Mide kanseri hasta-türetilen xenograft modelleri ve primer hücre hatları kurulması

Özet

Geçerli protokol, hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri ve cerrahi mide kanseri örneklerinden primer kanser hücresi hatları oluşturmak için yöntemleri açıklar. Yöntemleri ilaç geliştirme ve kanser Biyoloji araştırma için yararlı bir araç sağlar.

Özet

Tümör biyolojisi anlayışımızı ilerletmek ve terapötik ajanların etkinliğini araştırmak için preklinik modellerin kullanımı kanser araştırmalarının anahtarıdır. Birçok kurulan mide kanseri hücre hatları ve preklinik araştırma için birçok konvansiyonel transgenik fare modelleri olmasına rağmen, bu in vitro ve in vivo modellerin dezavantajları uygulamalarını sınırlandırmak. Bu modellerin özellikleri kültürde değiştiği için, artık tümör heterojenliğini modellemez ve cevapları insanlarda yanıt tahmin edememiştir. Böylece, tümör heterojenliğini daha iyi temsil eden alternatif modeller geliştirilmektedir. Hasta tarafından türetilen xenograft (PDX) modelleri kanser hücrelerinin histolojik görünümünü korur, intratümöral heterojenliği korur ve tümör mikroortamının ilgili insan bileşenlerini daha iyi yansıtır. Ancak, genellikle birçok mide hastalarının beklenen hayatta kalmasının daha uzun bir PDX modeli geliştirmek için 4-8 ay sürer. Bu nedenle, primer kanser hücresi hatları kurulması ilaç tepkisi çalışmaları için etkili bir tamamlayıcı yöntem olabilir. Geçerli protokol, cerrahi mide kanseri örneklerinden PDX modelleri ve primer kanser hücresi hatları oluşturmak için yöntemleri açıklar. Bu yöntemler ilaç gelişimi ve kanser biyoloji araştırmaları için yararlı bir araç sağlar.

Giriş

Mide kanseri dünya çapında beşinci en yaygın kanser ve kanser ölümü üçüncü önde gelen nedenidir. 2018 yılında, 1.000.000 üzerinde yeni mide kanseri vakaları küresel olarak teşhis edildi ve bu hastalık¹' de tahmini bir 783.000 kişi öldürüldü. Gastrik kanserinin insidansı ve mortalite kuzeydoğu Asya ülkelerinde çok yüksek kalır^2,3. Kanser terapileri alanında önemli ilerlemelere rağmen, gelişmiş mide kanseri olan hastaların prognoz yoksul kalır, beş yıllık hayatta kalma oranı yaklaşık 25%^4,5,^{6, 7'}ye kadar. Böylece, mide kanseri için yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için acil bir ihtiyaç vardır

Mide kanserinin tedavisi, yüksek heterojenlik^8,9nedeniyle zordur. Böylece, hassas tıp gerçekleştirmek için tümör heterojenlik zorlukları nasıl ele almak için soru kanser araştırma merkezidir. İn vitro ve in vivo modellerde, mide kanserinin heterojen mekanizmaları ve Biyolojisi ile ilgili önemli roller oynatılıyor. Ancak, çok sayıda mide kanseri hücre hatları ve preklinik araştırma için birçok konvansiyonel transgenik fare modelleri olmasına rağmen, bu modellerin dezavantajları uygulamalarını sınırlamak¹⁰. Çünkü bu modellerin özellikleri kültür değişti, onlar artık model tümör heterojenlik, ve onların cevapları insanlarda yanıt tahmin etmek mümkün olmamıştır¹¹. Bu sorunlar, hedeflenen ilaçlara yanıt verecek kanser hastalarının alt gruplarını tanımlama olasılığını ciddi olarak sınırlandırır. Primer tümörlerin kısa vadeli kültürü, antikanser farmakolojik özelliklerini araştırmak için nispeten hızlı ve kişiselleştirilmiş bir yol sağlar ve bu da kişiselleştirilmiş kanser tedavisinin damgasını olacak.

Hasta türevi ksenogreft (pdxs), uyuşturucu tepkisi için alternatif bir preklinik model olarak tercih edilir¹². Buna ek olarak, PDX modelleri kanserin başlatılması ve ilerlemesini incelemek için güçlü bir araç sunuyor^13,14. PDX modelleri kanserli hücrelerin histolojik görünümünü korur, intratümöral heterojenliği korur ve tümör mikroortamının ilgili insan bileşenlerini daha iyi yansıtır^15,16. Ancak, yaygın olarak kullanılan PDX modellerinin sınırlandırılması, insan katı tümörlerinin kurulması ve seri olarak yayılması için düşük başarı oranıdır. Bu çalışmada, PDX modelleri ve primer hücre hatları kurmak için terbiyeli başarılı yöntemler açıklanmıştır.

Protokol

Bu insan çalışması, Sun Yat-sen Üniversitesi Kanser Merkezi (SYSUCC, Guangzhou, Çin) kurumsal etik Inceleme Kurulu tarafından onaylanmıştır. Hayvan çalışması Sun Yat-sen Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır. Not: tüm deneyler, kan kaynaklı patojenlere karşı mesleki maruz kalma koruması için kılavuz dahil olmak üzere ilgili yasalar ve kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi.

1. numune hazırlama

1. Mide kanseri dokularına (P0 = Passage 0) doğrudan operasyondan elde edilir. Tümör numunesi 0,5 cm³' ten büyük olmalıdır.
2. Hazırlamak 3-4 mL stok çözüm: Örneğin, RPMI-1640 Orta (1x) ile tamamlayıcı 10% fetal Sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin ve 0,1 mg/mL streptomisin.
3. Taze tümör numunesi 4 saat boyunca 4 °C ' de stok-solüsyona koyun.

2. PDX modelinin kurulması (Şekil 1)

1. Steril bir cerrahi alan sağlamak için, hayvan laboratuvarına transferden önce 30 dakikadan fazla ultraviyole ışığı olan tüm materyalleri dezenfekte edin.
   Not: operasyon odasının, 30 dakika boyunca ultraviyole ışık ile dezenfekte edilmesi gerekir, biz Dikloro isocyanurik asit sodyum suppositoria dezenfektan ile masa temizlemek önce. Sonra povidone-iyot cildi dezenfekte etmek için kullanılır.
2. Forseps ve makas kullanarak, dikkatle tümör dokularını incelemek ve birkaç küçük parçalar halinde onları kırpmak (yaklaşık 1 mm³ küpler) steril koşullarda.
3. Anestezi makinesi ile 1-1,5% Isoflurane maruz tarafından kadın 5-7 hafta-eski NOD-SCID-IL2rg (NSG) fareler anestezize.
   1. O mücadele durur ama hatta nefes tutar kadar fare anestezize.
      Not: 50 mL tüp bir anestezi makinesine benzer fonksiyonlar basit bir ekipmandir. Kısa çalışma süresi nedeniyle kuruluğu önlemek için veteriner göz merhem kullanımı gereksiz.
4. Steril makas kullanarak hem dorsal kanatlarda 1 cm kesi yapın ve fare her kanadında bir tümör parçası implanta.
   1. Tümör parçası dışarı kayma değil emin olmak için, subkutan doku bozmak için steril forseps kullanın. Sonra, tümör dokusu bir parça klip ve derin siteye yerleştirin.
5. İmplant alanını Cerrahi dikiş iğneleri ile subkutan sütür ile kapatın ve fare kulaklarını etiketli kulak etiketleriyle işaretleyin
6. Yarayı iyot ile sterilize edin.
7. Yavaşça ameliyat sonrası boş bir kafeste fareler yerleştirin sternal recumbency korurken. Fareler durumuna yakın dikkat; uyanıp yaklaşık 3-4 dakika sonra yürümeye başlar. Ameliyata tabi olmayan başka bir yeni kafeste ameliyat edilen fareler yerleştirin.
8. İmplantasyon sitesinin palpasyonu ile tümör boyutunu değerlendir. Haftada iki kez bir Vernier Kaliper ile tümörleri ölçün.
9. Tümör çapı 10 mm ulaştığında, hayvan durumu kötüleşir, ya da tümör ülserler, bir ıRB onaylı yöntemi ile fare ötenize. Taze tümör parçalarını, geçiş için 2 yeni fareye yerleştirin veya birincil hücre hatlarının izolasyonu için PBS 'de numuneleri geçici olarak depolayın.

3. doku ağoprezervasyon

Not: Bu bölüm öncelikle canlı doku kiti Cryo Kit yöntemleri başvuruyor. Ana Kit ve ekipmanlar malzeme tablosundalistelenmiştir.

1. Tümörün çapı 10 mm 'den büyük olduğunda, ıRB onaylı bir yöntem ile fareler ötenize.
2. Steril forseps ve makas kullanarak, yavaşça farelerden tümör izole.
3. 10 cm 'lik bir tabak içinde DPBS ile tümör dokularına yıkayın. Nekrotik alanları, yağ dokusu, kan pıhtıları ve forseps ve makas ile bağ dokusu sökme ve kaldırma.
4. Tümör dokularını bir kalıp ile maksimum 1 mm kalınlığına keser.
5. 10 cm 'lik bir tabak içinde DPBS ile dilimleri yıkayın.
   Not: vitrifikasyon işlemi 3.6-3.8 adımda v1/v2/v3 etiketli tüplerin kullanımını içerir. Ana maddeler DMSO ve sakaroz vardır.
6. Dilimleri forseps ile tüp v1 'e aktarın ve tüpü 4 °C için 4 ° c 'ye Inkümerleyin. tüpün kısa bir süreliğine yuvarlayın ve tersine çevirin ve 4 dakika daha 4 °C ' ye yerleştirin.
7. 10 cm çanak içine v1 çözüm ve dilimleri dökün. Dilimleri forseps ile tüp v2 içine aktarın ve 4 ° c için 4 °C ' de tüp v2 'yi Inküye. tüp kısa bir süreliğine yuvarlayın ve ters çevirin ve 4 dk. 4 °C ' ye yerleştirin.
8. 10 cm tabak içine v2 çözüm ve dilimleri dökün. Dilimleri forseps ile tüp v3 içine aktarın ve 5 dakika boyunca 4 °C ' de tüpün kulbatın. tüpün kısa bir süre içinde yuvarlayın ve ters çevirin ve en az 5 dakika boyunca 4 °C ' ye yerleştirin. dilimlerin tüm tüpün altına batırılmasını sağlayın.
   1. Birkaç dilim yüzen kalırsa, tüpü kısa bir süreliğine yuvarlayın ve ters çevirin ve tüm dilimler tamamen batırılana kadar tüpü 4 °C ' ye tekrar yerleştirin; gerekirse, yüzen dilimleri atın.
9. V3 solüsyonu ve dilimleri 10 cm 'lik bir çanak içine dökün.
10. Uygun uzunlukta doku tutucular kes ve steril gazlı bez üzerine yerleştirin. Dilimleri tutucular üzerine aktarın. Tutucular gazlı bez ile sarın ve onları forseps kullanarak sıvı azot içine yerleştirin, ardından 5 dakika boyunca kuluçç.
11. Kriyojenik şişeleri doku bilgileri ile etiketleyin.
12. Doku dilimleri ile tutucular, sıvı nitrojen içinde saklanan kriyojenik şişeleri içine aktarın.

4. Primer hücrelerin yalıtımı (Şekil 2)

1. 121 °C ' de 30 dakika yüksek basınçlı buharla forseps ve makas sterilize edin.
2. Mide kanseri örneklerini rezeke edilen örneklerden veya hasat edilen PDX dokularından reect. Dokuları buzun üzerine yerleştirin ve dokuları 10 cm steril kültür yemeğine aktarın.
3. Nekrotik alanları, yağ dokusu, kan pıhtıları ve forseps ve makas ile bağ dokusu sökme ve kaldırma.
4. 10 cm 'lik bir çanak içinde 100 U/mL penisilin ve 0,1 mg/mL streptomisin içeren DPBS ile tümör dokularına bir kez yıkayın.
5. Tümör dokusunu 1 mm³ adet çanak kapağında keser; Her parçanın maksimum kalınlığı 1 mm olmalıdır.
6. Yaklaşık 7 ml tip 1 kolajenaz ve tripsin (1:14) çözeltisi ile dokuları 50 ml santrifüjle tüpüne aktarın. Karışımı kısa bir süre Vortex.
7. Tüp bir su banyosunda 37 °C ' de 30-40 dk. her 5 dakikada bir karışımı Vortex.
8. Tüp için% 10 FBS ile tamamlayıcı RPMI-1640 Orta (1x) eşit hacim ekleyin. Karışımı iyice Vortex.
9. Bir 40 μm filtre ile yavaş filtrasyon ile yeni bir 50 mL santrifüj tüpü içine karışımı aktarın.
   Not: kanser hücrelerinin daha yüksek bir oranı sağlamak için 40 μm filtreler kullanın. Gerekirse, 100 μm filtreler immunolojik hücreler gibi daha fazla hücre türünü korumak için kullanılabilir.
10. Süzgecler 113-163 x g 'de 5-7 dk için RT 'de santrifüjler. dikkatle supernatant çıkarın.
11. PBS 5 ml ile Pelet yıkayın ve dikkatle supernatant çıkarın.
12. Pelet kırmızı ise, birçok eritrositler içerir. 500 μL kırmızı kan hücresi liziz tampon ile Pelet yavaşça yeniden pelletini. 5 dk inkübasyon sonra, 5 mL PBS ekleyin ve dikkatle supernatant kaldırın.
13. Kültür orta ile Pelet resuspend ve steril 10 cm çanak karışımı aktarın.
14. Orta her 2-3 gün serum içeren orta ile değiştirin.
15. Eğer% 50 Confluence ulaştığında Trypsin/EDTA kullanarak birincil hücreler Passage.

Sonuçlar

Burada, bir operasyondan tümör dokularında bir sonraki adıma kadar stok çözümde korunmuş. 4 saat içinde, tümör dokularında küçük parçalar halinde kesilmiş ve Isoflurane-ıslatılmış pamuk kullanılarak anestezize edilmiş NSG fareler dorsal kenar içine implante edildi. 1 cm 'den büyük tümörler, yeni farelere implantasyon için (Şekil 1) veya dikkatle dilimlenmiş ve protokol sonrasında sıvı nitrojen içinde korunmuş olabilir. Bu çalışmada, ilk nesil...

Tartışmalar

Mide kanseri, sınırlı terapötik seçeneklere sahip agresif bir hastalıktır; Böylece, mide kanseri modelleri klinik^4,8,17doğrudan çeviri ile işlevsel araştırma çalışmaları sağlamak için kritik bir kaynak haline gelmiştir. Burada, mide kanseri PDX modelleri ve primer hücre hatları kurma yöntemlerini ve protokolünü tarif ettik. Daha da önemlisi, gastrik kanser örneklerinin hem morfolojik hem de biyolojik ?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017