Создание желудка рака пациента полученных Ксенотрансплантат Модели и первичные линии клеток

Резюме

Текущий протокол описывает методы для создания пациента полученных ксенотрансплантата (PDX) модели и первичных линий раковых клеток из хирургических образцов рака желудка. Методы являются полезным инструментом для разработки лекарственных средств и исследований биологии рака.

Аннотация

Использование доклинических моделей для продвижения нашего понимания биологии опухоли и исследования эффективности терапевтических агентов является ключом к исследованию рака. Хотя Есть много установленных линий клеток рака желудка и многие обычные трансгенные модели мыши для доклинических исследований, недостатки этих in vitro и in vivo модели ограничивают их применения. Поскольку характеристики этих моделей изменились в культуре, они больше не моделируют неоднородность опухоли, и их ответы не были в состоянии предсказать реакцию у людей. Таким образом, разрабатываются альтернативные модели, которые лучше отражают неоднородность опухолей. Модели ксенотрансплантата (PDX) пациента сохраняют гистологический вид раковых клеток, сохраняют внутриопухолевую неоднородность и лучше отражают соответствующие человеческие компоненты микроокружения опухоли. Тем не менее, это обычно занимает 4-8 месяцев, чтобы разработать модель PDX, которая больше, чем ожидалось выживание многих желудочных пациентов. По этой причине, создание первичных линий раковых клеток может быть эффективным дополнительным методом для исследования ответных препаратов. Текущий протокол описывает методы создания моделей PDX и первичных линий раковых клеток из хирургических образцов рака желудка. Эти методы являются полезным инструментом для разработки лекарственных средств и исследований биологии рака.

Введение

Рак желудка является пятым наиболее распространенным раком во всем мире и третьей по значимости причиной смерти от рака. В 2018 году в мире было диагностировано более 1 000 000 новых случаев рака желудка, и, по оценкам, 783 000 человек были убиты этим заболеванием¹. Заболеваемость и смертность от рака желудка остаются очень высокими в северо-восточных азиатских странах^2,3. Несмотря на значительный прогресс в области терапии рака, прогноз пациентов с прогрессирующим раком желудка остается плохим, с пятилетней выживаемости около 25%^{4,5,6, 7,}. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке новых терапевтических стратегий для лечения рака желудка

Лечение рака желудка является сложной задачей из-за его высокой неоднородности^8,9. Таким образом, вопрос о том, как решать проблемы неоднородности опухоли для реализации точной медицины имеет центральное значение для исследований рака. Модели In vitro и in vivo играют решающую роль в выяснении неоднородных механизмов и биологии рака желудка. Однако, хотя Есть многочисленные линии раковых клеток желудка и многие обычные трансгенные модели мыши для доклинических исследований, недостатки этих моделей ограничить их применения¹⁰. Поскольку характеристики этих моделей изменились в культуре, они больше не моделируют неоднородность опухоли, и их ответы не смогли предсказать реакции у людей^11. Эти вопросы серьезно ограничивают возможность выявления подгрупп онкологических больных, которые будут реагировать на целевые препараты. Краткосрочная культура первичных опухолей обеспечивает относительно быстрый и персонализированный способ исследования противораковых фармакологических свойств, которые, вероятно, будут отличительной чертой персонализированного лечения рака.

Пациент производные ксенотрансплантаты (PDXs) являются предпочтительными в качестве альтернативной доклинической модели для наркотиков ответ профилирования¹². Кроме того, модели PDX предлагают мощный инструмент для изучения инициации и прогрессирования рака^13,14. Модели PDX сохраняют гистологический облик раковых клеток, сохраняют внутриопухолевую неоднородность и лучше отражают соответствующие человеческие компоненты микроокружения опухоли^15,16. Тем не менее, ограничение широко используемых моделей PDX является низкий уровень успеха для создания и последовательного распространения человеческих твердых опухолей. В этом исследовании описаны прилично успешные методы создания моделей PDX и первичных клеточных линий.

протокол

Это исследование человека было одобрено Институциональной этики Обзор совета Сунь Ятсен университета онкологический центр (SYSUCC, Гуанчжоу, Китай). Исследование на животных было одобрено Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Университета Сунь Ятсена. Примечание: все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими законами и институциональными руководящими принципами, включая Руководство по защите от воздействия на профессиональные произобина от патогенов, передающихся через кровь.

1. Подготовка образца

1. Получить ткани рака желудка (P0 и проход 0) непосредственно от операции. Образец опухоли должен быть больше0,5 см 3.
2. Приготовьте 3-4 мл запасного раствора: например, RPMI-1640 средний (1x) дополнен 10% сыворотки крупного рогатого скота плода (FBS), 100 U/mL пенициллина и 0,1 мг/мл стрептомицина.
3. Положите свежий образец опухоли в бульон-раствор при 4 градусах по Цельсию в течение не более 4 часов.

2. Создание модели PDX(Рисунок 1)

1. Для обеспечения стерильной хирургической области, дезинфицировать все материалы с ультрафиолетовым светом в течение более 30 минут до передачи в лабораторию животных.
   Примечание: операционный зал необходимо дезинфицировать ультрафиолетовым светом в течение 30 минут, прежде чем мы очистим стол с dichloro изоцианурической кислоты натрия suppositoria дезинфицирующее средство. Затем для дезинфекции кожи используется повидон-йод.
2. Используя щипцы и ножницы, тщательно вскрыть ткани опухоли и обрезать их на несколько небольших кусочков (примерно 1 мм³ куба) в стерильных условиях.
3. Анестезия женщин от 5 до 7 недель NOD-SCID-IL2rg (NSG) мышей при контакте с 1-1,5% изофруран с анестезией машины.
   1. Анестезия мыши, пока он не перестает бороться, но поддерживает даже дыхание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трубка 50 мл является простым оборудованием, которое функционирует подобно анестезии машины. Использование ветеринарной глазной мази для предотвращения сухости не нужно из-за короткого времени операции.
4. Сделайте разрез на 1 см на обоих боковых флангах с помощью стерильных ножниц и имплантируете по одной части опухоли в каждый фланг мыши.
   1. Чтобы убедиться, что опухоль кусок не выскользнуть, используйте стерильные щипчинки, чтобы нарушить подкожной ткани. Затем закрепите кусок опухолевой ткани и поместите его в глубокий участок.
5. Закройте область имплантата подкожным швом хирургическими швами и отметьте уши мыши помеченными ушами для ушей
6. Стерилизовать рану йодом.
7. Аккуратно поместите мышей в пустую клетку после операции, сохраняя при этом строгое recumbency. Обратите пристальное внимание на состояние мышей; они просыпаются и начинают ходить примерно через 3-4 минуты. Поместите мышей, которые перенесли операцию в другой новой клетке, отделенной от тех, кто не подвергся операции.
8. Оцените размер опухоли путем пальпации места имплантации. Измерьте опухоли с помощью калипера Вернье два раза в неделю.
9. Как только опухоль достигает 10 мм в диаметре, состояние животных ухудшается, или опухоли язвы, эвтаназии мыши с IRB утвержденный метод. Реимплантированный собранный свежие фрагменты опухоли в 2 новых мышей для прохода, или временно хранить образцы в PBS на льду для изоляции первичных клеточных линий.

3. Криоконсервация тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть в первую очередь ссылки на методы для Live Tissue Kit Cryo Kit. Основные комплекты и оборудование перечислены в таблицематериалов.

1. Эвтанизировать мышей с IRB утвержденный метод, когда опухоль больше, чем 10 мм в диаметре.
2. Используя стерильные щипцы и ножницы, медленно изолировать опухоль от мышей.
3. Вымойте опухолевые ткани DPBS в 10 см блюдо. Вскрыть и удалить некротические области, жировую ткань, сгустки крови и соединительной ткани с помощью щипцы и ножницы.
4. Вырежьте опухолевые ткани до максимальной толщины 1 мм с помощью плесени.
5. Вымойте ломтики с DPBS в 10 см блюдо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс витрификации включает в себя использование труб окнов с пометкой V1/V2/V3 в шагах 3.6-3.8. Основными ингредиентами являются DMSO и сахароза.
6. Перенесите ломтики в трубку V1 с щипцами, и инкубировать трубку при 4 кв к в течение 4 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 КК еще на 4 мин.
7. Налейте раствор V1 и ломтиками в 10 см блюдо. Перенесите ломтики в трубку V2 с щипцами, и инкубировать трубку V2 при 4 кв КС в течение 4 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 КК еще на 4 мин.
8. Налейте раствор V2 и ломтиками в 10 см блюдо. Перенесите ломтики в трубку V3 с щипцами, и инкубировать трубку при 4 кв к в течение 5 мин. Roll и инвертировать трубку кратко, и поместите его на 4 кв КС, по крайней мере 5 мин. Убедитесь, что ломтики все раковина в нижней части трубки.
   1. Если несколько ломтиков остаются плавающими, свернуть и инвертировать трубку кратко, и поместите трубку на 4 градусов по Цельсию снова, пока все ломтики раковина полностью; при необходимости отбросьте плавающие ломтики.
9. Налейте раствор V3 и ломтиками в 10 см блюдо.
10. Разрежьте держатели ткани до нужной длины, и поместите их на стерильную марлю. Перенесите ломтики на держатели. Оберните держатели марлей, и поместите их в жидкий азот с помощью щипцы, а затем инкубации в течение 5 минут.
11. Пометьте криогенные флаконы информацией о тканях.
12. Переносите держатели с ломтиками ткани в криогенные флаконы, которые хранятся в жидком азоте.

4. Изоляция первичных клеток(рисунок 2)

1. Стерилизовать щипцы и ножницы с пара высокого давления при 121 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
2. Резконизм образцов рака желудка из резецированных образцов или собранных тканей PDX. Поместите ткани на лед, а затем, перенесите ткани в 10 см стерильной культуры блюдо.
3. Вскрыть и удалить некротические области, жировую ткань, сгустки крови и соединительной ткани с помощью щипцы и ножницы.
4. Вымойте опухолевые ткани один раз с DPBS, содержащим 100 U/mL пенициллина и 0,1 мг /мЛ стрептомицина в 10 см блюдо.
5. Разрежьте опухолевую ткань на 1 мм³ кусочками на крышке тарелки; максимальная толщина каждого куска должна сосупрозаться 1 мм.
6. Перенесите ткани в центрифугу мощностью 50 мл с коллагенеза типа 1 и раствором трипсина (1:14). Vortex смесь кратко.
7. Инкубировать трубку на водяной бане при 37 градусах по Цельсию в течение 30-40 мин. Vortex смесь каждые 5 минут.
8. Добавьте в трубку равный объем rpMI-1640 среднего (1x), дополненного 10% FBS. Vortex смесь тщательно.
9. Перенесите смесь в новую центрифугу мощностью 50 мл путем медленной фильтрации через фильтр мощностью 40 мкм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 40 мкм фильтры для обеспечения более высокого соотношения раковых клеток. При необходимости, 100 мкм фильтры могут быть использованы для сохранения более типов клеток, таких как иммунологические клетки.
10. Центрифуга фильтратов на 113-163 х г в течение 5-7 мин на RT. Осторожно удалить супернатант.
11. Вымойте гранулы с 5 мл PBS, и осторожно удалить супернатант.
12. Если гранулы красные, он содержит много эритроцитов. Аккуратно приостановите гранулы с 500 зл и сыт ный буфер лиза крови. После 5 мин инкубации, добавить 5 мл PBS, и осторожно удалить супернатант.
13. Принесите гранулы с помощью культуры среды и перенесите смесь в стерильную 10-сантиметровую тарелку.
14. Замените среду сыворотки-содержащей средой каждые 2-3 дня.
15. Проход первичных клеток с помощью трипсина / EDTA, когда они достигают 50% слияния.

Результаты

Здесь опухолевые ткани от операции сохранились в стоковом растворе до следующего шага. В течение 4 часов опухолевые ткани были разрезаны на мелкие кусочки и имплантированы в составных флангов мышей NSG, которые были обезожжены с помощью пропитанного изофровамих хлопка. Опухоли размером...

Обсуждение

Рак желудка является агрессивным заболеванием с ограниченными терапевтическими возможностями; Таким образом, модели рака желудка стали критическим ресурсом для обеспечения функциональных исследований с прямым переводом в клинику^4,8,17

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017