 15 ml konik tüp için adacıklar transfer.
    4. 2 dakika boyunca 200 x g 'de santrifüjleme ile izetleri toplayın. alttan peletleri rahatsız etmeden süpernatant yavaşça Aspire.
    5. 1,0 ml ön ısıtılmış hücre ayrışma solüsyonu ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile Pelet bozar. 37 °C ' de 9-11 dak. Her 3 dakikada bir pipet yukarı ve aşağı yavaş 10 s tek hücrelere hücreleri ayırmak için.
    6. Bir kez izlet hücreleri iyi Disosiye ve çözüm bulutlu olur, yeni bir 15 ml konik tüp içine 30 μm hücre süzgeci ile 9 ml komple Islet medya ve filtre ekleyin.
    7. Tüp ve hücre süzgeci 2 mL komple Islet medyası ile yıkayın ve kalan izletleri toplayın ve aynı tüpe ekleyin.
    8. 5 dakika boyunca 400 x g 'de santrifüjleme ile hücreleri toplayın.
    9. Hafif Aspire medya ve% 0,04 BSA (PBS-BSA) içeren 5 ml 1x PBS hücre Pelet pelletini.
    10. 15 mL konik tüp içine yeni bir 30 μm hücre süzgeci ile filtre ve hücreleri toplamak için 5 dakika 400 x g Santrifüjü.
    11. 200-300 μL 1x PBS-BSA çözeltisi içinde süpernatant aspirate ve hücre Pelet pelletini.
    12. Hücre konsantrasyonunu ölçün ve hacmi 400-500 hücrelerinin/μL 'nin son konsantrasyonuna ayarlayın.

2. tek hücreli süspansiyon kalite kontrolü

  1. Floresan bazlı otomatik hücre sayacı34kullanarak hücre konsantrasyonunu belirleyin.
    1. 0,5 μL AO/DAPı ile 10 μL hücreleri karıştırın. Pipet karışımı iyice. Yük 10,5 μL slayt üzerine ve saymak ve viability belirlemek için hücre sayısı tahlil çalıştırın.
    2. Hücre sayımını temel alarak hücre süspansiyonunu gerektiği gibi seyreltin ve/veya filtreleyin.

3. tek hücreli bir mikrofluidik çip kullanarak bölümleme. Mikrofluidik çip üreticisi35protokolünden takip edin.

  1. 3 ' jel boncuk ve Ters transkripsiyon (RT) reaktifler oda sıcaklığına (> 30 dk) getirin. Gerekirse, TE arabelleğinde RT astar yeniden oluşturur.
  2. RT ana karışımını Tablo 1' de özetlendiği gibi düşük bağlama tüpüne hazırlayın.
  3. Her örnek için giriş olacak hücre sayısını belirleyin. İstenen hedef hücre numarasını teslim etmek için gerekli hücre süspansiyon hacmini (X) hesaplayın. Her örneğe eklemek için çekirdeksiz-ücretsiz su hesaplanan hacmi 33,8-X μL olacaktır.
  4. Bölümlenmiş her örnek için 0,2 mL PCR şerit tüp içine 33,8-X μL nuclease-ücretsiz su ekleyin. Ardından, her şerit tüpüne 66,2 μL Master Mix ekleyin. Bu noktada hücreleri şerit tüpüne eklemeyin. Karıştırın hafifçe pipet. Hazırlanan şerit tüplerini buzun üzerine yerleştirin.
  5. Yonga kılıfı içine mikrofluidik çip yerleştirin. Talaş davasının petrol kuyularını (3 etiketli satır) denemeyi gerçekleştiren kişiye en yakın olduğundan emin olmak için yönlendirmek.
  6. 8 ' den az örnek çalışıyorsa, kullanılmayan kanalları aşağıdaki sırayla doldurmak için 50% gliserol kullanın:
    1. Ekleme 90 μL 50% gliserol tüm kullanılmayan kanallar için satır 1 kuyuları içine.
    2. Ekleme 40 μL 50% gliserol tüm kullanılmayan kanallar için satır 2 kuyuları içine.
    3. Ekleme 270 μL 50% gliserol tüm kullanılmayan kanallar için satır 3 kuyuları içine.
  7. Jel boncukları bir girdap içine çekin. 30 s için tam hızda Vortex. boncuk toplamak için tezgah üst birkaç kez Strip dokunun. Hiçbir kabarcıklar mevcut olduğunu onaylayın.
  8. Hazırlanmış şerit tüplerine X μL hücre ekleyin. Pipet 5 kez karıştırın. Pipet uçları atmadan, 90 μL hücre karışımından fiş 1 ' e aktarın.
  9. 30 sn bekleyin, sonra 40 μL jel boncuk satır 2 ' ye yükleyin. Bu adım için çok yavaş pipet. 270 satır 3 ' ün kuyularına yağ bölme μL.
  10. Çip contasını çip tutucusunun sekmelerine kanca takın. Birleştirilmiş çip tutucuyu tek hücre bölümleme cihazına yerleştirin ve Çalıştır düğmesine basın.
  11. Monte edilen çip tutucuyu hemen çalıştırın.
  12. Çip contasını tutucunun dışına çıkarın, 45 ° açıda çip kılıfı açın ve yonganın 100 μL 'i çipten mavi plastik 96-kuyu plakasına çıkarın.

4. tek hücreli cDNA amplifikasyon. Mikrofluidik çip üreticisi35protokolünden takip edin.

  1. Ters transkripsiyon.
    Not: Bu adımı, steril olmayan cDNA 'nın mikrobiyal ve diğer kontaminasyonunu önlemek için temiz bir PCR-sadece kaput altında gerçekleştirin.
    1. 96-Well mavi plakayı ısıtmalı plaka mühürleyici üzerinde bir folyo mührü ile mühürleyin.
    2. Ters transkripsiyon reaksiyonu aşağıdaki gibi bir termal bisikletçiye çalıştırın: 53 °C için 45 dk à 85 °C 5 dk à 4 °C tutun.
      Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır. Numuneler 72 h 'ye kadar 4 °C ' de tutabilirler.
  2. RT sonrası arıtma
    1. Nüklik asit bağlayıcı manyetik boncuk ve nüklik asit boyutu seçimi manyetik boncuk Oda sıcaklığı ve Vortex yeniden askıya getirmek. Bu noktada, 65 °C ' de 10 dakika için örnek temizleme arabelleğini çözün. Diğer tüm reaktifler oda sıcaklığına ve Vortex 'e getirin.
    2. Arabellekleri Tablolar 2 ve Tablolar 3' te gösterildiği gibi hazırlayın.
  3. Kimyasal olarak emülsiyonu kırmak ve arındırmak.
    1. Bunu yapmak için, hafifçe plakanın folyo mührü çıkarın.
    2. Her emülsiyon içine pembe emülsiyon kırma reaktif 125 μL dispense. 1 dakika bekleyin, sonra temiz bir 0,2 mL şerit tüp tüm hacmi aktarın. Açık bir tabaka ve şerit tüp pembe bir tabaka olduğundan emin olun.
    3. Temiz katmanı rahatsız etmeden şerit tüpünün altındaki pembe tabakanın 125 μL değerini çıkarın. Pembe tabakanın küçük bir hacminin (~ 15 μL) tüpte kalması normaldir.
    4. Tablo 2 ' den şerit tüpüne 200 μL Temizleme karışımı ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inküye yapın.
    5. Şerit tüpünü manyetik bir standa aktarın ve çözümün temizlenmesine izin verin. Süpernatant çıkarın ve atın, sonra iki kez 80% etanol ile boncuklar yıkayın. Boncuk 1 dakika kurumasına izin verin.
    6. Mıknatıslı şerit tüpünü çıkarın ve Tablo 3 ' ten boncuklar Için 35,5 μL elüsyon çözeltisi ekleyin. Pipet, çözümdeki boncuklar yeniden pelletini. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca inküye yapın.
    7. Şerit tüpünü manyetik bir standa aktarın ve çözümün temizlenmesine izin verin. Şerit tüpünden arındırılmış cDNA 'yı çıkarın ve 0,2 mL şerit tüplerini temizlemeniz için çıkartın.
  4. CDNA 'yı güçlendirin.
    1. Yükseltme ana karışımını Tablo 4' te aşağıda hazırlayın.
    2. Her örnek için cDNA amplifikasyon Master Mix 65 μL ekleyin. Bir termal bisikletçi içine şerit tüp yerleştirin ve aşağıdaki programı çalıştırın: 98 °C 3 dk à 15 döngüleri [98 °C 15 s à 67 °C 20 s à 72 °C 1 dk] à 72 °C 5 dk à 4 °C tutun
      Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır. Numuneler 72 h 'ye kadar 4 °C ' de tutabilirler.
    3. Güçlendirilmiş cDNA 'yı 0.6 x nüklik asit boyutu seçimi manyetik boncuklar ile arındırın. 40,5 μL ile% 80 etanol ve elute ile iki kez yıkayın.
    4. Otomatik Jel Elektroforez ve floresans bazlı DNA nicelleştirme assay36,37kullanarak kalite kontrol cDNA çalıştırın.
      Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır. Örnekler 4 °C ' ye kadar 72 h veya-20 °C ' ye kadar süresiz olarak tutabilir.

5. sıralama kütüphanesi inşaatı

  1. Tagmentasyon ve Temizleme cDNA38.
    1. Toplam birimin 20 μL 'de cDNA 'yı 50 ng 'ye normalleştirin. Tam kantitasyon Bu adımda önemlidir.
    2. Tablo 5 ' te tagasyon karışımını yapın ve 30 μL 'i buzun üzerindeki her 20 μl cDNA örneğine atın. Numuneleri termal bisikletçiden koyun ve tagasyon protokolünü çalıştırın: 55 °C 5 dk à 10 °C tutun.
    3. 38sütunları kullanarak Tagmented cDNA Temizleme gerçekleştirin. Her örneğe 180 μL DNA bağlama arabelleği ekleyin. Transfer 230 μL bir döndürme sütununa.
    4. 1300 x g 'de Santrifüjü 2 dakika boyunca çıkarın ve akışını atın.
    5. 300 μL DNA yıkama tamponunu iki kez yıkayın. Etanol kaldırılmasını sağlamak için 1300 x g 'de ek 2 dk Santrifüjlü.
    6. Elute, sütununa 31 μL elüsyon tamponu ekleyerek ve 2 dakika boyunca oda sıcaklığında inküsleştirerek taraklı cDNA temizleşmiş.
    7. 1300 x g 'de 2 dakika Santrifüjü arındırılmış ürünü kurtarmak için.
  2. Örnek endeks PCR.
    1. Multiplexed sıralama çalışması sırasında çakışmayan barkodları seçin.
    2. Tablo 6' da gösterildiği gibi örnek dizin PCR ana karışımı yapın.
    3. Ekleme 60 μL örnek dizin PCR ana Mix 30 μL için temizleşmiş örnek.
    4. Her örneğe 10 μL, 20 μM, 4-oligo örnek indeksi ekleyin (kullanılan kayıt indeksi). Toplam reaksiyon hacmi şimdi 100 μL 'dir.
    5. 105 °C ' ye ayarlı kapaklı bir termal bisikletçi yerleştirin. Aşağıdaki programı çalıştırın: 98 °C 45 s à 12-14 döngüleri [98 °C 20 s à 54 °C 30 s à 72 °C 20 s] à 72 °C 1 dk à 4 °C tutun.
      Not: Bu güvenli bir durdurma noktasıdır. Numuneler 72 h 'ye kadar 4 °C ' de tutabilirler.
  3. Çift boncuk temizlemek ile kütüphaneler arındırmak.
    1. Numune için 100 μL nükleik asit boyutu seçimi manyetik boncuk ekleyin ve bir pipet ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe.
    2. Bir mıknatıs transfer ve çözüm temizler kadar durmak izin. Kaldırın ve supernatant atın.
    3. % 80 etanol 200 μL ile iki kez yıkayın.
    4. 2 dakika boyunca mıknatıs üzerindeki boncukları kurutun. mıknatıs çıkarın ve boncuk Pellet 50,5 μL EB tampon ekleyin. Tamponda boncukları yeniden askıya almak için pipet.
    5. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca kuluzlar. bir mıknatıslı transfer ve 2 dakika bekletin. 50 μL 'ye aktarılmış numuneyi temiz bir şerit tüpüne aktarın.
    6. Numuneyi 40 μL nükleik asit boyutu seçimi manyetik boncuk ekleyin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inküye. bir mıknatıs transfer ve çözüm açık izin Kaldırın ve supernatant atın.
    7. % 80 etanol 125 μL ile iki kez yıkayın.
    8. 2 dakika boyunca mıknatıs üzerindeki boncukları kurutun. mıknatıs çıkarın ve boncuk Pellet 60,5 μL EB tampon ekleyin. Tamponda boncukları yeniden askıya almak için pipet.
    9. Oda sıcaklığında 2 dakika boyunca kuluzlar. bir mıknatıslı transfer ve 2 dk. transfer 50 μL elüe örnek temiz bir şerit tüp. Bu son Kütüphane.
    10. Örnekleri 4 °C ' ye kadar 72 h veya-20 °C ' ye kadar süresiz olarak tutun. Bunun güvenli bir durdurma noktası olduğunu unutmayın.
  4. Otomatik Jel Elektroforez ve floresans bazlı DNA nicelleştirme tahlil36,37kullanarak final kitaplıklarının kalite kontrolünü ölçün ve çalıştırın. Kalite kontrolünü çalıştırmadan önce 1:10 numuneleri seyreltin.

6. kitaplık sıralaması

  1. Her örnek 2 ng/μL ve havuz 3 μL her normalleştirilmiş örnek birlikte sıralanmış için Normalleştir.
  2. Floresans bazlı DNA nicesitasyon tahlil37ile havuz konsantrasyonu ölçmek.
  3. Havuzu 0,25 ng/μL 'ye seyreltin.
  4. Havuz aşağıdaki gibi denature: 12 μL seyreltilmiş havuzlu numune (0,25 ng/μL) + 1 μL DNA kontrolü (1 nM), 2 μL EB tampon + 5 μL NaOH (0.4 N). Bu 5 dakika boyunca inküye edelim, sonra 10 μL 200 mM Tris pH 8,0 ekleyin.
  5. Yük 4,05 μL 1345,95 μL HT1. 1,3 mL 'yi Sequencer 'ın kartuşuna yükleyin ve üreticinin yönergelerine göre39 26 döngü (okuma 1) + 8 döngü (i7 endeksi) + 0 döngü (i5 endeksi) + 55 döngüleri (okuma 2) ile bir sıralama tarifi kullanarak çalıştırın.

7. hizalama okuma (ek dosya 1)

  1. Cell Ranger (v 2.0.0), FASTQ dosyalarına sıralamanın oluşturduğu Demultiplex ham baz çağrısı (BCL) dosyalarına çalıştırın. FASTQ dosyalarını insan B 37.3 Genome montajı ve UCSC gen modeline hizalayın ve ifade miktarını elde et.
  2. Hizalama kalite kontrolü.
    1. Hizalama ölçümleri oluşturmak ve Q30 üsleri, geçerli barkod fraksiyonu, hücre ilişkili okuma kesir, eşlenen okuma kesir ve her hücrede algılanan okur kontrol edin.
    2. Hücre ilişkili barkodları ve arka plan ayrılması emin olmak için barkod rütbe çizimi inceleyin.

8. veri analizi (ek dosya 2)

  1. Hücre kalite kontrolü ve preprocess.
    1. Hücreleri < 500 algılanan genler, < 3000 toplam benzersiz moleküler tanımlayıcı (UMI) sayısı, > 0,2 canlılığı Puanını daha önce32olarak açıklandığı gibi hariç tutun. Doku ve hücre türlerine göre cutoffs ayarlayın.
    2. Doublets kaldırın.
      1. Beş endokrin hormon genleri değerlendirmek (glukagon- GCG, Insülin- INS, somatostatin- SST, pankreatik polipeptid- PPY, ve ghrelin- ghrl) bimodal ifade deseni için (yüksek ve düşük ifade modu) kullanarak R paket mclust40.
      2. Yüksek ifade modunda iki veya daha fazla hormon genler ile birden fazla hormon geni, yani, ifade hücreleri kaldırın.
    3. Toplam UMı tarafından gen ifadesi normalleştirmek ve 10.000 ölçek faktörü tarafından hücre düzeyinde R paketi Seurat41kullanarak çarpın.
    4. 3 hücreden daha az algılanan genler kaldırın.
    5. Tüm hücrelerin ortalama ifade ve dağılım kullanarak değişken genler algılayın. Doku ve hücre türlerine göre cutoffs ayarlayın.
  2. Değişken genler ile asıl bileşen analizi gerçekleştirin. Seçili sayıda asıl bileşenin bulunduğu küme hücreleri. Hücrelerin geri kalanı ile bir hücre kümesini karşılaştırarak hücre kümesi zenginleştirilmiş genler türetin.

Sonuçlar

Tek hücreli RNA sıralama iş akışı üç adımda oluşur: tek hücreli süspansiyon içine bozulmamış insan izletler bunalımları, bir damlacık tabanlı teknoloji kullanarak tek hücreleri yakalamak, ve RNA-Seq verileri analiz (Şekil 1). Birincisi, elde edilen insan izletları bir gecede inkübe edildi. Bozulmamış adacıklar mikroskop altında incelenmiştir (Şekil 2a). Disanated Islet hücrelerinin bütünlüğü RNA...

Tartışmalar

Son yıllarda geliştirilen tek hücreli teknolojiler, hücre türlerini karakterize etmek ve insan pankreatik izletlerinde moleküler heterojenliği incelemek için yeni bir platform sağlar. İnsan izletlerini incelemek için damlacık bazlı mikrofluidik tek hücreli yalıtım ve veri analizinin bir protokolünü kabul ettik. Protokollerimiz, 20.000 üzerinde tek insan Islet hücrelerinden, sıra kalitesi ve toplu etkilerde nispeten küçük varyasyonları olan RNA sıralama verilerini başarıyla üretti.

Açıklamalar

Tüm yazarlar Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ' in çalışanları ve hissedarları.

Teşekkürler

Hiçbiri

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
30 µm Pre-Separation FiltersMiltenyi Biotec130-041-407Cell strainer
8-chamber slidesChemometec102673-680Dell counting assay slides
Bioanalyzer High Sensitivity DNA KitAgilent5067-4626for QC
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Single cell media
Chromium Single Cell 3' Library & Gel Bead Kit v2, 16 rxns10X Genomics120237Single cell reagents
Chromium Single Cell A Chip Kit v2, 48 rx (6 chips)10X Genomics120236Microfluidic chips
CMRL-1066ThermoFisher11530-037Complete islet media
EB BufferQiagen19086Elution buffer
Eppendorf twin-tec PCR plate, 96-well, blue, semi-skirtedVWR47744-112Emulsion plate
Fetal Bovine SerumThermoFisher16000-036Complete islet media
Human isletsProdo LabsHIRIsolated human islets
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher25030-081Complete islet media
Nextera DNA Library Preparation Kit (96 samples)IlluminaFC-121-1031Library preparation reagents
NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5 (75 cycles)IlluminaFC-404-2005Sequencing
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140-122Complete islet media
Qubit High Sensitivity dsDNA KitLife TechnologiesQ32854for QC
Solution 18Chemometec103011-420Cell counting assay reagent
SPRISelect ReagentFisher ScientificB23318Purification beads
Tissue Culture Dishes (10 cm)VWR10861-594for islet culture
TrypLE ExpressLife Technologies12604-013Cell dissociation solution
Zymo DNA Clean & Concentrator-5, 50 reactionsVWR77001-152Library clean up columns

Referanslar

  1. Gutierrez, G. D., Gromada, J., Sussel, L. Heterogeneity of the Pancreatic Beta Cell. Frontiers in Genetics. 8 (22), (2017).
  2. Eizirik, D. L., et al. The human pancreatic islet transcriptome: expression of candidate genes for type 1 diabetes and the impact of pro-inflammatory cytokines. PLoS Genetics. 8 (3), e1002552 (2012).
  3. Fadista, J., et al. Global genomic and transcriptomic analysis of human pancreatic islets reveals novel genes influencing glucose metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (38), 13924-13929 (2014).
  4. Gunton, J. E., et al. Loss of ARNT/HIF1beta mediates altered gene expression and pancreatic-islet dysfunction in human type 2 diabetes. Cell. 122 (3), 337-349 (2005).
  5. Kutlu, B., et al. Detailed transcriptome atlas of the pancreatic beta cell. BMC Medical Genomics. 2 (3), (2009).
  6. Maffei, A., et al. Identification of tissue-restricted transcripts in human islets. Endocrinology. 145 (10), 4513-4521 (2004).
  7. Moran, I., et al. Human beta cell transcriptome analysis uncovers lncRNAs that are tissue-specific, dynamically regulated, and abnormally expressed in type 2 diabetes. Cell Metabolism. 16 (4), 435-448 (2012).
  8. van de Bunt, M., et al. Transcript Expression Data from Human Islets Links Regulatory Signals from Genome-Wide Association Studies for Type 2 Diabetes and Glycemic Traits to Their Downstream Effectors. PLoS Genetics. 11 (12), e1005694 (2015).
  9. Ebrahimi, A., et al. Evidence of stress in beta cells obtained with laser capture microdissection from pancreases of brain dead donors. Islets. 9 (2), 19-29 (2017).
  10. Marselli, L., Sgroi, D. C., Bonner-Weir, S., Weir, G. C. Laser capture microdissection of human pancreatic beta-cells and RNA preparation for gene expression profiling. Methods in Molecular Biology. 560, 87-98 (2009).
  11. Marselli, L., et al. Gene expression profiles of Beta-cell enriched tissue obtained by laser capture microdissection from subjects with type 2 diabetes. PLoS One. 5 (7), e11499 (2010).
  12. Sturm, D., et al. Improved protocol for laser microdissection of human pancreatic islets from surgical specimens. Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).
  13. Ackermann, A. M., Wang, Z., Schug, J., Naji, A., Kaestner, K. H. Integration of ATAC-seq and RNA-seq identifies human alpha cell and beta cell signature genes. Molecular Metabolism. 5 (3), 233-244 (2016).
  14. Benner, C., et al. The transcriptional landscape of mouse beta cells compared to human beta cells reveals notable species differences in long non-coding RNA and protein-coding gene expression. BMC Genomics. 15 (620), (2014).
  15. Blodgett, D. M., et al. Novel Observations From Next-Generation RNA Sequencing of Highly Purified Human Adult and Fetal Islet Cell Subsets. Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).
  16. Bramswig, N. C., et al. Epigenomic plasticity enables human pancreatic alpha to beta cell reprogramming. The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 1275-1284 (2013).
  17. Dorrell, C., et al. Transcriptomes of the major human pancreatic cell types. Diabetologia. 54 (11), 2832-2844 (2011).
  18. Nica, A. C., et al. Cell-type, allelic, and genetic signatures in the human pancreatic beta cell transcriptome. Genome Research. 23 (9), 1554-1562 (2013).
  19. Dorrell, C., et al. Human islets contain four distinct subtypes of beta cells. Nature Communications. 7, 11756 (2016).
  20. Li, J., et al. Single-cell transcriptomes reveal characteristic features of human pancreatic islet cell types. EMBO Reports. 17 (2), 178-187 (2016).
  21. Muraro, M. J., et al. A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Human Pancreas. Cell Systems. 3 (4), 385-394 (2016).
  22. Segerstolpe, A., et al. Single-Cell Transcriptome Profiling of Human Pancreatic Islets in Health and Type 2 Diabetes. Cell Metabolism. 24 (4), 593-607 (2016).
  23. Bose, S., et al. Scalable microfluidics for single-cell RNA printing and sequencing. Genome Biology. 16 (120), (2015).
  24. Fan, H. C., Fu, G. K., Fodor, S. P. Expression profiling. Combinatorial labeling of single cells for gene expression cytometry. Science. 347 (6222), 1258367 (2015).
  25. Klein, A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).
  26. Macosko, E. Z., et al. Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  27. Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nature Communications. 8 (14049), (2017).
  28. Dominguez Gutierrez, G., et al. Signature of the Human Pancreatic epsilon Cell. Endocrinology. 159 (12), 4023-4032 (2018).
  29. Baron, M., et al. A Single-Cell Transcriptomic Map of the Human and Mouse. Pancreas Reveals Inter- and Intra-cell Population Structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  30. Lawlor, N., et al. Single-cell transcriptomes identify human islet cell signatures and reveal cell-type-specific expression changes in type 2 diabetes. Genome Research. 27 (2), 208-222 (2017).
  31. Wang, Y. J., et al. Single-Cell Transcriptomics of the Human Endocrine Pancreas. Diabetes. 65 (10), 3028-3038 (2016).
  32. Xin, Y., et al. Pseudotime Ordering of Single Human beta-Cells Reveals States of Insulin Production and Unfolded Protein Response. Diabetes. 67 (9), 1783-1794 (2018).
  33. Xin, Y., et al. RNA Sequencing of Single Human Islet Cells Reveals Type 2 Diabetes Genes. Cell Metabolism. 24 (4), 608-615 (2016).
  34. Chemometec. . Nucleocounter NC-250: Cell count and viability assay. , (2015).
  35. 10X Genomics. . 10X Genomics: Chromium Single Cell 3’ Reagents Kits v2: User Guide. , (2017).
  36. Agilent Technologies. . Agilent Bioanalyzer: High Sensitivity DNA Kit Guide. , (2013).
  37. Thermo Fischer Scientific. . Qubit: dsDNA High Sensitivity Assay Kit. , (2015).
  38. Illumina. . Illumina Nextera DNA Library Prep Reference Guide. , (2016).
  39. Illumina. . llumina NextSeq 500 System Guide. , (2018).
  40. Scrucca, L., Fop, M., Murphy, T. B., Raftery, A. E. mclust 5: Clustering, Classification and Density Estimation Using Gaussian Finite Mixture Models. R J. 8 (1), 289-317 (2016).
  41. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. 36 (5), 411-420 (2018).
  42. Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. Preprint at bioRixv. , (2018).
  43. DePasquale, E. A. K., et al. DoubletDecon: Cell-State Aware Removal of Single-Cell RNA-Seq Doublets. bioRxiv. , (2018).
  44. McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors. bioRxiv. , (2018).
  45. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets in single-cell transcriptomic data. bioRxiv. , (2018).
  46. Dominguez Gutierrez, G., et al. Gene Signature of Proliferating Human Pancreatic alpha Cells. Endocrinology. 159 (9), 3177-3186 (2018).
  47. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  48. Habib, N., et al. Div-Seq: Single-nucleus RNA-Seq reveals dynamics of rare adult newborn neurons. Science. 353 (6302), 925-928 (2016).
  49. Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Genetiksay 149tek h creli RNA s ralamasinsan pankreatik isleth crelerh crelerh cre n fusu heterojenliktranskriptom

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır