הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות כדי ליצור מודלים של מטופלים שנגזר על המטופל (PDX) ושורות של תאים סרטניים העיקרי מדגימות סרטן הקיבה כירורגית. השיטות מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

Abstract

השימוש במודלים פרה-קליניים כדי לקדם את הבנתנו את הביולוגיה של הגידול ולחקור את היעילות של הסוכנים הטיפוליים הוא מפתח לחקר הסרטן. למרות שיש הרבה מבוססת סרטן קיבה מבוסס קווי ומודלים רבים של העכבר טרנסגניים קונבנציונאלי למחקר טרום קליני, החסרונות של אלה בתוך מבחנה במודלים vivo להגביל את היישומים שלהם. בגלל המאפיינים של מודלים אלה השתנו בתרבות, הם כבר לא מודל הגידול טרוגניות, ואת התגובות שלהם לא הצליחו לחזות את התגובות בני אדם. כך, מודלים חלופיים שמייצגים טוב יותר את טרוגניות הגידול מפותחים. המטופל נגזר מבע (pdx) מודלים לשמר את המראה היסטולוגית של תאים סרטניים, לשמור על טרוגניות intratumoral, וטוב יותר לשקף את הרכיבים האנושיים הרלוונטיים של מיקרוסביבה הגידול. עם זאת, זה בדרך כלל לוקח 4-8 חודשים כדי לפתח מודל PDX, אשר ארוך יותר ההישרדות הצפויה של חולי קיבה רבים. מסיבה זו, הקמת קווי התאים הראשוניים לסרטן עשויה להיות שיטה משלימה אפקטיבית ללימודי תגובה לסמים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות להקמת מודלים PDX ושורות של תאים סרטניים העיקרי של סרטן כירורגי הקיבה דגימות. שיטות אלה מספקות כלי שימושי לפיתוח סמים וחקר ביולוגיה של הסרטן.

Introduction

סרטן קיבה הוא החמישי הנפוץ ביותר בעולם הסרטן הגורם המוביל השלישי למוות בסרטן. ב 2018, מעל 1,000,000 מקרים חדשים של סרטן קיבה אובחנו ברחבי העולם, ו מוערך 783,000 אנשים נהרגו על ידי מחלה זו¹. השכיחות והתמותה של סרטן הקיבה להישאר גבוה מאוד במדינות אסיה הצפון מזרחי^2,3. למרות התקדמות משמעותית בתחום של סרטן therapeutics, הפרוגנוזה של חולים עם סרטן קיבה מתקדם נשאר עני, עם שיעור ההישרדות של חמש שנים של כ 25%^{4,5,6, 7,}. כך, יש צורך דחוף לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן קיבה

הטיפול בסרטן קיבה הוא מאתגר בשל טרוגניות גבוהה שלה^8,9. כך, השאלה כיצד להתמודד עם האתגרים של טרוגניות הגידול כדי להגשים את הרפואה המדויקת היא מרכזית לחקר הסרטן. בתוך מבחנה במודלים vivo לשחק תפקידים מכריעים בהסבר המנגנונים הטרוגנית וביולוגיה של סרטן הקיבה. עם זאת, למרות שיש מספר רב של סרטן קיבה קווי מודלים רבים העכבר הטרנסגניים הקונבנציונלית למחקר טרום קליני, החסרונות של המודלים האלה להגביל את היישומים שלהם¹⁰. בגלל המאפיינים של מודלים אלה השתנו בתרבות, הם כבר לא מודל הגידול טרוגניות, ואת התגובות שלהם לא הצליחו לחזות את התגובות בני אדם¹¹. סוגיות אלה מגבילות באופן חמור את האפשרות לזהות קבוצות מסוימות של חולי סרטן שיגיבו לתרופות ממוקדות. התרבות לטווח קצר של גידולים ראשוניים מספק דרך מהירה יחסית ואישית כדי לחקור את התכונות הפרמקולוגית של סרטן, אשר צפוי להיות סימן ההיכר של טיפול בסרטן אישית.

המטופל-xenografts (PDXs) מעדיפים כמודל טרום-קליני חלופי לפרופיל תגובת התרופה¹². בנוסף, מודלים pdx מציעים כלי רב עוצמה עבור לימוד ייזום והתקדמות של סרטן^13,14. Pdx מודלים לשמר את המראה היסטולוגית של תאים סרטניים, לשמור על intrאטומוראלית טרוגניות, וטוב יותר לשקף את הרכיבים האנושיים הרלוונטיים של מיקרוסביבה הגידול^15,16. עם זאת, המגבלה של מודלים בשימוש נרחב PDX הוא שיעור ההצלחה הנמוכה להקמת והפצת באופן סדרתי גידולים מוצק אנושי. במחקר זה, שיטות מוצלחות מאוד להקמת דגמי PDX וקווי התא הראשי מתוארים.

Protocol

זה מחקר אנושי אושרה על ידי האתיקה המוסדית הוועדה של אוניברסיטת סון יאט-סן סרטן המרכז (SYSUCC, גואנגג'ואו, סין). המחקר בעלי חיים אושר על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועדת השימוש של אוניברסיטת סון יאט-סן. הערה: כל הניסויים בוצעו בהתאם לחוקים הרלוונטיים ולהנחיות המוסדיים, כולל ההנחיה להגנה על החשיפה התעסוקתית מפני פתוגנים הנישאים בדם.

1. הכנה לדוגמא

1. להשיג רקמות סרטן קיבה (P0 = מעבר 0) ישירות מהפעולה. הדגימה צריך להיות גדול יותר מ 0.5 ס"מ³.
2. הכינו 3-4 mL של פתרון מניות: לדוגמה, RPMI-1640 בינונית (1x) שיושלם עם 10% סרום פרה עוברי (FBS), 100 U/mL ו 0.1 mg/mL סטרפטומיצין.
3. הכניסו את הדגימה הטרייה של הגידול בתמיסה המניה ב -4 ° c במשך לא יותר מ -4 שעות.

2. הקמת מודל PDX (איור 1)

1. כדי להבטיח אזור כירורגי סטרילי, לחטא את כל החומרים עם אור אולטרה סגול עבור יותר מ 30 דקות לפני העברת לתוך המעבדה בעלי חיים.
   הערה: חדר המבצע צריך להיות מחוטא עם אור אולטרה סגול עבור 30 דקות, לפני שאנחנו לנקות את השולחן עם החומצה של dichloro isocyanuric חטא נתרן. ואז povidone-יוד משמש כדי לחטא את העור.
2. באמצעות מלקחיים ומספריים, בזהירות לנתח את רקמות הגידול לקצץ אותם לכמה חתיכות קטנות (כ 1 מ"מ³ קוביות) בתנאים סטרילי.
3. האישה הזאת, 5 עד 7 שבועות בנוד-SCID-IL2rg (NSG) עכברים על ידי חשיפה ל -1-1.5% isofלוריאן עם מכונת הרדמה.
   1. הניחו את העכבר עד שיפסיק להיאבק, אך תחזק אפילו נשימה.
      הערה: שפופרת 50 mL הוא ציוד פשוט שמתפקד דומה למכונה הרדמה. השימוש במשחה העין הוטרינרית כדי למנוע יובש אינו נחוץ עקב זמן פעולה קצר.
4. לעשות חתך 1 ס מ על שני האגפים באמצעות מספריים סטרילי, והשתל פיסת הגידול אחד לתוך כל אגף של העכבר.
   1. כדי להבטיח את פיסת הגידול לא להחליק החוצה, השתמש מלקחיים סטרילי לשבש את הרקמה התת עורית. ואז, לחתוך פיסת רקמת הגידול, ולמקם אותו לתוך האתר העמוק.
5. סגור את אזור השתל על ידי תפר תת עורית עם מחטים תפר כירורגי, ולסמן את האוזניים עם תגי האוזן מתויג
6. . חטא את הפצע ביוד
7. בעדינות למקם את העכברים בכלוב ריק לאחר הניתוח תוך שמירה על שכיבה משנית. שימו לב למצב העכברים; הם מתעוררים ומתחילים ללכת כ 3-4 דקות מאוחר יותר. הניחו עכברים שעברו ניתוח בכלוב חדש אחר הופרדו מאלו שלא נחשפו לניתוח.
8. להעריך את גודל הגידול על ידי. מישוש של אתר ההשתלה למדוד את הגידולים עם קליבר פעמיים בשבוע.
9. לאחר הגידול מגיע 10 מ"מ בקוטר, מצב בעלי חיים מחמיר, או הגידול כיבית, המתת החסד של העכבר עם שיטת IRB אושרה. השתלה מחדש שנקטפו שברי הגידול טרי לתוך 2 עכברים חדשים עבור passaging, או באופן זמני לאחסן את הדגימות ב-PBS על הקרח לבידוד של קווי התא הראשי.

3. הקפאה רקמות

הערה: חלק זה מתייחס בעיקר לשיטות הפעולה של ערכת רקמות חי. הקיטים והציוד העיקריים מפורטים בטבלת החומרים.

1. המתת חסד העכברים עם שיטת IRB שאושרו כאשר הגידול גדול מ 10 מ"מ בקוטר.
2. באמצעות מלקחיים ומספריים סטריליים, לבודד באיטיות את הגידול מן העכברים.
3. לשטוף את רקמות הגידול עם DPBS בצלחת 10 ס מ. לנתח ולהסיר שטחים נקרופטיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמת חיבור עם מלקחיים ומספריים.
4. חותכים את רקמות הגידול לעובי 1 מ"מ מקסימום עם עובש.
5. לשטוף את הפרוסות עם DPBS בצלחת 10 ס מ.
   הערה: התהליך הויטריפיקציה כרוך בשימוש בצינורות המסומנים ב-V1/V2/V3 בשלבים 3.6-3.8. המרכיבים העיקריים הם DMSO ו סוכרוז.
6. להעביר את הפרוסות לתוך הצינור V1 עם מלקחיים, ו לדגירה את הצינור ב 4 ° c עבור 4 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור 4 דקות נוספות.
7. יוצקים את הפתרון V1 ופרוסות לתוך 10 ס מ צלחת. העבר את הפרוסות לתוך הצינור V2 עם מלקחיים, ו-הרכבת התחתית מודטה V2 ב-4 ° c עבור 4 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור 4 דקות נוספות.
8. יוצקים את הפתרון V2 ופרוסות לתוך צלחת 10 ס מ. להעביר את הפרוסות לתוך הצינור V3 עם מלקחיים, ו מודג את הצינור ב 4 ° c עבור 5 דקות. לגלגל ולהפוך את הצינור בקצרה, ולמקם אותו ב 4 ° c עבור לפחות 5 דקות. ודא שהפרוסות כולן מסתכמות בתחתית השפופרת.
   1. אם מספר פרוסות נשארות מרחפות, מסתכמות ומהיפוך את הצינורית בקצרה, ומניחים את הצינור ב-4 ° c שוב עד שכל הפרוסות מטביעים לחלוטין; אם יש צורך בכך, מחק את הפרוסות הצפות.
9. יוצקים את הפתרון V3 ופרוסות לצלחת 10 ס מ.
10. חותכים את מחזיקי הרקמה לאורך הנכון, ומניחים אותם על גזה סטרילית. העבירו את הפרוסות למחזיקי המחשב. לעטוף את הפמוטים עם גזה, ולמקם אותם בחנקן נוזלי באמצעות מלקחיים, ואחריו דגירה עבור 5 דקות.
11. תייג את מבחנות הקריוגניים. עם מידע על הרקמה
12. להעביר את הפמוטים עם פרוסות רקמה לתוך מבחנות קריוגניים, אשר מאוחסנים חנקן נוזלי.

4. בידוד תאים ראשוניים (איור 2)

1. לעקר מלקחיים ומספריים עם קיטור בלחץ גבוה ב 121 ° c עבור 30 דקות.
2. לכרות דגימות סרטן קיבה מתוך דגימות מחדש או שנקטפו רקמות PDX. הניחו את הרקמות על הקרח ולאחר מכן העבירו את הרקמות לצלחת תרבותית של 10 ס מ.
3. לנתח ולהסיר שטחים נקרופטיים, רקמת שומן, קרישי דם ורקמת חיבור עם מלקחיים ומספריים.
4. לשטוף את רקמות הגידול פעם עם DPBS המכיל 100 U/mL פניצילין 0.1 mg/mL סטרפטומיצין בצלחת 10 ס מ.
5. חותכים את רקמת הגידול לתוך 1 מ"מ³ חתיכות על המכסה של המנה; עובי המקסימום של כל חתיכה צריך להיות 1 מ"מ.
6. להעביר את הרקמות לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL עם כ 7 מ ל מסוג 1 הקולגנאז ו טריפסין (1:14) פתרון. מערבולת את התערובת לזמן קצר.
7. מודקון את הצינור באמבט מים ב 37 ° c עבור 30-40 דקות. מערבולת התערובת כל 5 דקות.
8. הוסף נפח שווה של RPMI-1640 בינונית (1x) בתוספת 10% FBS לצינור. מערבולת את התערובת ביסודיות.
9. להעביר את התערובת לתוך שפופרת חדשה 50 mL של צנטריפוגה על ידי סינון איטי דרך מסנן 40 יקרומטר.
   הערה: השתמש במסננים 40 יקרומטר כדי להבטיח יחס גבוה יותר של תאים סרטניים. במקרה הצורך, ניתן להשתמש במסנני 100 יקרומטר כדי לשמר סוגים נוספים של תאים, כגון תאים אימונולוגיים.
10. צנטריפוגה את filtrates ב 113-163 x g עבור 5-7 דקות ב RT. בזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
11. שטוף את הגלולה עם 5 מ ל של PBS, ובזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
12. אם הגלולה אדומה, הוא מכיל הרבה אריתרופוציטים. השהה מחדש בעדינות את הגלולה עם 500 μL של מאגר פירוק של תא דם אדום. לאחר הדגירה 5 דקות, להוסיף 5 מ ל PBS, ובזהירות להסיר את הסופרנטאנט.
13. השהה מחדש את הגלולה עם בינונית תרבותית, והעבר את התערובת לצלחת 10 ס מ סטרילית.
14. החליפו את המדיום עם המדיום המכיל סרום כל 2-3 ימים.
15. העבר את התאים העיקריים באמצעות טריפסין/EDTA כאשר הם מגיעים 50% המפגש.

תוצאות

כאן, רקמות הגידול מפעולה נשמרו בפתרון מניות עד לשלב הבא. בתוך 4 שעות, רקמות הגידול נחתכו לחתיכות קטנות מושתל לתוך האגפים הקטנים של עכברים NSG כי היה מורדם באמצעות כותנה שספוגה isofלוריאן. גידולים גדולים יותר 1 ס"מ³ יכול להיות resected עבור השרשה לתוך עכברים חדשים (איור 1) או לפר?...

Discussion

סרטן קיבה היא מחלה אגרסיבית עם אפשרויות טיפוליות מוגבלות; thus, מודלים של סרטן קיבה הפכו משאב קריטי כדי לאפשר לימודי מחקר פונקציונלי עם תרגום ישיר למרפאה^4,8,17. כאן, יש לנו לתאר את השיטות ואת הפרוטוקול של יצירת סרטן קיבה מודלים PDX וקווי התא הרא?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 μm Cell Strainer	Biologix, Shandong, China	15-1040
Biological Microscope	OLYMPUS, Tokyo, Japan	OLYMPUS CKX41
Centrifuge	Eppendorf, Mittelsachsen, Germany.	5427R
CO2 Incubator	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	HERACELL 150i
DPBS	Basalmedia Technology, Shanghai, China	L40601
Electro-Thermostatic Water Cabinet	Yiheng, Shanghai, China	DK-8AXX
Fetal bovine serum	Wisent Biotechnology, Vancouver, Canada	86150040
Isoflurane	Baxter, China	CN2L9100
Live Tissue Kit Cryo Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2601
Live Tissue Thaw Kit	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2602
NSG	Biocytogen, Beijing, China	B-CM-002-4-5W
Penicilin&streptomycin	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	15140122
Red blood cell lysis buffer	Solarbio, Beijing, China	R1010
RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	8118367
Surgical Suture Needles with Thread	LingQiao, Ningbo, China	3/8 arc 4×10
Tissue-processed molds and auxiliary blades	Celliver Biotechnology, Shanghai, China	LT2603
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	2003779
Type 1 collagenase	Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, California, USA	17100017