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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo riproducibile per l'isolamento delle cellule primarie del thabdomyosarcoma del topo, la formazione e il trattamento della tumorsfera e il trapianto di allotrapianto a partire dalle colture di cellule di tumori.

Abstract

Il rhabdomyosarcoma (RMS) è il sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambini. Sebbene sforzi significativi abbiano permesso l'identificazione di mutazioni comuni associate al RMS e consentito la discriminazione di diversi sottotipi RMS, esistono ancora grandi sfide per lo sviluppo di nuovi trattamenti per migliorare ulteriormente la prognosi. Anche se identificato dall'espressione di marcatori miogenici, c'è ancora una controversia significativa sul fatto che RMS abbia origini miogeniche o non miogene, poiché la cellula di origine è ancora poco compresa. Nel presente studio, viene fornito un metodo affidabile per il saggio di biosfera per rms del topo. Il test si basa sulle proprietà funzionali delle cellule tumorali e consente l'identificazione di popolazioni rare nel tumore con funzioni tumorogene. Sono inoltre descritte le procedure per testare le proteine ricombinanti, integrare i protocolli di trasfezione con il test della biosfera e valutare i geni candidati coinvolti nello sviluppo e nella crescita del tumore. Descritto ulteriormente è una procedura per il trapianto di allotrapianto di sfere tumorali in topi riceventi per convalidare la funzione tumorale in vivo. Nel complesso, il metodo descritto consente l'identificazione e il test affidabili di popolazioni tumorigene RMS rare che possono essere applicate al RMS derivante in contesti diversi. Infine, il protocollo può essere utilizzato come piattaforma per lo screening farmacologico e lo sviluppo futuro delle terapie.

Introduzione

Il cancro è una malattia eterogenea; inoltre, lo stesso tipo di tumore può presentare diverse mutazioni genetiche in pazienti diversi, e all'interno di un paziente un tumore è composto da più popolazioni di cellule1. L'eterogeneità rappresenta una sfida nell'identificazione delle cellule responsabili dell'avvio e della propagazione del cancro, ma la loro caratterizzazione è essenziale per lo sviluppo di trattamenti efficienti. La nozione di cellule che propagano il tumore (TPC), una rara popolazione di cellule che contribuiscono allo sviluppo del tumore, è stata precedentemente ampiamente rivista2. Nonostante il fatto che i TPC siano stati caratterizzati in più tipi di cancro, l'identificazione dei marcatori per il loro isolamento affidabile rimane una sfida per diversi tipi di tumore3,4,5,6 , 7 (in questo stato , 8 (IN vio , 9.Così, un metodo che non si basa su marcatori molecolari, ma piuttosto sulle proprietà funzionali del TPC (alto auto-rinnovamento e la capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento), noto come analisi di formazione della tumorsfera, può essere ampiamente applicato per la l'identificazione dei TPC dalla maggior parte dei tumori. È importante sottolineare che questo saggio può anche essere impiegato per l'espansione dei TPC e quindi applicato direttamente allo screening farmacologico del cancro e agli studi sulla resistenza al cancro1,10.

Il rhabdomyosarcoma (RMS) è una rara forma di sarcoma dei tessuti molli più comune nei bambinipiccoli 11. Althoug RMS può essere identificata istologicamente attraverso la valutazione dell'espressione dei marcatori miogenici, la cellula RMS di origine non è stata caratterizzata in modo univoco a causa dei sottotipi tumorali multipli e dell'alta eterogeneità degli stimoli dello sviluppo tumorale. Ineffetti, studi recenti hanno generato una significativa discussione scientifica sul fatto che RMS sia di origine miogenica o non miogenica, suggerendo che RMS possa derivare da diversi tipi di cellule a seconda del contesto12,13, 14 Del sistema , 15 Mi lasa del sistema , 16 , 17. Sono stati effettuati numerosi studi sulle linee cellulari RMS utilizzando il saggio di formazione della tumoresfera per l'identificazione delle vie coinvolte nello sviluppo tumorale e nella caratterizzazione dei marcatori associati a popolazioni altamente auto-rinnovate 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21.

Tuttavia, nonostante il potenziale del saggio di formazione della tumorsfera per identificare le cellule RMS di origine, non è ancora stato descritto un metodo affidabile che può essere impiegato nelle cellule RMS primarie. In questo contesto, un recente studio del nostro gruppo ha impiegato un analisi ottimizzata della formazione della tumorsfera per l'identificazione delle cellule RMS di origine in un modello murino Duchenne muscular dystrophy (DMD)22. Più tipi di cellule pre-tumorigene, isolate dai tessuti muscolari, sono testate per la loro capacità di crescere in condizioni di basso attaccamento, consentendo l'identificazione delle cellule staminali muscolari come cellule di origine per RMS in contesti distrofici. Descritto qui è un protocollo riproducibile e affidabile per il saggio di formazione della forma della tumorsferae (Figura 1), che è stato impiegato con successo per l'identificazione di popolazioni cellulari estremamente rare che sono responsabili dello sviluppo del mouse RMS.

Protocollo

L'alloggio, il trattamento e il sacrificio dei topi sono stati eseguiti in seguito al protocollo Approvato IACUC del Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute.

1. Preparazione del reagente

  1. Preparare 100 mL di supporti di isolamento cellulare: F10 medio integrato con 10% siero di cavallo (HS).
  2. Preparare 50 mL di soluzione di collagenasi di tipo II: sciogliere 1 g di polvere di collagenae di tipo II in 50 mL di supporto di isolamento cellulare (notare le unità dell'enzima per 1 mL di supporto, dal momento che il numero di unità cambia a seconda del lotto). Aliquota e conservare in un congelatore -20 gradi fino a quando non è pronto per l'uso.
    NOTA: Ogni lotto di collagenasi deve essere testato prima dell'uso, dal momento che l'attività enzimatica può cambiare attraverso lotti diversi.
  3. Preparare 10 mL per campione di seconda soluzione di digestione: supporti di isolamento delle cellule con 100 unità/mL di soluzione collagenase di tipo II e 2 unità/mL di dispase II appena pesato. Preparare immediatamente prima dell'uso.
  4. Preparare 500 mL di cellule tumorali multimediali: DMEM alto glucosio integrato con 20% FBS e 1% penna / strep.
  5. Preparare 500 mL di buffer FACS: 1x PBS integrato con 2,5% v/v siero di capra normale e 1 mM EDTA.
  6. Preparare 500 mL di supporti tumorali: DMEM/F12 integrato con 1% penna /strep. Poco prima dell'uso, aggiungere i seguenti fattori di crescita: 1% supplemento N2, 10 ng/mL EGF, e 10 ng/mL -FGF.

2. Isolamento cellulare e cultura

  1. Preparare una piastra di 10 cm contenente 5 mL di supporti di isolamento delle cellule (una piastra per campione di tumore) e metterla in un'incubatrice a 37 gradi centigradi fino a quando non è pronta per raccogliere il tessuto tumorale.
  2. RMS sono stati segnalati per sviluppare spontaneamente in entrambi i modelli murini maschili e femminili per la distrofia muscolare di Duchenne, come topi mdx B10 a circa 18 mesi di età e in B6 topi mdx/mTR di 9 mesi22,23. Anestesizzare il topo che sviluppa il tumore RMS utilizzando isoflurane, e sacrificare l'animale attraverso lussazione cervicale o secondo le linee guida IACUC dell'istituzione. Con le forbici, fare un'incisione sulla pelle nella zona in cui il tumore è localizzato, e (utilizzando una pinzetta) tirare la pelle lontano dalla zona di interesse. Impiegando una lama di rasoio, ascisi il tumore dall'animale.
  3. Pesare 500-1.000 mg del tessuto tumorale e metterlo nella piastra preparata nel passaggio 2.1 (Figura 1A).
    NOTA: Grandi quantità di tessuto influenzano negativamente i passi di digestione e diminuiscono la resa complessiva. Se il tumore raccolto è più grande di 1000 mg, dividerlo in parti e campionare in modo casuale fino a raggiungere il peso desiderato. Il campionamento casuale è necessario per valutare l'eterogeneità dei tessuti.
  4. Posizionare la piastra contenente i tessuti tumorali nella cappa di coltura cellulare sterile e tritarla con una lama di rasoio. Il tessuto tumorale della RMS è eterogeneo; così, diverse aree possono presentare una diversa resistenza ai tagli. Assicurarsi che le dimensioni dei pezzi macinati risultanti siano uniformi per garantire una digestione ottimale.
    NOTA: RMS esiste come miscele di diversi tipi di tessuto (principalmente tessuti fibroti, vascolarizzati e grassi) che possono essere identificati in ogni tumore. Per 1) isolare una popolazione cellulare eterogenea ricapitolare accuratamente la composizione del tumore originale e 2) non bias la procedura di isolamento, eseguire il campionamento casuale del tessuto raccolto. Le cellule provenienti da diverse aree del tumore devono essere digerite e testate in parallelo in vitro nell'analisi descritta nella sezione 3.
  5. Spostare il tessuto macinato e il supporto di isolamento cellulare in un tubo di centrifuga di 15 mL, lavare la piastra con 4 mL di supporto di isolamento cellulare e posizionarla nel tubo.
  6. Aggiungere 700 unità/mL di soluzione di collagenasi per digerire il tessuto e incubare in un bagno d'acqua agitazione a 37 gradi centigradi per 1,5 h.
  7. Dopo l'incubazione, ruotare il tessuto a 300 x g per 5 min a RT. Aspirate il supernatante senza disturbare il pellet, risospendere il pellet in 10 mL di seconda soluzione di digestione (dispasi), e incubare in un bagno d'acqua agitazione a 37 gradi centigradi per 30 min.
  8. Una volta completata la seconda digestione, pipet su e giù e passare la sospensione cellulare attraverso un filtro di nylon 70 m su un tubo di centrifugazione 50 mL. Quindi aggiungere 10 mL di supporto di isolamento cellulare per lavare il filtro e diluire la soluzione di digestione, e girare verso il basso il tessuto a 300 x g e RT per 5 min.
  9. Aspirare il superatante e risospendere il pellet in 20 mL di cellule tumorali media. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura cellulare di 15 cm. Collocare le cellule nell'incubatrice a 37 gradi durante la notte. Questa piastra verrà identificata come P0.
  10. Il giorno dopo l'isolamento, cambia i media. Questo passaggio è necessario per garantire la rimozione di detriti e cellule morte che possono influenzare negativamente la sopravvivenza delle cellule.
  11. Valutare la confluenza cellulare dopo la modifica del supporto, che varia dal 30% al 60% a seconda della quantità di materiale iniziale e delle dimensioni della cella. Lasciare le cellule che crescono nell'incubatrice fino a raggiungere il 90% di confluenza. Monitora le celle ogni giorno e cambia i media ogni 2 giorni. Il tempo necessario per le cellule tumorali per diventare confluenti varia a seconda dei parametri multipli: aggressività tumorale, genotipo del tumore, età del topo, eterogeneità del tessuto.
  12. Per il passaggio delle celle, eseguire le operazioni seguenti:
    1. Pre-riscaldare la soluzione di distacco cellulare e le cellule tumorali multimediali in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi.
    2. Lavare le cellule con 1 volte pbS sterile e incubarle a 37 gradi centigradi in 10 mL di soluzione di distacco delle celle calde per 5-10 min.
    3. Quando tutte le cellule sono staccate dalla piastra, aggiungere 10 mL di supporti di cellule tumorali calde, spostare la soluzione in un tubo di centrifuga di 50 mL e far girare le cellule verso il basso a 300 x g per 5 min a RT.
    4. Risospendere le cellule in 5-10 mL di cellule tumorali multimediali, a seconda della dimensione del pellet, e contare le cellule vive utilizzando Trypan blu (1:5 diluizione) per escludere le cellule morte.
    5. Piatto 105 cellule in piastre da 10 cm o 3 x 105 cellule in piastre da 15 cm. Il tempo di raddoppio cellulare varia a seconda dei fattori descritti al punto 2.10.

3. derivazione della tumoresfera

  1. Utilizzare le cellule tumorali al passaggio P1 o P2 per evitare la selezione delle cellule attraverso più passaggi(Figura 1B). Per staccare le cellule dalla piastra, prima lavare il piatto con 1x PBS, senza disturbare le cellule, quindi coprirle utilizzando una soluzione di distacco cellulare (5 mL per una piastra di 10 cm o 10 mL per una piastra di 15 cm) e metterle nell'incubatrice per 5-10 min.
  2. Confermare che le cellule sono staccate guardando la piastra al microscopio a campo luminoso, aggiungere 1:1 volume di supporti di cellule tumorali (soluzione di distacco cellulare:supporti di cellule tumorali), posizionare la sospensione cellulare in un tubo di centrifuga e ruotare le cellule verso il basso a 300 x g per 5 min presso RT.
  3. Risospendere le cellule nel buffer FACS (sezione 3.4) o nel supporto delle tumorale (sezione 3.5), secondo il metodo utilizzato per la placcatura.
  4. Placcatura delle cellule attraverso il citometro di flusso
    1. Risospendere le celle nel buffer FACS (la quantità dipende dalla dimensione del pellet) e contare manualmente le celle vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Assicurarsi che la concentrazione finale delle cellule sia di 107 celle/mL (100 -L di TAC buffer per 106 celle). Aggiungere 1 l di macchia Violet ciclo Fx ogni 106 cellule per discriminare la vita dalle cellule morte durante lo smistamento delle cellule. Preparare un controllo incontaminato in cui la macchia Viola del ciclo Fx non viene aggiunta alle celle.
      NOTA: La concentrazione è ottimizzata per una colorazione e una velocità efficienti durante lo smistamento. Una minore concentrazione cellulare si tradurrà in un tempo di selezione più lungo, mentre una concentrazione più elevata influenzerà la colorazione.
    2. Utilizzando il controllo incontaminato, impostare un cancello FACS segregando vivo (Fx Cycle Violet-) da cellule morte (Fx CycleViolet). Quindi, utilizzare lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza (con 450/50 passaggio banda filtro) per la separazione e il conteggio delle cellule vive / morte e per placcare il numero desiderato di cellule vive in ogni pozzo delle 96 piastre ben basso attaccamento. Ogni pozzo della piastra deve essere riempito con 200 - L di supporti tumorali prima di iniziare lo smistamento.
      NOTA: Dato che i TPC sono una sottopopolazione rara all'interno dell'intero tumore, ottimizzare il protocollo placcando 100 cellule/bene dal topo RMS per osservare la formazione di sfere tumorali nella coltura delle sospensioni. Il numero di cellule per pozzo deve essere regolato per il tumore specifico testato.
    3. Posizionare le cellule nell'incubatrice fino alla fine dell'esperimento. Cercate di non disturbare la piastra a meno che non sia necessario. Per un esperimento di 30 giorni, ogni pozzo dovrebbe essere riempito con i media e una parte appropriata dei fattori di crescita ogni settimana (i media tendono a evaporare e i fattori di crescita non sono efficaci dopo 1 settimana).
    4. Dopo il completamento dell'esperimento, si vagliano manualmente le lastre al microscopio a campo luminoso per identificare le sfere tumorali (vedere il passaggio 3.6).
      NOTA: Un punto di tempo di 30 giorni è stato ottimizzato per rilevare facilmente le sfere tumorali RMS del topo di dimensioni che vanno da 50 a 300 m di diametro. Il punto temporale deve essere regolato a seconda dell'aggressività del tumore testato e del suo tasso proliferativo.
  5. Placcatura manuale delle celle
    1. Risospendere le cellule nei mezzi di comunicazione della tumorsferae (la quantità dipende dal pellet) e contare manualmente le cellule vive utilizzando trypan blu (1:10 diluizione). Calcolare la concentrazione cellulare nel tubo e placcare il numero corretto di cellule in una piastra di fissaggio ben bassa 96. Posizionare le cellule nell'incubatrice fino alla fine dell'esperimento. Cercate di non disturbare la piastra a meno che non sia necessario per il rifornimento dei supporti e dei fattori di crescita, come descritto al punto 3.4.3.
    2. Dopo il completamento dell'esperimento, le lastre dello schermo manualmente al microscopio a campo luminoso per identificare le sfere tumorali o utilizzare il software Celigo, come descritto in precedenza in Kessel et al.24 Vedere il passaggio 3.6 di seguito.
  6. Si noti che due letture separate possono essere valutate come risultato di questo analisi: numero e dimensione delle sfere tumorali formate.
    NOTA: Quando più di una cellula è placcata in un pozzo, possono formarsi tumorale o cluster di cellule (Figura 1C, terzo e quarto pannello). I cluster cellulari sono piccoli aggregati cellulari che si formano nella coltura delle sospensioni che migliorano la sopravvivenza delle cellule e sono caratterizzati da una forma irregolare. Le sfere tumorali sono grandi e hanno una struttura più compatta con una forma sferoide. Derivano da una singola cellula che ha la capacità di sopravvivere in modo indipendente dall'ancoraggio e proliferare ad un tasso elevatodi 25. La placcatura delle cellule attraverso il citometro di flusso o manualmente può essere utilizzata in modo intercambiabile, a seconda delle capacità disponibili in laboratorio. Inoltre, l'impiego di piastre a basso attaccamento di dimensioni diverse da 96 pozzi è possibile e dipende dal risultato richiesto. Infatti, la valutazione della frequenza della tumorsfera dovrebbe essere fatta utilizzando 96 piastre di attaccamento ben basse, mentre lo screening iniziale per la valutazione del potenziale tumorigeno delle cellule produrrà risultati più veloci e affidabili su 6 piastre ben a basso attaccamento.

4. Trattamento della tumore con proteine ricombinanti

  1. Ripetere i passaggi 3.1 e 3.2.
  2. Se si imposta un trattamento con proteine ricombinanti, determinare innanzitutto la concentrazione migliore da utilizzare dopo la sezione 4.3, oppure se la concentrazione ottimale è stata determinata in precedenza, passare alla sezione 4.4.
  3. Determinare la concentrazione di trattamento proteico ricombinante.
    1. Risospendere le cellule in supporto di tumorsfera (il volume dipende dalla dimensione del pellet) e contare manualmente le cellule vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Calcolare la concentrazione cellulare nel tubo e piastra 100.000 cellule in una piastra di fissaggio ben basso 6. Piastra due pozzetti per ogni concentrazione testata e due pozzetti per i controlli non trattati (Figura 2). Le concentrazioni proteiche da testare si basano sulla ricerca della letteratura.
    2. Trattare ogni pozzo di sospensione con una diversa concentrazione proteica e posizionare le cellule nell'incubatrice per 48 h (tempo necessario per essere in grado di valutare l'effetto del trattamento sia sulla vitalità cellulare che sull'espressione dei geni bersaglio a valle). Quindi, valutare i seguenti parametri:
      1. Sopravvivenza cellulare: utilizzando un microscopio a campo luminoso e confrontando con i controlli non trattati, controllare la morfologia cellulare. Le cellule sane appaiono luminose e riflettenti al microscopio, mentre un'eccessiva morte cellulare indurrà l'accumulo di detriti nei media. Per una determinazione quantificabile della morte cellulare, è possibile utilizzare l'esclusione blu Trypan, la colorazione viola di cristallo, l'analisi MTT o TUNEL (in questo caso, aggiungere un pozzo alla placcatura originale).
      2. Effetto delle proteine ricombinanti sulle vie a valle: eseguire una ricerca biberata utilizzando PubMed per l'identificazione dei geni a valle noti per essere influenzati dalla proteina testata. Progettare i primer qRT-PCR per i geni bersaglio ed eseguire l'analisi qRT-PCR sull'RNA isolato dalle cellule trattate (Figura 2).
  4. Trattare con proteine ricombinanti.
    1. Risospendere le cellule in supporto di tumorsfera (il volume dipende dalla dimensione del pellet) e contare manualmente le cellule vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Determinare il numero totale di cellule necessarie per l'esperimento desiderato (100 cellule per ogni pozzo di una piastra di fissaggio ben bassa da 96) e diluirle nel volume dei supporti della tumorsfera appropriata. Se si esegue più di un trattamento, preparare tubi cellulari separati.
    2. Trattare ogni tubo con l'adeguata concentrazione di proteine ricombinanti e piastra le cellule in un pozzo separato di 96 pozzo ben basso attaccamento piastra. Il trattamento verrà ripetuto su ogni pozzo a seconda dell'emivita della proteina ricombinante fino all'endpoint di 30 giorni dell'esperimento.
    3. Al termine dell'esperimento, seguire i passaggi 3.4.4 e 3.6 per analizzare i dati.

5. Trattamento della tumoresfera con plasmidi sovraespressione

  1. Ripetere i passaggi 3.1 e 3.2.
  2. Se si imposta il trattamento su un nuovo tipo di tumore, determinare innanzitutto la migliore concentrazione di plasmide da utilizzare dopo la sezione 5.3, o se la concentrazione ottimale del DNA è stata determinata in precedenza, passare alla sezione 5.4.
  3. Determinare la concentrazione ottimale di plasmide.
    1. Risospendere le cellule nei supporti delle cellule tumorali (il volume dipende dalle dimensioni del pellet) e contare manualmente le cellule vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Piastra refluenza delle cellule contate dal 70% al 90% (il numero di cellule è altamente dipendente dalle dimensioni delle cellule e dalla morfologia). GFP-plasmid sarà impiegato per testare l'efficienza della trasfezione seguendo il protocollo del produttore del reagente di trasfezione per le cellule aderenti. Parallelamente, testare anche un controllo non trattato (Figura 3A). Eseguire un test di efficienza in una piastra di 24 pozze.
      NOTA: Le cellule aderenti vengono utilizzate per migliorare l'efficienza della trasfezione, poiché la trasfezione eseguita sulle celle in sospensione non è efficiente e influisce negativamente sulla vitalità cellulare.
    2. 48 h dopo la trasfezione valuta le cellule per i seguenti parametri:
      1. Sopravvivenza cellulare: usando un microscopio a campo luminoso, confronta il numero di cellule presenti in ogni pozzo e confrontalo bene con le cellule non trattate.
      2. Espressione GFP: contare la percentuale di celle che sono GFP positive rispetto al numero totale di celle in ogni pozzo(Figura 3B).
  4. Trattamento plasmide di sovraespressione
    1. Risospendere le cellule nel supporto delle cellule tumorali (il volume dipende dalle dimensioni del pellet) e contare manualmente le cellule vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Piastra 200.000 cellule per pozzo di un 6 pozzo. Ogni pozzo verrà utilizzato per un evento di trasfezione indipendente. Ogni pozzo sarà trasfetato utilizzando il set-up sviluppato per il tipo di tumore specifico (Figura 3A).
    2. 24 h dopo la trasfezione, lavare ogni pozzo con 1x PBS e incubare le cellule in soluzione di distacco delle celle calde (abbastanza per coprire il pozzo). Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per 5-10 min, a seconda dei fattori descritti nella sezione 2.15.
    3. Quando le celle vengono scollegate, contare le celle derivate da ogni singolo pozzo in modo indipendente utilizzando l'esclusione blu Trypan. Mettere 100.000 cellule per pozzo di una piastra di fissaggio ben bassa 6, assicurandosi di non mescolare le cellule derivate da pozzi diversi. Collocare la piastra nell'incubatrice a 37 gradi centigradi e lasciarla indisturbata per una settimana.
      NOTA: La durata di questo saggio è di 7 giorni, un tempo sufficiente per consentire la formazione della tumorsfera e prevenire la fusione della sfera della tumore. La fusione della tumorsfera è un fenomeno che diventa evidente quando 100.000 o più cellule sono placcate insieme in sospensione per oltre 1 settimana, che può sbilanciare la valutazione della capacità di formazione della forma della forma della tumoresfera. Nel caso in cui l'esperimento richieda tempi di incubazione più lunghi, la densità cellulare dovrebbe essere regolata o scaffold polimerici utilizzati per evitare la fusione dellatumorsferae 26.
    4. Al termine dell'esperimento, seguire i passaggi 3.5.2 e 3.6 per analizzare i dati.

6. Preparazione della tumoresfera per il trapianto di allotrapianto

  1. Posizionare sul ghiaccio la soluzione a matrice extracellulare (ECM) (50 l per allotrapianto) e i supporti delle cellule tumorali (50 l per allotrapianto).
  2. Le sfere tumorali possono essere utilizzate per i trapianti di allotrapianto. Tirare insieme tutte le sfere tumorali ottenute da un tipo di cellula o trattamento specifico in un tubo da 15 mL o 50 mL (secondo il volume totale dei supporti) (Figura 1D). Girare le sfere tumorali verso il basso a 300 x g per 5 min a RT. Rimuovere il supernatante sopra le sfere tumorali e lavarli con 10 mL di sterile 1x PBS.
  3. Ruotare di nuovo le sfere tumorali a 300 x g per 5 min a RT, aspirare il 1x PBS, e aggiungere 500 -L a 1 mL di soluzione di distacco cellulare sopra il pellet cellulare, che avvia il processo di dissociazione. Incubare le sfere tumorali nella soluzione digestiva in un bagno d'acqua tremante a 37 gradi centigradi e controllare la progressione della digestione ogni 10 min. Per aiutare la dissociazione delle sfere tumorali in una soluzione a singola cellula, pipettare le cellule su e giù per l'interruzione meccanica. Il processo di digestione potrebbe richiedere fino a 30 min.
    NOTA: Nonostante il fatto che il tempo di incubazione vari considerevolmente quando le sfere tumorali derivano da diverse cellule RMS primarie, non è mai stata osservata una significativa diminuzione della vitalità cellulare in relazione al tempo di digestione.
  4. Quando si ottiene una soluzione a cella singola, aggiungere un volume di supporti per cellule tumorali (1:1, soluzione di distacco delle cellule: supporti delle cellule tumorali) e ruotarlo verso il basso a 300 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
    NOTA: Da questo momento in esenza, tutti i passaggi devono essere eseguiti sul ghiaccio. Dopo la filatura, le sfere tumorali non formano un pellet stabile come le soluzioni a singola cella. Per assicurarsi di non sloggiare o aspirare le sfere tumorali, utilizzare una pipetta da 1 mL e aspirare delicatamente il liquido. Spostarsi su una pipetta da 200 luna quando rimane solo 1 mL.
  5. Risospendere le cellule nei supporti delle cellule tumorali fredde (il volume dipenderà dalle dimensioni del pellet), posizionare le cellule sul ghiaccio e contare le cellule vive utilizzando l'esclusione blu Trypan. Dopo aver determinato la giusta quantità di cellule da utilizzare per l'allotrapianto, risospenderle in un volume totale di 50 -L di cellule tumorali fredde. Raffreddare una punta di pipetta nei media delle cellule tumorali fredde. Quando la punta è fredda, utilizzarla per prendere 50 L di soluzione ECM e aggiungerla al tubo contenente le cellule. Non rimuovere i tubi dal ghiaccio durante questo processo.
    NOTA: Il numero di cellule da utilizzare per il trapianto deve essere determinato in base all'obiettivo sperimentale testato sul tumore: un maggior numero di cellule trapiantate diminuirà il tempo di sviluppo del tumore (20.000 cellule da tumori del RMS del topo hanno dimostrato di sviluppare in un tumore 6 settimane dopo l'iniezione). Per essere in grado di confrontare diverse linee cellulari o trattamenti diversi, è importante iniziare dallo stesso numero di cellule.
  6. Poiché le cellule sono ora pronte per il trapianto, mantenere sul ghiaccio fino all'iniezione. Posizionare una siringa di insulina da 0,5 mL con un ago da 29 G sul ghiaccio, per evitare che la soluzione cellulare diventi solida su aspirazione.
  7. Accendere il flowmetro a 200 mL/min di ossigeno e il vaporizzatore isoflurano al 2,5%. Anestetizza un topo NOD/SCID di 2 mesi posizionandolo all'interno della camera di induzione. Attendere 2–3 min fino a quando il topo appare addormentato e l'allevamento ha rallentato. Prima di iniziare la procedura, prima confermare attraverso un pizzico di piede che il mouse è addormentato, quindi applicare unguento veterinario sugli occhi. Rasare il lato destro dell'animale, aspirare la soluzione cellulare nella siringa pre-raffreddata e iniettarli sottocutaneamente nell'area rasata. Un urto visibile sotto la pelle si formerà se l'iniezione viene eseguita correttamente.
    NOTA: Gli allotrapianti cellulari possono essere eseguiti nello stesso ceppo di topo delle cellule trapiantate. Ad esempio, se le celle RMS sono state originariamente isolate da un mouse C57BL/6, l'allotrapianto può essere eseguito nei mouse C57BL/6. Se il ceppo è diverso, i topi ricognitori immunodeficienti devono essere utilizzati per evitare il rigetto. L'età dei topi ricitari può anche essere regolata a seconda dell'obiettivo sperimentale.
  8. Monitorare i topi per la formazione del tumore una volta alla settimana.
    NOTA: Per convalidare l'identità del tumore derivato dal trapianto di allotrapianto, deve essere confrontato con il tumore originale da cui le cellule sono state isolate. A questo scopo, può essere eseguita l'analisi istologica per le caratteristiche morfologiche e l'espressione di marcatori miogenici, nonché un RNAseq più completo.

Risultati

Rilevamento delle sfere tumorali
L'isolamento cellulare è stato ottimizzato per ottenere la massima eterogeneità delle popolazioni cellulari presenti nel tessuto tumorale. In primo luogo, poiché i tessuti isolati presentavano aree morfologicamente dissimili, per aumentare le possibilità di isolare le popolazioni di cellule rare uniformi, il campionamento è stato eseguito da più aree del tumore(Figura 1A, primo pannello a sinistra). I...

Discussione

Sono stati impiegati diversi metodi per l'isolamento e la caratterizzazione dei TPC dalle popolazioni cellulari eterogenee tumorali: saggi clonogenici tumorali, isolamento FACS e saggio di formazione della tumorsferae. L'asino clonogenico del tumore è stato descritto per la prima volta nel 1971, utilizzato per studi sulle cellule staminali, e solo successivamente applicato alla biologia del cancro29,30. Questo metodo si basa sulla proprietà intrinseca delle cel...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della Ellison Medical Foundation AG-NS-0843-11, e dal NIH Pilot Grant all'interno del NCI Cancer Center Support Grant P30CA030199 ad A.S.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase cell dissociation reagentGibcoA1110501Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
CeligoNexcelomCeligoMicrowell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type IILife Technologies17101015Tissue digestion enzyme
Dispase II, proteaseLife Technologies17105041Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose mediaGibco11965092Component of tumor cells media
DMEM/F12 MediaGibco11320033Component of tumosphere media
EDTAThermoFisherS312500Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse proteinGibcoPMG8041Component of tumosphere media
FACSAria II Flow CytometryBD Biosciences650033Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine SerumOmega ScientificFB-11Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agentMWI Vet Supply502017Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Discriminate live and dead cells
Goat SerumLife Technologies16210072Component of FACS buffer
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Component of FACS buffer
Horse SerumLife Technologies16050114Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagentThermoFisherL3000015Transfection Reagent
Matrigel membrane matrixCorningCB40234Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X)Gibco17502048Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic OintmentMWI Vet Supply701008Eyes ointment
PBSGibco10010023Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1Addgene6084-1GFP plasmid
Penicillin - StreptomyocinLife Technologies15140163Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basicPeprotech10018BComponent of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand ProteinR&D Systems427-FL-005Recombinant protein
Trypan blueThermoFisher15250061Discriminate live and dead cells

Riferimenti

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