建立胃癌患者衍生异种移植模型和原细胞系

摘要

目前的协议描述了从外科胃癌样本中建立患者衍生异种移植(PDX)模型和原发性癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。

摘要

使用临床前模型来增进我们对肿瘤生物学的理解,并研究治疗剂的疗效是癌症研究的关键。虽然有许多既定的胃癌细胞系和许多传统的转基因小鼠模型用于临床前研究,但这些体外和体内模型的缺点限制了其应用。由于这些模型在文化中的特征已经改变,它们不再模拟肿瘤异质性,它们的反应也未能预测人类的反应。因此,正在开发更好地代表肿瘤异质性的替代模型。患者衍生的异种移植(PDX)模型保留了癌细胞的组织外观,保留了肿瘤内异质性,并更好地反映肿瘤微环境的相关人体成分。然而,开发PDX模型通常需要4-8个月,这比许多胃患者的预期存活时间更长。因此,建立原发性癌细胞系可能是药物反应研究的有效补充方法。目前的协议描述了从外科胃癌样本建立PDX模型和原发性癌细胞系的方法。这些方法为药物开发和癌症生物学研究提供了有用的工具。

引言

胃癌是全球第五大常见癌症,也是癌症死亡的第三大原因。2018年,全球新诊断出100万多例胃癌病例,估计有78.3万人死于此病。在东北亚国家,胃癌的发病率和死亡率^{仍然很高。}尽管在癌症治疗领域取得了显著进展,但晚期胃癌患者的预后仍然很差,五年生存率约为25%4,5,6 ^7,.因此,迫切需要制定治疗胃癌的新策略

胃癌的治疗具有挑战性,因为它具有很高的异质性8,9。因此,如何解决肿瘤异质性的挑战,实现精密医学是癌症研究的核心。体外和体内模型在阐明胃癌的异质机制和生物学中起着至关重要的作用。然而,虽然有许多胃癌细胞系和许多传统的转基因小鼠模型用于临床前研究,这些模型的缺点限制了其^应用10。由于这些模型在文化中的特征已经改变,它们不再模拟肿瘤异质性,它们的反应也未能预测人类^的反应。这些问题严重限制了确定癌症患者对靶向药物作出反应的子组的可能性。原发性肿瘤的短期培养为研究抗癌药理特性提供了一种相对快速和个性化的方法,这可能是个性化癌症治疗的标志。

患者衍生的异种移植物(PDXs)是药物反应^分析12的替代临床前模型的首选。此外,PDX模型为研究癌症的起始和进展提供了一个强大的工具13,14。PDX模型保留了癌细胞的组织外观,保留了肿瘤内异质性,并更好地反映肿瘤微环境的相关人体成分15、16。然而,广泛使用的PDX模型的局限性是建立和连续传播人类实体肿瘤的成功率较低。在这项研究中,描述了建立PDX模型和主细胞系的相当成功的方法。

研究方案

这项研究得到了中山大学癌症中心(中国广州SYSUCC)的制度伦理审查委员会的批准。动物研究得到了中山大学动物护理与使用委员会的批准。注:所有实验均符合相关法律和机构准则,包括《防止血液传播病原体的职业接触指南》。

1. 样品制备

1. 直接从手术中获得胃癌组织(P0 = 通道0)。肿瘤标本应大于0.5厘米3。
2. 制备3-4 mL的库存溶液:例如,RPMI-1640介质(1x)辅以10%胎儿牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和0.1毫克/mL链霉素。
3. 将新鲜肿瘤标本放入4°C的库存溶液中,时间不超过4小时。

2. 建立PDX模型(图1)

1. 为确保无菌手术区,在转移到动物实验室之前,用紫外线对所有材料进行30分钟以上的消毒。
   注:手术室需要用紫外线消毒30分钟,用二氯异氰酸钠消毒剂清洁办公桌。然后用小碘对皮肤进行消毒。
2. 使用钳子和剪刀,仔细解剖肿瘤组织,并在无菌条件下将它们切成几个小块(约1毫米3立方)。
3. 用麻醉机照射1-1.5%的极性胶合物,麻醉雌性5至7周大的NOD-SCID-IL2rg(NSG)小鼠。
   1. 麻醉鼠标,直到它停止挣扎,但保持均匀的呼吸。
      注:50 mL 管是一种简单的设备,其功能类似于麻醉机。由于手术时间短,没有必要使用兽眼软膏来防止干燥。
4. 使用无菌剪刀在两侧翼上切开1厘米,并将一块肿瘤植入小鼠的每个侧翼。
   1. 为了确保肿瘤片块不会滑出,使用无菌钳来破坏皮下组织。然后,夹住一块肿瘤组织,并将其放入深层部位。
5. 用手术缝合针关闭下皮缝合,用标记的耳标标记小鼠耳朵。
6. 用碘消毒伤口。
7. 手术后,在保持胸腔恢复的同时,轻轻地将小鼠放在空笼子里。密切注意小鼠的状况;他们醒来,开始步行约3-4分钟后。把接受手术的老鼠放在另一个新笼子里,从那些没有接受手术的笼子里分离出来。
8. 通过植入部位的触觉评估肿瘤大小。每周用Vernier卡钳测量肿瘤两次。
9. 一旦肿瘤达到10毫米直径,动物状况恶化,或肿瘤溃疡,用IRB批准的方法安乐死小鼠。重新植入收获的新鲜肿瘤片段到2只新小鼠中进行传体内,或将标本暂时储存在PBS的冰上,以分离原细胞系。

3. 组织冷冻保存

注:此部分主要参考活组织套件冷冻套件的方法。主要套件和设备列在材料表中。

1. 当肿瘤直径大于10毫米时,使用IRB批准的方法对小鼠实施安乐死。
2. 使用无菌钳子和剪刀,慢慢从小鼠中分离出肿瘤。
3. 在10厘米的菜盘中用DPBS清洗肿瘤组织。用钳子和剪刀解剖和去除坏死区、脂肪组织、血块和结缔组织。
4. 用模具将肿瘤组织切割到最大1毫米厚度。
5. 在 10 厘米的菜盘中用 DPBS 清洗切片。
   注: 在步骤 3.6-3.8 中,Vitited 过程涉及使用标有 V1/V2/V3 的管。主要成分是DMSO和蔗糖。
6. 将切片用钳子转移到管 V1 中,在 4°C 孵育管 4 分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于 4°C 再放置 4 分钟。
7. 将 V1 溶液倒入 10 厘米的盘中。将切片用钳子转移到管 V2 中,在 4°C 孵育管 V2 4 分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于 4°C 再放置 4 分钟。
8. 将 V2 溶液倒入 10 厘米的盘中。将切片用钳子转移到管V3中,在4°C下孵育管5分钟,滚动并短暂反转管,并将其置于4°C至少5分钟。确保切片全部沉入管底。
   1. 如果几个切片保持浮动,将管短暂滚动和反转,然后再次将管置于 4°C,直到所有切片完全下沉;如有必要,丢弃浮动切片。
9. 将 V3 溶液倒入 10 厘米的盘中。
10. 将组织支架切到适当的长度,并将其放在无菌纱布上。将切片转移到支架上。用纱布包裹支架,用钳子将其放入液氮中,然后孵育5分钟。
11. 用组织信息标记低温小瓶。
12. 将带有组织切片的支架转移到低温小瓶中,这些小瓶储存在液氮中。

4. 主细胞的隔离 (图2)

1. 在121°C下用高压蒸汽消毒钳子和剪刀30分钟。
2. 从切除的标本或收获的PDX组织中切除胃癌样本。将组织放在冰上,然后将组织转移到10厘米无菌培养皿中。
3. 用钳子和剪刀解剖和去除坏死区、脂肪组织、血块和结缔组织。
4. 在10厘米的菜盘中用含有100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的DPBS清洗肿瘤组织一次。
5. 将肿瘤组织切成1毫米3片,放在盘子的盖子上;每块的最大厚度应为 1 mm。
6. 将组织转移到50 mL离心管中,其中约7 mL为1型胶原酶和胰蛋白酶(1:14)溶液。短暂地涡旋混合物。
7. 在37°C的水浴中孵育管子30-40分钟。涡流每5分钟孵化一次。
8. 在管中加入相同体积的 RPMI-1640 介质 (1x), 并辅以 10% FBS。彻底涡旋混合物。
9. 通过 40 μm 过滤器缓慢过滤,将混合物转移到新的 50 mL 离心管中。
   注:使用40μm过滤器,以确保癌细胞的比例更高。如有必要,100 μm 过滤器可用于保留更多类型的细胞,如免疫细胞。
10. 在 RT 处将滤液在 113-163 x g下离心 5-7 分钟,小心地去除上清液。
11. 用 5 mL 的 PBS 清洗颗粒,并小心地去除上清液。
12. 如果颗粒是红色的,它含有许多红细胞。用500μL红细胞赖沙缓冲液轻轻重新悬浮颗粒。孵育5分钟后,加入5mL的PBS,并小心地去除上清液。
13. 用培养基重新悬浮颗粒,并将混合物转移到无菌的10厘米盘中。
14. 每2-3天用含血清的培养基替换培养基。
15. 当原细胞达到50%汇合时,使用胰蛋白酶/EDTA传递原细胞。

结果

在这里,肿瘤组织从手术被保存在库存溶液,直到下一步。在4小时内,肿瘤组织被切成小块,植入NSG小鼠的背侧,这些小鼠使用松草浸泡的棉花进行麻醉。大于1cm³的肿瘤可以被切除,植入新小鼠(图1),或按照协议小心切片并保存在液氮中。在这项研究中,第一代肿瘤的生长速度比后世的要慢,需要3周或更长时间才能达到适当的大小。第一代皮下肿瘤形成成功率大于80%。我们在?...

讨论

胃癌是一种具有攻击性的疾病,治疗选择有限;因此,胃癌模型已成为一个关键资源,使功能研究直接翻译到诊所4,8,17。在这里,我们描述了建立胃癌PDX模型和原细胞系的方法和协议。重要的是,胃癌标本的形态和生物学特征大多保留在PDX模型中。

在建立PDX模型的协议中,需要强调一些要点,以提高移植率。NSG(NOD-SCI...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017