JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة قابلة للاستنساخ لعزل الخلايا الأولية لالروماتيزم الفأر، وتشكيل الأورام وعلاجها، وزرع الطعوم بدءاً من ثقافات الأورام.

Abstract

الساركوما الروماتيزمية (RMS) هي ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعًا لدى الأطفال. وعلى الرغم من أن الجهود الكبيرة قد مكنت من تحديد الطفرات الشائعة المرتبطة بـ RMS وسمحت بالتمييز بين مختلف الأنواع الفرعية لـ RMS، لا تزال هناك تحديات كبيرة أمام تطوير علاجات جديدة لزيادة تحسين التكهن. على الرغم من أن تحديدها من خلال التعبير عن علامات myogenic، لا يزال هناك جدل كبير حول ما إذا كان RMS لديه أصول myogenic أو غير myogenic، كما خلية المنشأ لا يزال غير مفهومة بشكل جيد. في هذه الدراسة، يتم توفير طريقة موثوق بها للبفحص الورم للماوس RMS. ويستند هذا القول على الخصائص الوظيفية للخلايا السرطانية ويسمح بتحديد السكان النادرين في الورم مع وظائف الورم. كما تم وصف إجراءات اختبار البروتينات المؤتلفة، ودمج بروتوكولات التغوط مع فحص محيط الأورام، وتقييم الجينات المرشحة المشاركة في تطوير الورم والنمو. كما هو موضح هو إجراء لزرع الطعوم من الأورام في الفئران المتلقية للتحقق من وظيفة الورم في الجسم الحي. بشكل عام، تسمح الطريقة الموصوفة بتحديد واختبار السكان النادرين في RMS التي يمكن تطبيقها على RMS الناشئة في سياقات مختلفة. وأخيرا، يمكن استخدام البروتوكول كمنبر لفحص المخدرات والتطوير المستقبلي للعلاجات.

Introduction

السرطان هو مرض غير متجانس. وعلاوة على ذلك، فإن نفس النوع من الورم يمكن أن يقدم طفرات جينية مختلفة في مختلف المرضى، وداخل المريض يتكون الورم من مجموعات متعددة من الخلايا1. ويشكل عدم التجانس تحديا في تحديد الخلايا المسؤولة عن بدء انتشار السرطان، ولكن توصيفها ضروري لتطوير علاجات فعالة. فكرة نشر الخلايا الورم (TPC)، وهي مجموعة نادرة من الخلايا التي تسهم في تطوير الورم، وقد تم استعراضها سابقا على نطاق واسع2. على الرغم من حقيقة أن TPCs قد تميزت في أنواع متعددة من السرطان، وتحديد علامات لعزلتها موثوق بها لا يزال تحديا لعدة أنواع الورم3،4،5،6 , 7 , 8 , 9. وهكذا، يمكن تطبيق طريقة لا تعتمد على العلامات الجزيئية ولكن بدلا من ذلك على خصائص وظيفية TPC (التجديد الذاتي عالية والقدرة على النمو في ظروف منخفضة المرفق)، والمعروفة باسم اختبار تشكيل الورم، على نطاق واسع ل تحديد TPCs من معظم الأورام. الأهم من ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم هذا الفحص لتوسيع TPCs وبالتالي تطبق مباشرة على فحص المخدرات السرطان والدراسات على مقاومة السرطان1،10.

الساركوما الروماتيزمية (RMS) هو شكل نادر من ساركوما الأنسجة الرخوة الأكثر شيوعا في الأطفال الصغار11. Althoug RMS يمكن تحديدها من الناحية النسيجية من خلال تقييم التعبير عن علامات myogenic، لم يتم وصف خلية أصل RMS بشكل أحادي الصوت بسبب الأنواع الفرعية الورم متعددة وعدم تجانس عالية من المحفزات التنموية الورم. في الواقع، وقد ولدت الدراسات الحديثة مناقشة علمية هامة حول ما إذا كان RMS هو من أصول myogenic أو غير myogenic، مما يشير إلى أن RMS قد تستمد من أنواع الخلايا المختلفة اعتمادا على السياق12،13، 14 سنة , 15 , 16 سنة , 17. وقد أجريت دراسات عديدة على خطوط الخلايا RMS باستخدام اختبار تشكيل الورم لتحديد المسارات المشاركة في تطوير الورم وتوصيف علامات المرتبطة السكان التجديد الذاتي للغاية 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21.

ومع ذلك، على الرغم من إمكانية اختبار تشكيل محيط الورم لتحديد خلايا RMS المنشأ، لم يتم بعد وصف طريقة موثوق بها التي يمكن استخدامها على خلايا RMS الأولية. في هذا السياق، استخدمت دراسة حديثة من مجموعتنا فحص تشكيل الورم الأمثل لتحديد خلايا RMS المنشأ في ضمور العضلات دوشين (DMD) نموذج الماوس22. يتم اختبار أنواع متعددة من الخلايا قبل الورم، معزولة عن أنسجة العضلات، لقدرتها على النمو في ظروف منخفضة التعلق، مما يسمح بتحديد الخلايا الجذعية العضلية كخلايا المنشأ لRMS في سياقات عسر التغذية. يوصف هنا هو بروتوكول قابل للاستنساخ وموثوق بها لتصور تشكيل الورم (الشكل 1)، والتي تم استخدامها بنجاح لتحديد مجموعات الخلايا النادرة للغاية التي هي المسؤولة عن تطوير RMS الماوس.

Protocol

تم تنفيذ السكن والعلاج والتضحية من الفئران بعد بروتوكول IACUC المعتمدة من معهد سانفورد برنهام Prebys الطبية ديسكفري.

1. إعداد الكاشف

  1. إعداد 100 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية: F10 المتوسطة تستكمل مع 10٪ مصل الحصان (HS).
  2. إعداد 50 مل من حل الكولاجين النوع الثاني: حل 1 غرام من مسحوق الكولاجين من النوع الثاني في 50 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية (لاحظ وحدات الإنزيم لكل 1 مل من وسائل الإعلام، منذ عدد الوحدات يتغير اعتمادا على الكثير). Aliquot الحل وتخزينها في الفريزر -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: يجب اختبار كل الكثير من الكولاجين قبل الاستخدام، لأن نشاط الإنزيم قد يتغير عبر الكثير مختلفة.
  3. إعداد 10 مل لكل عينة من محلول الهضم الثاني: الخلايا عزل وسائل الإعلام مع 100 وحدة / مل من حل الكولاجين النوع الثاني و 2 وحدات / مل من dispase الثاني المرجحة حديثا. استعد واجهزه مباشرة قبل الاستخدام.
  4. إعداد 500 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام: DMEM الجلوكوز عالية تستكمل مع 20٪ FBS و 1٪ القلم / العقدية.
  5. إعداد 500 مل من المخزن المؤقت FACS: 1X PBS تستكمل مع 2.5٪ الخامس / الخامس مصل الماعز العادي و 1 MM EDTA.
  6. إعداد 500 مل من وسائل الإعلام الأورام: DMEM / F12 تستكمل مع 1٪ القلم / العقدية. قبل الاستخدام مباشرة، إضافة عوامل النمو التالية: 1٪ N2 الملحق، 10 نانوغرام/مل EGF، و 10 نانوغرام/مل β-FGF.

2- عزل الخلايا وثقافتها

  1. إعداد لوحة 10 سم تحتوي على 5 مل من الخلايا عزل وسائل الإعلام (لوحة واحدة لكل عينة الورم) ووضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية حتى تكون جاهزة لحصاد أنسجة الورم.
  2. وقد أفيد RMS لتطوير تلقائيا في كل من نماذج الماوس الذكور والإناث لضمور العضلات دوشين, مثل الفئران Mdx B10 في حوالي 18 شهرا من العمر وفي B6 mdx/mTR الفئران من قبل 9 أشهر22,23. تخدير الماوس الذي يطور ورم RMS باستخدام isoflurane، والتضحية الحيوان من خلال خلع عنق الرحم أو وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC للمؤسسة. مع مقص، وجعل شق على الجلد في المنطقة التي يتم توطين الورم، و (باستخدام ملاقط) سحب الجلد بعيدا عن منطقة الاهتمام. توظيف شفرة الحلاقة، واستئصال الورم من الحيوان.
  3. وزن 500-1000 ملغ من أنسجة الورم ووضعها في لوحة أعدت في الخطوة 2.1(الشكل 1A).
    ملاحظة: كميات أكبر من الأنسجة تؤثر سلبا على خطوات الهضم وتقليل العائد الإجمالي. إذا كان الورم الذي تم حصاده أكبر من 1000 ملغ، قم بتقسيمه إلى أجزاء وتذوقه بشكل عشوائي حتى يتم الوصول إلى الوزن المطلوب. أخذ العينات العشوائية ضروري لتقييم عدم تجانس الأنسجة.
  4. ضع اللوحة التي تحتوي على أنسجة الورم في غطاء محرك السيارة المعقمة للخلية وتستخلصها بشفرة حلاقة. أنسجة الورم من RMS غير متجانسة. وبالتالي، قد تقدم مناطق مختلفة مقاومة مختلفة للتخفيضات. تأكد من أن أحجام القطع المفرومالناتجة موحدة لضمان الهضم الأمثل.
    ملاحظة: RMS موجود كخليط من أنواع الأنسجة المختلفة (أساسا الأورام الليفية، الأوعية الدموية، والأنسجة الدهنية) التي يمكن تحديدها في كل ورم. إلى 1) عزل السكان خلية غير متجانسة تلخيص بدقة تكوين الورم الأصلي و 2) لا التحيز إجراء العزلة، وإجراء أخذ عينات عشوائية من الأنسجة التي تم حصادها. يجب هضم الخلايا من مناطق مختلفة من الورم واختبارها بالتوازي في المختبر في الفحص الموضح في القسم 3.
  5. نقل الأنسجة المفرومة والخلايا وسائل الإعلام العزل في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وغسل لوحة مع 4 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية ووضعها في الأنبوب.
  6. إضافة 700 وحدة / مل من محلول الكولاجين لهضم الأنسجة والحضانة في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
  7. بعد الحضانة، تدور أسفل الأنسجة في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT. يستنشق supernatant دون إزعاج بيليه، وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من محلول الهضم الثاني (dispase)، وحضانة في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. بمجرد الانتهاء من الهضم الثاني، pipet صعودا وهبوطا وتمرير تعليق الخلية من خلال مرشح النايلون 70 م على أنبوب الطرد المركزي 50 مل. ثم إضافة 10 مل من وسائل الإعلام عزل الخلية لغسل مرشح وتخفيف محلول الهضم، وتدور أسفل الأنسجة في 300 × ز وRT لمدة 5 دقائق.
  9. يستنشق supernatant وإعادة تعليق بيليه في 20 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام. ثم نقل تعليق الخلية في لوحة ثقافة الخلية 15 سم. وضع الخلايا في الحاضنة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. سيتم تحديد هذه اللوحة على أنها P0.
  10. في اليوم التالي للعزلة، تغيير وسائل الإعلام. هذه الخطوة ضرورية لضمان إزالة الحطام والخلايا الميتة التي قد تؤثر سلبا على بقاء الخلية.
  11. تقييم تزامن الخلايا بعد تغيير الوسائط، والتي تتراوح بين 30٪-60٪ اعتمادا على كمية المواد الأولية وحجم الخلية. ترك الخلايا تنمو في الحاضنة حتى تصل إلى 90٪ من الملاءمة. مراقبة الخلايا كل يوم وتغيير وسائل الإعلام كل يومين. يختلف الوقت اللازم لخلايا الورم لتصبح متانة اعتمادا على معايير متعددة: عدوانية الورم، النمط الجيني للورم، عمر الماوس، عدم تجانس الأنسجة.
  12. لتمرير الخلية، قم بما يلي:
    1. قبل تسخين حل انفصال الخلية والخلايا السرطانية وسائل الإعلام في حمام مائي في 37 درجة مئوية.
    2. اغسل الخلايا بـ 1x PBS المعقمة واحتضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في 10 مل من محلول مفرزة الخلايا الدافئة لمدة 5-10 دقائق.
    3. عندما يتم فصل جميع الخلايا من لوحة، إضافة 10 مل من وسائل الإعلام الخلايا السرطانية الدافئة، نقل الحل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل وتدور الخلايا إلى أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT.
    4. إعادة تعليق الخلايا في 5-10 مل من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام، اعتمادا على حجم بيليه، وحساب الخلايا الحية باستخدام الأزرق تريبان (1:5 تخفيف) لاستبعاد الخلايا الميتة.
    5. لوحة 105 خلايا في لوحات 10 سم أو 3 × 105 خلايا في لوحات 15 سم. يختلف وقت مضاعفة الخلية وفقًا للعوامل المفصلة في الخطوة 2.10.

3- اشتقاق الأورام

  1. استخدام الخلايا السرطانية في الممر P1 أو P2 لتجنب اختيار الخلايا من خلال مقاطع متعددة(الشكل 1B). لفصل الخلايا عن اللوحة، قم أولاً بغسل الطبق بـ 1x PBS، دون إزعاج الخلايا، ثم قم بتغطيتها باستخدام محلول مفرزة الخلايا (5 مل للوحة 10 سم أو 10 مل للوحة 15 سم) ووضعها في الحاضنة لمدة 5-10 دقائق.
  2. تأكد من أن الخلايا منفصلة من خلال النظر إلى لوحة تحت المجهر مشرق الميدان، إضافة 1:1 حجم وسائل الإعلام الخلايا السرطانية (حل مفرزة الخلية: الخلايا السرطانية وسائل الإعلام)، ووضع تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي وتدور الخلايا إلى أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقيقة في RT.
  3. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (القسم 3.4) أو وسائل الإعلام الأورام (القسم 3.5)، وفقا للطريقة المستخدمة للطلاء.
  4. خلايا الطلاء من خلال تدفق مقياس الخلايا
    1. إعادة تعليق الخلايا في المخزن المؤقت FACS (المبلغ يعتمد على حجم بيليه) ويدوياً عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. تأكد من أن تركيز الخلية النهائي هو 107 خلايا/مل (100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS لكل 106 خلايا). إضافة 1 μL من Fx دورة البنفسج وصمة عار لكل 106 خلايا للتمييز الحية من الخلايا الميتة أثناء فرز الخلايا. إعداد عنصر تحكم غير ملطخة التي لا يتم إضافة Fx دورة البنفسج وصمة عار إلى الخلايا.
      ملاحظة: يتم تحسين التركيز لتلطيخ فعالة وسرعة أثناء الفرز. سيؤدي انخفاض تركيز الخلايا إلى وقت فرز أطول، في حين أن التركيز العالي سيؤثر على التلطيخ.
    2. توظيف السيطرة غير ملطخة، وإعداد بوابة FACS فصل على قيد الحياة (Fx دورة البنفسجي-) من الموتى (Fx دورة البنفسجي+) الخلايا. ثم، استخدم فرز الخلايا الفلورية المنشطة (مع تمرير النطاق مرشح 450/50) لفصل وعدد من الخلايا الحية / الميتة والطلاء العدد المطلوب من الخلايا الحية في كل بئر من لوحات 96 جيدا منخفضة المرفقة. كل بئر من لوحة يحتاج إلى أن تملأ مع 200 درجة مئوية من وسائل الإعلام الأورام قبل البدء في الفرز.
      ملاحظة: بالنظر إلى أن TPCs هي مجموعة فرعية نادرة داخل الورم كله، تحسين البروتوكول عن طريق طلاء 100 خلية / جيدا من RMS الماوس لمراقبة تشكيل الأورام في ثقافة التعليق. يجب تعديل رقم الخلية لكل بئر للورم المحدد الذي تم اختباره.
    3. وضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة. حاول عدم إزعاج اللوحة إلا إذا لزم الأمر. لتجربة لمدة 30 يوما، ينبغي تجديد كل بئر مع وسائل الإعلام ونسبة مناسبة من عوامل النمو كل أسبوع (وسائل الإعلام تميل إلى تبخر وعوامل النمو ليست فعالة بعد أسبوع واحد).
    4. بعد الانتهاء من التجربة، يدويا لوحات الشاشة تحت المجهر حقل مشرق لتحديد الأورام (انظر الخطوة 3.6).
      ملاحظة: تم تحسين نقطة زمنية من 30 يوما للكشف بسهولة الماوس RMS الأورام من أحجام تتراوح بين 50-300 ميكرومتر من القطر. وينبغي تعديل نقطة زمنية اعتمادا على عدوانية الورم اختبار ومعدل انتشاره.
  5. خلايا الطلاء يدويا
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (كمية يعتمد على بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام الأزرق تريبان (1:10 تخفيف). حساب تركيز الخلية في الأنبوب ولوحة العدد المناسب من الخلايا في لوحة مرفق 96 منخفضة جدا. وضع الخلايا في الحاضنة حتى نهاية التجربة. حاول عدم إزعاج اللوحة ما لم تكن ضرورية لتجديد وسائل الإعلام وعوامل النمو، كما هو موضح في الخطوة 3.4.3.
    2. بعد الانتهاء من التجربة، لوحات الشاشة يدويا تحت المجهر حقل مشرق لتحديد الأورام أو استخدام برنامج سيليغو، كما هو موضح سابقا في كيسيل وآخرون24 انظر الخطوة 3.6 أدناه.
  6. لاحظ أنه يمكن تقييم قراءة منفصلتين نتيجة لهذا الفحص: عدد وحجم الأورام المشكلة.
    ملاحظة: عندما يتم طلاء أكثر من خلية واحدة في بئر، يمكن أن تشكل إما الأورام أو مجموعات الخلايا(الشكل 1C،اللوحات الثالثة والرابعة). مجموعات الخلايا هي المجاميع الخلوية الصغيرة التي تشكل في ثقافة التعليق التي تعزز بقاء الخلية وتتميز بشكل غير منتظم. الأورام كبيرة ولها بنية أكثر إحكاما مع شكل spheroid. وهي مستمدة من خلية واحدة لديها القدرة على البقاء على قيد الحياة بطريقة مستقلة عن المرسى وتنتشر بمعدل عال25. يمكن استخدام خلايا الطلاء من خلال مقياس التدفق أو يدويًا بالتبادل، وفقًا للقدرات المتوفرة في المختبر. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام لوحات منخفضة المرفقات ذات حجم مختلف عن 96 لوحة بئر ممكن ة ويعتمد على النتيجة المطلوبة. في الواقع، ينبغي أن يتم تقييم تردد الأورام باستخدام 96 لوحات مرفق منخفضة جدا، في حين أن الفحص الأولي لتقييم الخلايا الإمكانات الورمية سوف تسفر عن نتائج أسرع وموثوق بها على 6 لوحات منخفضة جدا المرفقات.

4. علاج الأورام مع البروتينات المؤتلفة

  1. كرر الخطوتين 3-1 و3-2.
  2. إذا كان إعداد علاج مع البروتينات المؤتلفة، أولاتحديد أفضل تركيز لاستخدام القسم 4.3، أو إذا تم تحديد التركيز الأمثل سابقا، انتقل إلى القسم 4.4.
  3. تحديد تركيز علاج البروتين المؤتلف.
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (حجم يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. حساب تركيز الخلية في أنبوب ولوحة 100،000 خلية في لوحة مرفق منخفضة جدا 6. لوحة اثنين من الآبار لكل تركيز اختبار وبئرين للضوابط غير المعالجة(الشكل 2). وتستند تركيزات البروتين التي سيتم اختبارها على البحث الأدب.
    2. علاج كل بئر من الخلايا المعلقة مع تركيز البروتين مختلفة ووضع الخلايا في الحاضنة لمدة 48 ساعة (الوقت اللازم لتكون قادرة على تقييم تأثير العلاج على كل من صلاحية الخلية وعلى التعبير عن الجينات المستهدفة المصب). ثم قم بتقييم المعلمات التالية:
      1. بقاء الخلية: باستخدام مجهر حقل مشرق، فضلا عن المقارنة مع الضوابط غير المعالجة، والتحقق من مورفولوجيا الخلية. تظهر الخلايا السليمة مشرقة وعاكسة تحت المجهر، في حين أن الموت المفرط للخلايا سوف يؤدي إلى تراكم الحطام في وسائل الإعلام. لتحديد كمية من موت الخلية، يمكن استخدام استبعاد الأزرق تريبان، تلطيخ البنفسج الكريستال، MTT، أو اختبار TUNEL (في هذه الحالة، إضافة واحدة بشكل جيد إلى الطلاء الأصلي).
      2. تأثير البروتينات المؤتلفة على مسارات المصب: إجراء بحث أدبي باستخدام PubMed لتحديد الجينات المصب المعروف أن تتأثر بالبروتين المختبر. تصميم التمهيديات qRT-PCR للجينات المستهدفة، وإجراء تحليل qRT-PCR على الحمض النووي الريبي معزولة عن الخلايا المعالجة(الشكل 2).
  4. علاج مع البروتين المؤتلف.
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائل الإعلام الأورام (حجم يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. تحديد العدد الإجمالي للخلايا اللازمة للتجربة المطلوبة (100 خلية لكل بئر من لوحة مرفق منخفضة جدا 96) وتخفيفها في حجم وسائل الإعلام الأورام المناسبة. إذا كان إجراء أكثر من علاج واحد، وإعداد أنابيب خلية منفصلة.
    2. علاج كل أنبوب مع التركيز المناسب من البروتين المؤتلف ولوحة الخلايا في بئر منفصلة من 96 جيدا لوحة منخفضة المرفقين. سيتم تكرار العلاج على كل بئر اعتمادا على نصف عمر البروتين المؤتلف حتى نقطة النهاية 30 يوما من التجربة.
    3. في نهاية التجربة، اتبع الخطوتين 3.4.4 و 3.6 لتحليل البيانات.

5. علاج الأورام مع بلازميدات التعبير المفرط

  1. كرر الخطوتين 3-1 و3-2.
  2. إذا كان إعداد العلاج على نوع ورم جديد، أولاتحديد أفضل تركيز بلازميد لاستخدام القسم 5.3، أو إذا تم تحديد تركيز الحمض النووي الأمثل في السابق، انتقل إلى القسم 5.4.
  3. تحديد التركيز البلازمي الأمثل.
    1. إعادة تعليق الخلايا في الخلايا السرطانية وسائل الإعلام (وحدة التخزين يعتمد على حجم بيليه) ويدويا عد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. لوحة الخلايا التي تم عدها لتحقيق الملاءمة من 70٪ -90٪ (رقم الخلية تعتمد اعتمادا كبيرا في حجم الخلية ومورفولوجيا). سيتم استخدام GFP-plasmid لاختبار كفاءة التغوط عبر التغوط بعد بروتوكول الشركة المصنعة للكاشف الانسياق للخلايا الملتصقة. في موازاة ذلك، أيضا اختبار عنصر تحكم غير المعالجة(الشكل 3A). إجراء اختبار الكفاءة في لوحة 24 جيدا.
      ملاحظة: يتم استخدام الخلايا الملتصقة لتعزيز كفاءة التغوط، حيث أن التغوط الذي يتم تنفيذه على خلايا التعليق ليس فعالاً ويؤثر سلباً على قدرة الخلية على البقاء.
    2. 48 ساعة بعد التغوط تقييم الخلايا للمعلمات التالية:
      1. بقاء الخلية: باستخدام مجهر حقل مشرق، قارن عدد الخلايا الموجودة في كل بئر ومقارنتها مع الخلايا غير المعالجة بشكل جيد.
      2. التعبير GFP: حساب النسبة المئوية للخلايا التي هي GFP إيجابية على العدد الإجمالي للخلايا في كل بئر(الشكل 3B).
  4. علاج البلازميد المفرط
    1. إعادة تعليق الخلايا في وسائط الخلايا السرطانية (يعتمد حجم الصوت على حجم بيليه) وحساب الخلايا الحية يدويا باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. لوحة 200،000 خلية لكل بئر من لوحة 6 جيدا. سيتم استخدام كل بئر لحدث نقل مستقل. وسيتم نقل كل بئر باستخدام الإعداد وضعت لنوع الورم محددة(الشكل 3A).
    2. 24 ساعة بعد التغوط، وغسل كل بئر مع 1X PBS وحضانة الخلايا في حل مفرزة الخلية الدافئة (ما يكفي لتغطية البئر). ضع اللوحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق، وفقًا للعوامل المفصلة في القسم 2.15.
    3. عند فصل الخلايا، عد الخلايا المشتقة من كل بئر بشكل مستقل باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. ضع 100,000 خلية لكل بئر من لوحة مرفق منخفضة جداً، مع التأكد من عدم خلط الخلايا المشتقة من آبار مختلفة. ضع اللوحة في الحاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية واتركيها دون إزعاج لمدة أسبوع.
      ملاحظة: مدة هذا التسريب هي 7 أيام، وهو وقت كاف للسماح بتشكيل الأورام مع منع اندماج الأورام. الانصهار الأورام هو ظاهرة التي تصبح واضحة عندما يتم مطلي 100،000 أو أكثر من الخلايا معا في تعليق لأكثر من 1 أسبوع، والتي يمكن أن التحيز تقييم قدرة تشكيل الورم. في حالة أن التجربة تتطلب وقتا أطول الحضانة، يجب تعديل كثافة الخلايا أو السقالات البوليمرية المستخدمة لتجنب الانصهار الأورام26.
    4. في نهاية التجربة، اتبع الخطوتين 3.5.2 و 3.6 لتحليل البيانات.

6. إعداد الأورام لزرع الطعوم

  1. وضع مصفوفة خارج الخلية (ECM) الحل (50 درجة مئوية لكل allograft) والخلايا السرطانية وسائل الإعلام (50 درجة مئوية لكل allograft) على الجليد.
  2. يمكن استخدام الأورام لزرع الطعوم. جمع جميع الأورام التي تم الحصول عليها من نوع خلية محددة أو العلاج في أنبوب 15 مل أو 50 مل (وفقا لحجم إجمالي وسائل الإعلام)(الشكل 1D). تدور الأورام أسفل في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT. إزالة supernatant على الأورام وغسلها مع 10 مل من 1X PBS المعقمة.
  3. تدور الأورام أسفل مرة أخرى في 300 × ز لمدة 5 دقائق في RT، يستنشق PBS 1X، وإضافة 500 درجة مئوية إلى 1 مل من حل مفرزة الخلية على رأس بيليه الخلية، الذي يبدأ عملية التفكك. حضانة الأورام في محلول الجهاز الهضمي في حمام الماء تهتز في 37 درجة مئوية والتحقق من تطور الهضم كل 10 دقيقة. للمساعدة في تفكك الأورام في حل خلية واحدة، ماصة الخلايا صعودا وهبوطا للاضطراب الميكانيكي. قد تستغرق عملية الهضم ما يصل إلى 30 دقيقة.
    ملاحظة: على الرغم من حقيقة أن وقت الحضانة يختلف اختلافا كبيرا عندما تستمد الأورام من خلايا RMS الأولية المختلفة، لم يلاحظ انخفاض كبير في قدرة الخلية على البقاء في العلاقة مع وقت الهضم.
  4. عندما يتم الحصول على حل خلية واحدة، إضافة حجم من الخلايا السرطانية وسائل الإعلام (1:1، حل مفرزة الخلية: الخلايا السرطانية وسائل الإعلام) وتدور عليه في 300 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
    ملاحظة: من هذا الوقت فصاعداً، يجب تنفيذ كافة الخطوات على الجليد. بعد الغزل، لا تشكل الأورام بيليه مستقرة كما تفعل حلول الخلايا الواحدة. للتأكد من عدم خلع أو استنشاق الأورام، استخدم ماصة 1 مل وأسكّن السائل بلطف. الانتقال إلى ماصة 200 درجة مئوية عندما يبقى فقط 1 مل.
  5. إعادة تعليق الخلايا في الخلايا السرطانية الباردة وسائل الإعلام (وحدة التخزين سوف تعتمد على حجم بيليه)، ووضع الخلايا على الجليد وعد الخلايا الحية باستخدام استبعاد الأزرق تريبان. بعد تحديد الكمية المناسبة من الخلايا لاستخدامها في allograft، إعادة تعليقها في حجم إجمالي قدره 50 درجة مئوية من الخلايا السرطانية الباردة وسائل الإعلام. تبريد طرف ماصة في وسائل الإعلام الخلايا السرطانية الباردة. عندما يكون الطرف باردا، استخدمه لاتخاذ 50 ميكرولتر من محلول ECM وإضافته إلى الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا. لا تقم بإزالة الأنابيب من الجليد أثناء هذه العملية.
    ملاحظة: يجب تحديد عدد الخلايا التي سيتم استخدامها في عملية الزرع وفقا للورم اختبار والهدف التجريبي: عدد أكبر من الخلايا المزروعة سوف يقلل من وقت تطور الورم (وقد ثبت أن 20،000 خلية من أورام RMS الماوس تتطور إلى ورم 6 أسابيع بعد الحقن). لتكون قادرة على مقارنة خطوط الخلايا المختلفة أو العلاجات المختلفة، من المهم أن تبدأ من نفس العدد من الخلايا.
  6. كما الخلايا هي الآن على استعداد للزرع، والحفاظ على الجليد حتى الحقن. ضع حقنة الأنسولين المغطاة بـ 0.5 مل مع إبرة 29 G على الجليد، لمنع حل الخلية من أن يصبح صلبًا عند الشفط.
  7. تشغيل مقياس التدفق إلى 200 مل / دقيقة الأكسجين والمرذاذ isoflurane إلى 2.5٪. التخدير 2 شهر ذكر NOD / SCID الماوس عن طريق وضعه داخل غرفة التعريفي. انتظر 2-3 دقائق حتى يظهر الماوس نائماً وتباطأت التربية. قبل بدء الإجراء ، تأكد أولاً من خلال قرصة القدم أن الماوس نائم ، ثم ضع مرهم بيطري على العينين. حلق الجانب الأيمن من الحيوان، يستنشق محلول الخلية في الحقنة المبردة مسبقا، وحقنها تحت الجلد في المنطقة الحليقة. سوف تشكل عثرة مرئية تحت الجلد إذا تم تنفيذ الحقن بشكل صحيح.
    ملاحظة: يمكن إجراء الطعوم الخلية في نفس سلالة الماوس مثل تلك التي من الخلايا المزروعة. على سبيل المثال، إذا كانت خلايا RMS معزولة أصلاً من ماوس C57BL/6، يمكن إجراء الطعوم في الفئران C57BL/6. إذا كانت السلالة مختلفة، ثم الفئران المتلقية نقص المناعة ينبغي أن تستخدم لتجنب الرفض. ويمكن أيضا تعديل أعمار الفئران المتلقية اعتمادا على الهدف التجريبي.
  8. مراقبة الفئران لتكوين الورم مرة واحدة في الأسبوع.
    ملاحظة: للتحقق من هوية الورم المشتق من زرع الطعوم، ينبغي مقارنته بالورم الأصلي الذي تم عزل الخلايا منه. لهذا الهدف، يمكن إجراء التحليل النسيجي للميزات المورفولوجية والتعبير عن علامات myogenic، فضلا عن RNAseq أكثر شمولا.

النتائج

الكشف عن الأورام
تم تحسين عزل الخلايا للحصول على أقصى قدر من التباين من مجموعات الخلايا الموجودة في أنسجة الورم. أولا، منذ الأنسجة المعزولة قدمت مناطق مختلفة من الناحية الشكلية، لتعزيز فرص عزل مجموعات الخلايا النادرة موحدة، تم إجراء أخذ العينات من مناطق متعد?...

Discussion

وقد استخدمت أساليب متعددة لعزل وتوصيف TPCs من مجموعات الخلايا غير المتجانسة الورم: اختبار الورم clonogenic، عزل FACS، ودراسة تشكيل الورم. تم وصف فحص الورم الكلوجيني لأول مرة في عام 1971، ويستخدم لدراسات الخلايا الجذعية، ويطبق فقط في وقت لاحق على بيولوجيا السرطان29،30. ?...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة إليسون الطبية منحAG-NS-0843-11، والمنحة التجريبية للمعهد الوطني للصحة ضمن منحة دعم مركز السرطان NCI P30CA030199 إلى A.S.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase cell dissociation reagentGibcoA1110501Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
CeligoNexcelomCeligoMicrowell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type IILife Technologies17101015Tissue digestion enzyme
Dispase II, proteaseLife Technologies17105041Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose mediaGibco11965092Component of tumor cells media
DMEM/F12 MediaGibco11320033Component of tumosphere media
EDTAThermoFisherS312500Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse proteinGibcoPMG8041Component of tumosphere media
FACSAria II Flow CytometryBD Biosciences650033Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine SerumOmega ScientificFB-11Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agentMWI Vet Supply502017Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Discriminate live and dead cells
Goat SerumLife Technologies16210072Component of FACS buffer
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Component of FACS buffer
Horse SerumLife Technologies16050114Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagentThermoFisherL3000015Transfection Reagent
Matrigel membrane matrixCorningCB40234Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X)Gibco17502048Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic OintmentMWI Vet Supply701008Eyes ointment
PBSGibco10010023Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1Addgene6084-1GFP plasmid
Penicillin - StreptomyocinLife Technologies15140163Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basicPeprotech10018BComponent of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand ProteinR&D Systems427-FL-005Recombinant protein
Trypan blueThermoFisher15250061Discriminate live and dead cells

References

  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved