Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي طرق إنشاء نماذج xenograft (PDX) المستمدة من المريض وخطوط الخلايا السرطانية الأولية من عينات سرطان المعدة الجراحية. وتوفر هذه الأساليب أداة مفيدة لتطوير المخدرات وبحوث بيولوجيا السرطان.

Abstract

استخدام نماذج ما قبل السريرية لتعزيز فهمنا لبيولوجيا الورم والتحقيق في فعالية العوامل العلاجية هو المفتاح لبحوث السرطان. على الرغم من أن هناك العديد من خطوط خلايا سرطان المعدة الراسخة والعديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا التقليدية للبحوث ما قبل السريرية، ومساوئ هذه في المختبر وفي نماذج الجسم الحي الحد من تطبيقاتها. لأن خصائص هذه النماذج قد تغيرت في الثقافة، فإنها لم تعد نموذج عدم تجانس الورم، واستجاباتها لم تكن قادرة على التنبؤ الاستجابات في البشر. وهكذا، يتم تطوير نماذج بديلة تمثل بشكل أفضل عدم تجانس الورم. تحافظ نماذج xenograft المستمدة من المريض (PDX) على المظهر الهيستولوجي للخلايا السرطانية، وتحافظ على عدم تجانس الورم، وتعكس بشكل أفضل المكونات البشرية ذات الصلة للبيئة الدقيقة للورم. ومع ذلك، عادة ما يستغرق 4-8 أشهر لتطوير نموذج PDX، وهو أطول من البقاء على قيد الحياة المتوقع من العديد من مرضى المعدة. ولهذا السبب، قد يكون إنشاء خطوط الخلايا السرطانية الأولية طريقة تكميلية فعالة لدراسات الاستجابة للأدوية. يصف البروتوكول الحالي طرق إنشاء نماذج PDX وخطوط الخلايا السرطانية الأولية من عينات سرطان المعدة الجراحية. وتوفر هذه الأساليب أداة مفيدة لتطوير المخدرات وبحوث بيولوجيا السرطان.

Introduction

سرطان المعدة هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعًا في جميع أنحاء العالم وثالث سبب رئيسي للوفاة بالسرطان. في عام 2018، تم تشخيص أكثر من 1,000,000 حالة جديدة من سرطان المعدة على الصعيد العالمي، وقتل ما يقدر بـ 783,000 شخص بسبب هذا المرض1. لا يزال معدل الإصابة بسرطان المعدة والوفيات مرتفعة جداً في بلدان شمال شرق آسيا2و3. على الرغم من التقدم الكبير في مجال علاج السرطان، لا يزال تشخيص المرضى الذين يعانون من سرطان المعدة المتقدم ضعيفا، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة خمس سنوات من حوالي 25٪4،5،6، 7،. وبالتالي، هناك حاجة ملحة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة لسرطان المعدة

علاج سرطان المعدة هو التحدي بسبب عدم تجانسه عالية8،9. وهكذا، فإن مسألة كيفية التصدي لتحديات عدم تجانس الورم لتحقيق الطب الدقيق أمر أساسي لبحوث السرطان. في المختبر وفي نماذج الجسم الحي تلعب أدوارا حاسمة في توضيح الآليات غير المتجانسة وبيولوجيا سرطان المعدة. ومع ذلك، على الرغم من أن هناك العديد من خطوط خلايا سرطان المعدة والعديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا التقليدية للبحوث ما قبل السريرية، ومساوئ هذه النماذج تحد من تطبيقاتها10. لأن خصائص هذه النماذج قد تغيرت في الثقافة، فإنها لم تعد نموذج عدم تجانس الورم، واستجاباتها لم تكن قادرة على التنبؤ الاستجابات في البشر11. هذه القضايا تحد بشدة من إمكانية تحديد المجموعات الفرعية من مرضى السرطان التي سوف تستجيب للأدوية المستهدفة. الثقافة على المدى القصير من الأورام الأولية يوفر وسيلة سريعة نسبيا وشخصية للتحقيق في الخصائص الدوائية المضادة للسرطان، والتي من المرجح أن تكون السمة المميزة لعلاج السرطان شخصية.

ويفضل xenografts المستمدة من المريض (PDXs) كنموذج بديل قبل السريرية لالتنميط استجابة المخدرات12. وبالإضافة إلى ذلك، نماذج PDX تقدم أداة قوية لدراسة بدء وتطور السرطان13،14. نماذج PDX الحفاظ على المظهر الهيستلوجي للخلايا السرطانية، والاحتفاظ بالتباين داخل الورم، وتعكس بشكل أفضل المكونات البشرية ذات الصلة من الورم microenvironment15،16. ومع ذلك، فإن الحد من نماذج PDX المستخدمة على نطاق واسع هو معدل نجاح منخفض لإنشاء ونشر الأورام الصلبة البشرية بشكل تسلسلي. في هذه الدراسة، يتم وصف أساليب ناجحة بشكل لائق لإنشاء نماذج PDX وخطوط الخلايا الأساسية.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة البشرية من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات المؤسسية في مركز السرطان جامعة صن يات سين (SYSUCC، قوانغتشو، الصين). تمت الموافقة على الدراسة الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها في جامعة صن يات سين. ملاحظة: أجريت جميع التجارب وفقاً للقوانين والمبادئ التوجيهية المؤسسية ذات الصلة، بما في ذلك المبادئ التوجيهية للحماية من التعرض المهني ضد مسببات الأمراض المنقولة بالدم.

1. إعداد عينة

  1. الحصول على أنسجة سرطان المعدة (P0 = مرور 0) مباشرة من العملية. يجب أن تكون عينة الورم أكبرمن 0.5 سم 3.
  2. إعداد 3-4 مل من محلول الأسهم: على سبيل المثال، RPMI-1640 المتوسطة (1X) تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS)، 100 U / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل ستربيتماسين.
  3. وضع عينة الورم الطازجة في الأوراق المالية الحل في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 4 ساعات.

2. إنشاء نموذج PDX (الشكل 1)

  1. لضمان وجود منطقة جراحية معقمة، قم بتطهير جميع المواد بالأشعة فوق البنفسجية لأكثر من 30 دقيقة قبل نقلها إلى المختبر الحيواني.
    ملاحظة: غرفة العمليات تحتاج إلى تطهيرها مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة، قبل أن ننظف المكتب مع ثنائي كلورو حمض الإيزوسيانوريك حمض الصوديوم suppositoria مطهر. ثم يستخدم البوفيدون اليود لتطهير الجلد.
  2. باستخدام الملقط والمقص، تشريح بعناية أنسجة الورم وتقليم لهم إلى عدة قطع صغيرة (ما يقرب من 1 مم3 مكعبات) في ظروف معقمة.
  3. تخدير الإناث 5-7 أسابيع من العمر NOD-SCID-IL2rg (NSG) الفئران عن طريق التعرض ل1-1.5٪ isoflurane مع آلة التخدير.
    1. التخدير الماوس حتى يتوقف عن النضال ولكن يحافظ على التنفس حتى.
      ملاحظة: أنبوب 50 مل هو معدات بسيطة تعمل على غرار آلة التخدير. استخدام مرهم العين البيطرية لمنع الجفاف غير ضروري بسبب وقت التشغيل القصير.
  4. قم بعمل شق 1 سم على كلا الجناحين الظهري باستخدام مقص معقم، وزرع قطعة ورم واحدة في كل جانب من جوانب الماوس.
    1. للتأكد من أن قطعة الورم لا تنزلق، استخدم ملقط معقم لتعطيل الأنسجة تحت الجلد. ثم، مقطع قطعة من أنسجة الورم، ووضعها في الموقع العميق.
  5. إغلاق منطقة الزرع عن طريق خياطة تحت الجلد مع الإبر خياطة الجراحية، ووضع علامة على آذان الماوس مع علامات الأذن المسمى
  6. تعقيم الجرح باليود.
  7. وضع الفئران بلطف في قفص فارغ بعد الجراحة مع الحفاظ على recumbency صارمة. إيلاء اهتمام وثيق لحالة الفئران. يستيقظون ويبدأون في المشي حوالي 3-4 دقائق في وقت لاحق. وضع الفئران التي خضعت لعملية جراحية في قفص جديد آخر منفصلة عن تلك التي لم تخضع لعملية جراحية.
  8. تقييم حجم الورم عن طريق جس موقع الزرع. قياس الأورام مع الفرجار فيرنييه مرتين في الأسبوع.
  9. بمجرد أن يصل الورم إلى 10 مم في القطر، تزداد الحالة الحيوانية سوءاً، أو تقرح الورم، ويؤدي إلى قتل الماوس بطريقة معتمدة من قبل IRB. إعادة زرع شظايا الورم الطازجة حصادها في 2 الفئران الجديدة للتمرير، أو تخزين العينات مؤقتا في PBS على الجليد لعزل خطوط الخلايا الأولية.

3. حفظ الأنسجة بالتبريد

ملاحظة: يشير هذا الجزء بشكل أساسي أساليب "مجموعة التبريد مجموعة الأنسجة الحية". يتم سرد المجموعات والمعدات الرئيسية في جدولالمواد.

  1. قتل الفئران مع طريقة وافق IRB عندما يكون الورم أكبر من 10 ملم في القطر.
  2. باستخدام ملقط معقمة ومقص، عزل ببطء الورم من الفئران.
  3. غسل أنسجة الورم مع DPBS في طبق 10 سم. تشريح وإزالة المناطق النخرية والأنسجة الدهنية والجلطات الدموية والأنسجة الضامة مع ملقط ومقص.
  4. قطع أنسجة الورم إلى أقصى سمك 1 ملم مع قالب.
  5. تُغسل الشرائح مع DPBS في طبق بحجم 10 سم.
    ملاحظة: تتضمن عملية التزجيج استخدام أنابيب تحمل اسم V1/V2/V3 في الخطوات 3.6-3.8. المكونات الرئيسية هي DMSO والسكروز.
  6. نقل شرائح إلى أنبوب V1 مع ملقط، واحتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  7. صب الحل V1 وشرائح في طبق 10 سم. نقل شرائح إلى أنبوب V2 مع ملقط، واحتضان أنبوب V2 في 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  8. صب الحل V2 وشرائح في طبق 10 سم. نقل شرائح إلى أنبوب V3 مع ملقط، واحتضان الأنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    1. إذا كانت عدة شرائح لا تزال عائمة، لفة وعكس الأنبوب لفترة وجيزة، ووضع الأنبوب في 4 درجة مئوية مرة أخرى حتى تغرق جميع الشرائح تماما. إذا لزم الأمر، تجاهل الشرائح العائمة.
  9. صب الحل V3 وشرائح في طبق 10 سم.
  10. قطع أصحاب الأنسجة إلى الطول المناسب، ووضعها على الشاش المعقمة. نقل شرائح على أصحاب. التفاف أصحاب مع الشاش، ووضعها في النيتروجين السائل باستخدام ملقط، تليها الحضانة لمدة 5 دقائق.
  11. تسمية قارورة المبردة مع معلومات الأنسجة.
  12. نقل أصحاب مع شرائح الأنسجة في قارورة المبردة، والتي يتم تخزينها في النيتروجين السائل.

4. عزل الخلايا الأولية (الشكل 2)

  1. تعقيم ملقط ومقص مع ارتفاع ضغط البخار في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. استئصال عينات سرطان المعدة من عينات مقطعة أو أنسجة PDX حصادها. ضع الأنسجة على الجليد، ثم نقل الأنسجة إلى طبق ثقافة معقمة 10 سم.
  3. تشريح وإزالة المناطق النخرية والأنسجة الدهنية والجلطات الدموية والأنسجة الضامة مع ملقط ومقص.
  4. غسل أنسجة الورم مرة واحدة مع DPBS التي تحتوي على 100 U / مل البنسلين و 0.1 ملغ / مل العقديات في طبق 10 سم.
  5. قطع أنسجة الورم إلى 1 مم3 قطع على غطاء الطبق. يجب أن يكون سمك الحد الأقصى لكل قطعة 1 ملم.
  6. نقل الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل مع ما يقرب من 7 مل من نوع 1 كولاجيناز وتريبسين (1:14) الحل. دوامة الخليط لفترة وجيزة.
  7. حضانة الأنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة.
  8. إضافة حجم متساو من RPMI-1640 المتوسطة (1X) تستكمل مع FBS 10٪ إلى الأنبوب. دوامة الخليط جيدا.
  9. نقل الخليط إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل جديدة عن طريق الترشيح البطيء من خلال مرشح 40 درجة مئوية.
    ملاحظة: استخدم مرشحات 40 ميكرومتر لضمان نسبة أعلى من الخلايا السرطانية. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام مرشحات 100 ميكرومتر للحفاظ على المزيد من أنواع الخلايا، مثل الخلايا المناعية.
  10. الطرد المركزي في filtrates في 113-163 × ز لمدة 5-7 دقيقة في RT. إزالة بعناية supernatant.
  11. غسل بيليه مع 5 مل من PBS، وإزالة بعناية supernatant.
  12. إذا كان بيليه أحمر، فإنه يحتوي على العديد من كريات الدم الحمراء. بلطف إعادة تعليق بيليه مع 500 درجة مئوية من الدم الأحمر حالة الدم العازلة اللليس. بعد 5 دقائق الحضانة، إضافة 5 مل من PBS، وإزالة بعناية supernatant.
  13. إعادة تعليق بيليه مع وسط الثقافة، ونقل الخليط إلى طبق معقم 10 سم.
  14. استبدل الوسط بوسيلة تحتوي على مصل كل 2-3 أيام.
  15. مرور الخلايا الأولية باستخدام التربسين / EDTA عندما تصل إلى التقاء 50٪.

النتائج

هنا، تم الحفاظ على أنسجة الورم من عملية في حل الأوراق المالية حتى الخطوة التالية. في غضون 4 ساعات، تم قطع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة وزرعها في الأجنحة الظهرية من الفئران NSG التي تم تخديرها باستخدام القطن غارقة isoflurane. يمكن استئصال الأورام التي يزيد حجمها عن 1 سم3 لزرعها في فئران جديدة (

Discussion

سرطان المعدة هو مرض عدواني مع خيارات علاجية محدودة. وهكذا، أصبحت نماذج سرطان المعدة موردا حاسما لتمكين الدراسات البحثيةالوظيفية مع الترجمة المباشرة إلى العيادة 4،8،17. هنا، لقد وصفنا أساليب وبروتوكول إنشاء نماذج PDX سرطان المعدة وخطوط الخ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد دعمت هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81572392)؛ البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (2016YFC1201704)؛ أفضل المواهب الشبابية العلمية والتقنية المبتكرة لبرنامج قوانغدونغ للدعم الخاص (2016TQ03R614).

ونحن نشكر على وجه التحديد قوانغتشو Sagene التكنولوجيا الحيوية المحدودة للمساعدة في إعداد الأرقام.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
40 μm Cell StrainerBiologix, Shandong, China15-1040
Biological MicroscopeOLYMPUS, Tokyo, JapanOLYMPUS CKX41
CentrifugeEppendorf, Mittelsachsen, Germany.5427R
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USAHERACELL 150i
DPBSBasalmedia Technology, Shanghai, ChinaL40601
Electro-Thermostatic Water CabinetYiheng, Shanghai, ChinaDK-8AXX
Fetal bovine serumWisent Biotechnology, Vancouver, Canada86150040
IsofluraneBaxter, ChinaCN2L9100
Live Tissue Kit Cryo KitCelliver Biotechnology, Shanghai, ChinaLT2601
Live Tissue Thaw KitCelliver Biotechnology, Shanghai, ChinaLT2602
NSGBiocytogen, Beijing, ChinaB-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycinThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA15140122
Red blood cell lysis bufferSolarbio, Beijing, ChinaR1010
RPMI-1640 mediumThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA8118367
Surgical Suture Needles with ThreadLingQiao, Ningbo, China3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary bladesCelliver Biotechnology, Shanghai, ChinaLT2603
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA2003779
Type 1 collagenaseThermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA17100017

References

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. Ca-a Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Sugano, K. Screening of gastric cancer in Asia. Best Practive & Research in Clinical Gastroenterology. 29 (6), 895-905 (2015).
  3. Nikfarjam, Z., et al. Demographic survey of four thousand patients with 10 common cancers in North Eastern Iran over the past three decades. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 15 (23), 10193-10198 (2014).
  4. Coccolini, F., et al. Advanced gastric cancer: What we know and what we still have to learn. World Journal of Gastroenterology. 22 (3), 1139-1159 (2016).
  5. Goetze, O. T., et al. Multimodal treatment in locally advanced gastric cancer. Updates in Surgery. 70 (2), 173-179 (2018).
  6. Graziosi, L., Marino, E., Donini, A. Multimodal Treatment of Locally Advanced Gastric Cancer: Will the West Meet the East?. Annals of Surgical Oncology. 26 (3), 918 (2019).
  7. Choi, Y. Y., Noh, S. H., Cheong, J. H. Evolution of Gastric Cancer Treatment: From the Golden Age of Surgery to an Era of Precision Medicine. Yonsei Medical Journal. 56 (5), 1177-1185 (2015).
  8. Zhang, W. TCGA divides gastric cancer into four molecular subtypes: implications for individualized therapeutics. Chinese Journal of Cancer Research. 33 (10), 469-470 (2014).
  9. Tirino, G., et al. What's New in Gastric Cancer: The Therapeutic Implications of Molecular Classifications and Future Perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  10. Roschke, A. V., et al. Karyotypic complexity of the NCI-60 drug-screening panel. Cancer Research. 63 (24), 8634-8647 (2003).
  11. Wilding, J. L., Bodmer, W. F. Cancer cell lines for drug discovery and development. Cancer Research. 74 (9), 2377-2384 (2014).
  12. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Research. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  13. Xu, C., et al. Patient-derived xenograft mouse models: A high fidelity tool for individualized medicine. Oncology Letters. 17 (1), 3-10 (2019).
  14. Lai, Y., et al. Current status and perspectives of patient-derived xenograft models in cancer research. Journal OF Hematology & Oncology. 10 (1), 106 (2017).
  15. Kawaguchi, T., et al. Current Update of Patient-Derived Xenograft Model for Translational Breast Cancer Research. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 22 (2), 131-139 (2017).
  16. Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Research. 75 (15), 2963-2968 (2015).
  17. Liu, X., Meltzer, S. J. Gastric Cancer in the Era of Precision Medicine. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 3 (3), 348-358 (2017).
  18. Shultz, L. D., et al. . Human cancer growth and therapy in immunodeficient mouse models. (7), 694-708 (2014).
  19. McDermott, S. P., et al. Comparison of human cord blood engraftment between immunocompromised mouse strains. Blood. 116 (2), 193-200 (2010).
  20. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma (c) (null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  21. Wege, A. K., et al. Co-transplantation of human hematopoietic stem cells and human breast cancer cells in NSG mice: a novel approach to generate tumor cell specific human antibodies. MAbs. 6 (4), 968-977 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149xenograft

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved