마우스 횡문근에서 분리 된 원발성 종양 세포에서 종양 구체 유도 및 치료

요약

이 프로토콜은 마우스 횡문근 육종 1차 세포의 분리, 종양구 형성 및 치료, 및 종양구배양으로부터 시작되는 동종 이식이식에 대한 재현가능한 방법을 설명한다.

초록

횡문근육종 (RMS)은 어린이에게 가장 흔한 연조직 육종입니다. 상당한 노력이 RMS와 관련되었던 일반적인 돌연변이의 확인을 가능하게 하고 다른 RMS 특수형의 차별을 허용했더라도, 중요한 도전은 예후를 더 향상시키기 위하여 새로운 처리의 발달을 위해 아직도 존재합니다. myogenic 마커의 발현에 의해 확인되더라도, 기원의 세포가 아직도 제대로 이해되지 않는 때문에 RMS가 myogenic 또는 비 myogenic 기원이 있는지 여부에 대한 중요한 논쟁이 아직도 있습니다. 본 연구에서는, 마우스 RMS에 대한 종양구법 분석법에 대해 신뢰할 수 있는 방법이 제공된다. 분석법은 종양 세포의 기능적 특성에 기초하고 종양 성 기능을 가진 종양에 있는 희소한 인구의 확인을 허용합니다. 또한 재조합 단백질을 테스트하고, 형질전환 프로토콜을 종양 권 분석실험과 통합하고, 종양 발달 및 성장에 관여하는 후보 유전자를 평가하기 위한 절차도 기술되어 있다. 추가로 기재된 종양이식이식은 생체내에서종양발생 기능을 검증하기 위해 수용자 마우스로 이식하는 절차이다. 전반적으로, 기술된 방법은 다른 문맥에서 발생하는 RMS에 적용될 수 있는 희소한 RMS 종양성 집단의 신뢰할 수 있는 식별 및 시험을 허용한다. 마지막으로, 프로토콜은 약물 스크리닝 및 치료제의 향후 개발을 위한 플랫폼으로 활용될 수 있다.

서문

암은 이질적인 질병입니다. 게다가, 종양의 동일 모형은 다른 환자에 있는 다른 유전 돌연변이를 제출할 수 있고, 환자 내의 종양은 세포의 다중 인구에 의해 구성됩니다^1. 이질성은 암을 시작하고 전파하는 세포의 식별에 도전을 제시합니다, 그러나 그들의 특성은 능률적인 처리의 발달을 위해 필수적입니다. 종양 발달에 기여하는 세포의 희소한 인구인 종양 전파 세포 (TPC)의 개념은 이전에 광범위하게 검토되었습니다^2. TPC가 여러 유형의 암을 특징으로한다는 사실에도 불구하고, 신뢰할 수있는 격리를위한 마커의 식별은 여러 종양 유형^3,4,5및6에 대한 도전으로 남아 있습니다. ^{, 7명 , 8개 , 따라서,}분자 마커에 의존하지 않고 오히려 TPC 기능적 특성 (높은 자기 재생 및 낮은 부착 조건에서 성장하는 능력)에 의존하지 않는 방법, 종양 권 형성 분석법으로 알려진, 널리 적용 될 수있다 대부분의 종양에서 TPC의 식별. 중요한 것은, 이러한 분석또한 TPC의 확장을 위해 사용될 수 있으며, 따라서 암 내성^1,10에대한 암 약물 스크리닝 및 연구에 직접 적용될 수 있다.

Rhabdomyo육종 (RMS)은 어린 아이들^(11)에서가장 흔한 연조직 육종의 드문 형태입니다. Althoug RMS는 근생 마커의 발현의 평가를 통해 조직학적으로 확인될 수 있으며, 기원의 RMS 세포는 종양 발달 자극의 다중 종양 아류형 및 높은 이질성으로 인해 단명하게 특징지어지지 않았다. 실제로, 최근 연구는 RMS가 근생 또는 비 myogenic 기원인지에 대한 중요한 과학적 토론을 생성했다, RMS는 컨텍스트에 따라 다른 세포 유형에서 파생 될 수 있음을 시사^{12,13, 14세 , 15세 , 16세 , 17}. RMS 세포주에 대한 수많은 연구는 종양 발달에 관여하는 경로의 식별과 높은 자기 갱신 인구와 관련된 마커의 특성화에 대한 종양 권 형성 분석을 사용하여 수행되었습니다. ^{18세 , 19세 , 20개 , 21}.

그러나, 기원의 RMS 세포를 확인하기 위한 종양구 형성 분석법의 잠재력에도 불구하고, 1차 RMS 세포에 사용될 수 있는 신뢰할 수 있는 방법은 아직 기술되지 않았다. 이러한 맥락에서, 우리 그룹으로부터의 최근 연구는 듀첸 근이영양증(DMD) 마우스^{모델(22)에서}기원의 RMS 세포의 식별을 위한 최적화된 종양권 형성 분석기를 채택하였다. 근육 조직에서 분리된 여러 개의 종양 전 세포 유형은 부착이 낮은 조건에서 성장하는 능력에 대해 테스트되어 영양 실맥에서 RMS의 기원 세포로 근육 줄기 세포를 식별할 수 있습니다. 여기서 설명된 것은 마우스 RMS 발달을 담당하는 극히 드문 세포 집단의 식별을 위해 성공적으로 채택된 종양구 형성분석(그림 1)에대한 재현가능하고 신뢰할 수 있는 프로토콜이다.

프로토콜

마우스의 주택, 처리 및 희생은 샌포드 번햄 프리디스 의학 발견 연구소의 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 시약 준비

1. 세포 절연 배지 100 mL준비: F10 배지에 10% 말 세럼(HS)을 보충하였다.
2. 콜라게나아제 타입 II 용액 50 mL 준비: 콜라게나아제 타입 II 파우더 1 g을 세포 분리 매체 50 mL에 용해시십시오(로트에 따라 단위 수가 변하기 때문에 1 mL당 효소 단위를 주목하십시오). 용액을 Aliquot하고 사용할 준비가 될 때까지 -20 °C 냉동고에 보관하십시오.
   참고: 효소 활성은 여러 가지 로트에 걸쳐 변경될 수 있기 때문에 콜라게나아제를 사용하기 전에 모든 콜라게나제를 테스트해야 합니다.
3. 두 번째 소화 용액 샘플 당 10 mL 준비: 콜라게나제 타입 II 용액 100 단위/mL와 디스파제 II 의 2 단위/mL를 새로 가중한 세포 분리 매체. 사용하기 직전에 준비하십시오.
4. 종양 세포 매체의 500 mL준비: DMEM 고혈당20% FBS 와 1% 펜/스트렙으로 보충하였다.
5. FACS 완충액 500 mL 준비: 2.5% v/v 일반 염소 세럼과 1 mM EDTA로 보충된 1x PBS.
6. 종양권 매질 500 mL 준비: DMEM/F121% 펜/스트렙으로 보충. 사용하기 직전에, 다음과 같은 성장 인자를 추가하십시오: 1% N2 보충제, 10 ng/mL EGF, 10 ng/mL β-FGF.

2. 세포 분리 및 배양

1. 5 mL의 세포 분리 매 (종양 샘플 당 한 판)를 포함하는 10cm 플레이트를 준비하고 종양 조직을 수확 할 준비가 될 때까지 37 °C에서 인큐베이터에 놓습니다.
2. RMS는 B10 mdx 마우스와 같은 듀첸 근이영양증에 대한 남성 및 여성 마우스 모델 모두에서 자발적으로 발병하는 것으로 보고되었으며, B6 mdx/mTR 마우스에서 9개월^22,23까지. 이소플루란을 사용하여 RMS 종양을 개발하는 마우스를 마취시키고, 자궁 경부 탈구를 통해 또는 기관의 IACUC 지침에 따라 동물을 희생시다. 가위로 종양이 국한 된 부위의 피부에 절개를하고 (핀셋을 사용하여) 관심 영역에서 피부를 당깁니다. 면도날을 사용하여 동물로부터 종양을 절제하십시오.
3. 종양 조직의 500-1,000 mg의 무게를 측정하고 2.1단계(도 1A)에서제조된 플레이트에 놓습니다.
   참고: 더 많은 양의 조직이 소화 단계에 부정적인 영향을 미치고 전체 수율을 감소시입니다. 수확 된 종양이 1000 mg보다 큰 경우, 원하는 무게에 도달 할 때까지 부품으로 나누고 무작위로 샘플링하십시오. 무작위 샘플링은 조직 이질성을 평가하는 데 필요합니다.
4. 멸균 세포 배양 후드에 종양 조직을 포함하는 판을 놓고 면도날로 다진다. RMS에서 종양 조직은 이질적이다; 따라서, 다른 영역은 상처에 다른 저항을 제시 할 수있다. 최적의 소화를 보장하기 위해 결과 다진 조각의 크기가 균일되어 있는지 확인하십시오.
   참고: RMS는 모든 종양에서 확인될 수 있는 다른 조직 모형 (주로 섬유성, 혈관화되고, 지방 조직)의 혼합물로 존재합니다. 1) 이질적인 세포 집단을 정확하게 재소하는 이질적인 세포 집단을 분리하고 2) 분리 절차를 편향시키지 않고, 수확된 조직의 무작위 샘플링을 수행한다. 종양의 상이한 영역에서의 세포는 섹션 3에 기재된 분석법에서 시험관 내에서 병렬로 소화및 시험되어야 한다.
5. 다진 조직 및 세포 절연 매체를 15 mL 원심 분리튜브로 옮기고 4 mL의 세포 절연 매체로 플레이트를 세척하고 튜브에 놓습니다.
6. 콜라게나아제 용액 700 단위/mL을 추가하여 조직을 소화하고 1.5시간 동안 37°C에서 흔들리는 수조에서 배양합니다.
7. 배양 후, RT. 탄환을 방해하지 않고 상판에 5 분 동안 300 x g에서 조직을 스핀 다운하고, 두 번째 소화 용액 (디스파스)의 10 mL에서 펠릿을 다시 중단하고 37 °C에서 37 °C에서 흔들리는 수조에서 배양하십시오.
8. 두 번째 소화가 완료되면, 50 mL 원심 분리튜브에 70 μm 나일론 필터를 통해 세포 현탁액을 위아래로 피펫을 통과시다. 그런 다음 10 mL의 세포 절연 매체를 추가하여 필터를 세척하고 소화 용액을 희석하고 300 x g및 RT에서 조직을 5 분 동안 스핀 다운합니다.
9. 상월체를 흡인하고 종양 세포 매체의 20 mL에서 펠릿을 재중단시켰다. 이어서 15 cm 세포 배양 플레이트에서 세포 현탁액을 옮김을 전달한다. 세포를 밤새 37°C에서 인큐베이터에 놓는다. 이 플레이트는 P0으로 식별됩니다.
10. 고립 된 다음 날, 미디어를 변경합니다. 이 단계는 세포 생존에 부정적인 영향을 미칠 수 있는 파편과 죽은 세포의 제거를 지키기 위해 필요합니다.
11. 시작 물질 및 세포 크기의 양에 따라 30%-60%의 범위의 미디어가 변경된 후 세포 동률을 평가합니다. 그들은 90 % 합류에 도달 할 때까지 인큐베이터에서 성장하는 세포를 둡니다. 매일 세포를 모니터링하고 2 일마다 미디어를 변경합니다. 종양 세포가 동류가되는 데 필요한 시간은 종양 공격성, 종양의 유전자 형, 마우스의 나이, 조직의 이질성 등 여러 매개 변수에 따라 다릅니다.
12. 셀 패시징의 경우 다음을 수행합니다.
    1. 37°C에서 수조에서 세포 분리 용액 및 종양 세포를 미리 데운다.
    2. 1x 멸균 PBS로 세포를 세척하고 5-10 분 동안 따뜻한 세포 분리 용액의 10 mL에서 37 °C에서 배양하십시오.
    3. 모든 세포가 플레이트에서 분리되면 따뜻한 종양 세포 10 mL을 추가하고 용액을 50 mL 원심 분리 튜브로 옮기고 RT에서 5 분 동안 300 x g에서 세포를 스핀 다운하십시오.
    4. 펠릿 크기에 따라 종양 세포 5-10 mL에서 세포를 다시 중단하고, 죽은 세포를 배제하기 위해 Trypan blue (1:5 희석)를 사용하여 살아있는 세포를 계산합니다.
    5. 플레이트 10⁵ 세포 10 cm 플레이트 또는 3 x 10⁵ 세포 15cm 플레이트. 세포 배배 시간은 단계 2.10에 상세한 요인에 따라 달라집니다.

3. 종양권 파생

1. 여러 대강을 통해 세포 선택을 피하기 위해 통로 P1 또는 P2에서 종양 세포를 사용합니다(그림 1B). 플레이트에서 세포를 분리하려면 먼저 세포를 방해하지 않고 1 x PBS로 접시를 씻은 다음 세포 분리 용액 (10cm 플레이트의 경우 5 mL 또는 15cm 판의 경우 10 mL)을 사용하여 덮은 다음 5-10 분 동안 인큐베이터에 놓습니다.
2. 밝은 필드 현미경의 밑에 격판을 보고 세포가 분리된다는 것을 확인하고, 종양 세포 매체의 1:1 볼륨을 추가합니다 (세포 분리 해결책:종양 세포 매체), 원심 분리관에 세포 현탁액을 놓고 세포를 300 x g에서 아래로 돌리기 5 RT에서 분.
3. 도금에 사용되는 방법에 따라 FACS 완충제(섹션 3.4) 또는 종양구 매질(섹션 3.5)에서 세포를 재중단한다.
4. 유세포계를 통한 도금 세포
   1. FACS 버퍼에서 셀을 다시 일시 중단하고(양은 펠릿 크기에 따라 다름) Trypan 파란색 제외를 사용하여 라이브 셀을 수동으로 계산합니다. 최종 세포 농도가 10⁷ 세포 / mL (10⁶ 세포 당 FACS 버퍼의 100 μL)인지 확인하십시오. 10⁶ 세포 당 Fx 주기 바이올렛 얼룩 1 μL을 추가하여 세포 선별 중에 죽은 세포에서 살아가도록 구별하십시오. Fx 사이클 바이올렛 얼룩이 세포에 추가되지 않은 얼룩이 없는 대조군을 준비합니다.
      참고: 농도는 선별 중에 효율적인 염색 및 속도에 최적화되어 있습니다. 세포 농도가 낮으면 분류 시간이 길어지며, 농도가 높을수록 염색에 영향을 미칩니다.
   2. 스테인드 되지 않은 컨트롤을 채택 하 고, FACS 게이트 를 설정 살아 분리 (Fx 사이클 바이올렛^-) 죽은 에서 (Fx 사이클 바이올렛⁺) 세포. 그런 다음, 형광 활성화 세포 선별 (450/50 필터 밴드 패스)을 사용하여 살아있는 / 죽은 세포의 분리 및 개수를 하고 96 개의 잘 낮은 부착 플레이트의 각 우물에서 원하는 수의 라이브 셀을 도금하십시오. 플레이트의 각 웰은 분류를 시작하기 전에 종양구 면의 200 μL로 채워져야 합니다.
      참고: TPC가 전체 종양 내의 드문 하위 집단이라는 점을 감안할 때, 현탁액 배양에서 종양 구체의 형성을 관찰하기 위해 마우스 RMS에서 100 개의 세포 / 웰을 도금하여 프로토콜을 최적화하십시오. 잘 당 세포 수는 시험된 특정 종양을 위해 조정되어야 합니다.
   3. 실험이 끝날 때까지 세포를 인큐베이터에 놓습니다. 필요한 경우가 아니면 접시를 방해하지 마십시오. 30 일 실험에 대 한, 각 우물 미디어와 매주 성장 인자의 적절 한 비율로 보충 한다 (미디어 증발 하는 경향이 고 성장 인자 1 주 후 효과적 이지 않습니다).
   4. 실험이 완료된 후, 종양구를 식별하기 위해 밝은 필드 현미경으로 플레이트를 수동으로 스크리딩합니다(단계 3.6 참조).
      참고: 30일의 타임포인트는 직경 50-300 μm에 이르는 크기의 마우스 RMS 종양구를 쉽게 검출하도록 최적화되었습니다. 시험된 종양의 공격성과 증식 속도에 따라 타임포인트를 조정해야 합니다.
5. 도금 셀 수동
   1. 종양구 매질에서 세포를 다시 일시 중단 (양은 펠릿에 따라 다름) 수동으로 trypan 파란색을 사용하여 살아있는 세포를 계산 (1:10 희석). 튜브의 세포 농도를 계산하고 96웰 의 낮은 부착 플레이트에서 적절한 수의 셀을 플레이트합니다. 실험이 끝날 때까지 세포를 인큐베이터에 놓습니다. 3.4.3단계에서 설명한 바와 같이, 매체와 성장 인자를 보충하기 위해 필요한 경우가 아니면 판을 방해하지 않도록 노력한다.
   2. 실험이 완료된 후, 현미경 플레이트는 종양구를 식별하거나 Celigo 소프트웨어를 사용하여 밝은 필드 현미경으로 수동으로, 앞서 설명한 바와 같이 Kessel^{등. 24} 단계 3.6 을 참조하십시오.
6. 이 분석의 결과로 두 개의 별도의 판독을 평가할 수 있습니다: 형성된 종양 구의 수와 크기.
   참고 : 둘 이상의 세포가 우물에서 도금되면 종양 구 또는 세포 클러스터가 형성 될 수 있습니다(그림 1C,세 번째 및 네 번째 패널). 세포 클러스터는 세포 생존을 향상시키고 불규칙한 모양을 특징으로 하는 현탁액 배양에서 형성하는 작은 세포 집합체입니다. 종양구는 크고 스페로이드 모양을 가진 더 컴팩트한 구조를 가지고 있습니다. 그(것)들은 앵커리지 독립적인 방식으로 생존하고 높은 비율^25에서증식하는 기능을 가지고 있는 단 하나 세포에서 파생됩니다. 유세포계를 통해 또는 수동으로 도금 세포는 실험실에서 사용할 수있는 기능에 따라 상호 교환적으로 사용할 수 있습니다. 또한 96웰 플레이트와 다른 크기의 낮은 부착 플레이트를 채택하는 것이 가능하고 필요한 결과에 따라 달라집니다. 실제로, 종양구 주파수의 평가는 96의 잘 낮은 부착 플레이트를 채택하고, 종양성 잠재력의 평가를 위한 초기 검열은 6개의 잘 낮은 부착 플레이트에 더 빠르고 신뢰할 수 있는 결과를 산출할 것입니다.

4. 재조합 단백질종양성면역치료

1. 3.1단계와 3.2단계를 반복합니다.
2. 재조합 단백질로 치료를 설정하는 경우, 먼저 섹션 4.3에 따라 사용할 최적의 농도를 결정하거나, 최적의 농도가 이전에 결정된 경우 섹션 4.4로 건너 뜁니다.
3. 재조합 단백질 치료 농도를 결정한다.
   1. 종양권 매체에 있는 세포를 다시 중단하고 (부피는 펠릿 크기에 따라 다름) Trypan 청색 배제를 사용하여 살아있는 세포를 수동으로 계산합니다. 6 개의 잘 낮은 부착 플레이트에서 튜브 및 플레이트 100,000 셀의 세포 농도를 계산합니다. 각 농도 당 플레이트 2웰 시험 및 처리되지 않은 대조군을 위한 2개의웰(도 2). 시험할 단백질 농도는 문헌 검색을 기반으로 합니다.
   2. 상이한 단백질 농도로 현탁액 세포의 각 웰을 치료하고 세포를 인큐베이터에 48시간 동안 배치한다(세포 생존력과 하류 표적 유전자의 발현 모두에 대한 치료의 효과를 평가할 수 있는 데 필요한 시간). 그런 다음 다음 매개 변수를 평가합니다.
      1. 세포 생존: 밝은 필드 현미경을 사용하여 처리되지 않은 대조군과의 비교, 세포 형태를 검사하십시오. 건강한 세포는 현미경으로 밝고 반사되는 반면 과도한 세포 사멸은 미디어에 이물질이 축적되도록 유도합니다. 세포 사멸의 정량적 결정을 위해, 트라이판 블루 배제, 크리스탈 바이올렛 염색, MTT, 또는 TUNEL 분석(이 경우, 원래 도금에 잘 첨가)을 사용할 수 있다.
      2. 다운스트림 경로에 재조합 단백질의 효과: 시험된 단백질에 의해 영향을 받는 것으로 알려진 다운스트림 유전자의 식별을 위해 PubMed를 사용하여 문헌 검색을 수행한다. 표적 유전자에 대한 qRT-PCR 프라이머를 설계하고, 처리된 세포로부터 분리된 RNA에 대한 qRT-PCR 분석을 수행한다(도2).
4. 재조합 단백질로 치료하십시오.
   1. 종양권 매체에 있는 세포를 다시 중단하고 (부피는 펠릿 크기에 따라 다름) Trypan 청색 배제를 사용하여 살아있는 세포를 수동으로 계산합니다. 원하는 실험에 필요한 총 세포 수(96개의 잘 낮은 부착 판의 각 웰당 100개의 세포)를 결정하고 적절한 종양구 하부 부피에서 희석한다. 하나 이상의 치료를 수행하는 경우 별도의 세포 튜브를 준비하십시오.
   2. 각 튜브를 재조합 단백질의 적절한 농도로 처리하고 세포를 96개의 잘 낮은 부착 플레이트의 별도의 우물로 플레이트합니다. 치료는 실험의 30일 종점까지 재조합 단백질의 반감기에 따라 각각의 웰에 대해 반복될 것이다.
   3. 실험이 끝나면 3.4.4 단계와 3.6 단계를 수행하여 데이터를 분석합니다.

5. 과발현 플라스미드를 가진 종양권 처리

1. 3.1단계와 3.2단계를 반복합니다.
2. 새로운 종양 유형에 대한 치료를 설정하는 경우, 먼저 다음 섹션 5.3을 사용하는 플라스미드의 가장 좋은 농도를 결정하거나, 최적의 DNA 농도가 이전에 결정된 경우, 섹션 5.4로 건너뜁니다.
3. 최적의 플라스미드 농도를 결정합니다.
   1. 종양 세포 매체에 있는 세포를 다시 일시 중단 (부피는 펠릿 크기에 따라 다름) 그리고 Trypan 블루 배제를 사용하여 살아있는 세포를 수동으로 계산합니다. 70%-90%에서 의 과류를 달성하기 위해 카운트된 세포를 플레이트(세포 수량은 세포 크기 및 형태에 매우 의존한다). GFP-플라스미드는 부착 세포에 대한 형질감염 시약의 제조자 프로토콜에 따라 형질감염 효율을 테스트하기 위해 사용될 것이다. 병렬로, 또한 처리되지 않은 대조군을 시험한다(도3A). 24웰 플레이트에서 효율 테스트를 수행합니다.
      참고 : 부착 세포는 현탁액 세포에서 수행 된 형질 감염이 효율적이지 않고 세포 생존에 부정적인 영향을 미치기 때문에 형질 감염 효율을 향상시키는 데 사용됩니다.
   2. 48 h 후 형질 감염은 다음과 같은 매개 변수에 대한 세포를 평가합니다:
      1. 세포 생존: 밝은 필드 현미경을 사용하여, 각 우물에 존재하는 세포의 수를 비교하고 처리되지 않은 세포에 잘 비교하십시오.
      2. GFP 발현: 각 웰의 총 셀 수에 대해 GFP 양성 인 세포의 백분율을 계산합니다(도 3B).
4. 과발현 플라스미드 처리
   1. 종양 세포 매체에 있는 세포를 다시 일시 중단 (부피는 펠릿 크기에 따라 다름) 그리고 Trypan 블루 제외를 사용하여 살아있는 세포를 수동으로 계산합니다. 플레이트 200,000 웰 당 6 웰 플레이트. 각 웰은 독립적인 변환 이벤트에 사용됩니다. 각각의 웰은 특정 종양 유형에 대해 개발된 설정을 사용하여 형질감염될것이다(도 3A).
   2. 형질전환 후 24 시간, 1 x PBS로 각 잘 씻어 내고 따뜻한 세포 분리 용액으로 세포를 배양하십시오 (우물을 덮을 만큼). 2.15절에 상세히 기세된 요인에 따라 플레이트를 37°C에서 5-10분 동안 인큐베이터에 놓습니다.
   3. 셀이 분리되면 Trypan 파란색 제외를 사용하여 각 단일에서 파생된 셀을 독립적으로 계산합니다. 6개의 잘 낮은 부착 플레이트의 웰당 100,000개의 세포를 배치하여 다른 우물에서 파생된 세포를 혼합하지 않도록 합니다. 접시를 37 °C에서 인큐베이터에 놓고 일주일 동안 방해받지 않고 둡니다.
      참고 : 이 분석의 지속 기간은 7 일이며, 종양 권 융합을 방지하면서 종양 권 형성을 허용하기에 충분한 시간입니다. 종양권 융합은 100,000개 이상의 세포가 1주일 이상 현탁액으로 함께 도금될 때 명백해지는 현상으로, 이는 종양권 형성 능력의 평가를 편향시킬 수 있다. 실험이 더 긴 배양 시간을 필요로 하는 경우에, 세포 밀도는 종양구^{융합(26)을}피하기 위해 사용되는 조절 또는 중합체 스캐폴드를 필요로 한다.
   4. 실험이 끝나면 3.5.2 단계와 3.6 단계를 수행하여 데이터를 분석합니다.

6. 동종 이식에 대한 종양 권 제제

1. 세포외 매트릭스(ECM) 용액(동종 이식당 50 μL)과 종양 세포 매질(동종 이식당 50 μL)을 얼음 위에 놓습니다.
2. 종양구는 동종 이식이식에 사용될 수 있다. 특정 세포 유형 또는 치료로부터 수득된 모든 종양구를 15 mL 또는 50 mL 튜브로 함께 당깁니다(전체 부피에 따라)(도 1D). RT에서 5 분 동안 300 x g에서 종양 구를 회전시키고 종양 구체 위에 상류층을 제거하고 멸균 1x PBS 10 mL로 씻으십시오.
3. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 종양 구를 다시 돌리고 1 x PBS를 흡인하고 해리 과정을 시작하는 세포 펠릿 위에 500 μL의 세포 분리 용액을 추가합니다. 37°C에서 수조에 소화용액내의 종양구를 배양하고 10분마다 소화의 진행을 확인한다. 종양구가 단일 세포 용액으로 해리되도록 돕기 위해 세포를 위아래로 피펫하여 기계적 장애를 해결하십시오. 소화 과정은 30 분까지 걸릴 수 있습니다.
   참고 : 종양 구가 다른 1 차 RMS 세포에서 파생 될 때 배양 시간이 상당히 다르다는 사실에도 불구하고, 소화 시간과 관련하여 세포 생존력의 현저한 감소는 결코 관찰되지 않았습니다.
4. 단일 세포 용액이 수득되면 종양 세포 매물 (1 :1, 세포 분리 용액 : 종양 세포 매체)을 추가하고 4 °C에서 5 분 동안 300 x g에서 아래로 돌입니다.
   참고 : 이 때부터 모든 단계를 얼음위에서 수행해야합니다. 회전 후, 종양 구는 단일 세포 솔루션처럼 안정적인 펠릿을 형성하지 않습니다. 종양을 빼내거나 흡인하지 않도록 하려면 1 mL 파이펫을 사용하고 액체를 부드럽게 흡인하십시오. 1mL만 남아 있을 때 200 μL 파이펫으로 이동합니다.
5. 차가운 종양 세포 매체에 있는 세포를 다시 일시 중단 (부피는 펠릿 크기에 따라 달라집니다), 얼음에 세포를 배치 하 고 Trypan 블루 제외를 사용 하 여 라이브 세포를 계산. 동종 이식에 사용할 세포의 적당량을 결정한 후, 감기 종양 세포 의 총 부피 50 μL에서 이를 다시 중단시낸다. 차가운 종양 세포 매체에서 파이펫 팁을 식힙니다. 팁이 차가울 때, ECM 용액 의 50 μL을 취하고 세포를 포함하는 관에 추가하는 것을 이용하십시오. 이 과정에서 얼음에서 튜브를 제거하지 마십시오.
   참고 : 이식에 사용할 세포의 수는 종양 테스트 및 실험 목표에 따라 결정되어야한다 : 이식 세포의 큰 수는 종양 발달의 시간을 감소시킬 것이다 (마우스 RMS 종양 구에서 20,000 세포는 종양으로 개발 6 주사 후 주). 다른 세포주 또는 다른 치료법을 비교할 수 있도록, 동일한 수의 세포로부터 시작하는 것이 중요하다.
6. 세포는 이제 이식을 위해 준비되었으므로 주입 될 때까지 얼음을 유지하십시오. 얼음에 29 G 바늘로 덮인 0.5 mL 인슐린 주사기를 놓고, 포부시 세포 용액이 단단해지는 것을 방지하십시오.
7. 유량계를 200 mL/min 산소로 켜고 이소플루란 기화기를 2.5%로 설정합니다. 유도 챔버 안에 배치하여 2 개월 된 남성 NOD / SCID 마우스를 마취. 마우스가 잠들어 번식속도가 느려질 때까지 2-3분 기다립니다. 절차를 시작하기 전에 먼저 발 꼬집을 통해 마우스가 잠들어 있는지 확인한 다음 수의사 연고를 눈에 바르습니다. 동물의 오른쪽을 면도하고, 미리 냉각 된 주사기에서 세포 용액을 흡인하고, 면도 부위에 피하주사하십시오. 주사가 올바르게 수행되면 피부 아래에 보이는 범프가 형성됩니다.
   참고: 세포 동종 이식은 이식된 세포의 것과 동일한 마우스 변형에서 수행될 수 있다. 예를 들어, RMS 세포가 원래 C57BL/6 마우스로부터 분리된 경우, 동종 이식은 C57BL/6 마우스에서 수행될 수 있다. 균주가 다른 경우, 면역 결핍 수용자 마우스는 거부를 피하기 위해 활용되어야한다. 수용자 마우스의 연령은 또한 실험 목표에 따라 조정할 수 있습니다.
8. 일주일에 한 번 종양 형성을 위해 마우스를 모니터링합니다.
   참고 : 동종 이식에서 파생 된 종양의 정체성을 검증하려면 세포가 분리 된 원래 종양과 비교해야합니다. 이를 위해, 형태학적 특징 및 근생 마커의 발현뿐만 아니라 보다 포괄적인 RNAeq에 대한 조직학적 분석을 수행할 수 있다.

결과

종양구 검출
세포 격리는 종양 조직에 존재하는 세포 집단의 최대 이질성을 얻기 위해 최적화되었다. 첫째, 단리조직이 형태학적으로 이질적인 영역을 제시한 이후, 균일한 희귀 세포 집단을 분리할 가능성을 높이기 위해, 샘플링은 종양의 여러 부위로부터 수행되었다(도1A,왼쪽의 첫 번째 패널). 둘째, 수확된 시료의 기계적 해리는 다...

토론

종양 이질성 세포 집단으로부터의 TPC의 격리 및 특성화: 종양 투종 분석법, FACS 격리 및 종양구 형성 분석법에서 여러 가지 방법이 채택되었다. 종양 투동성 분석은 1971년에 처음 기술되었으며, 줄기 세포 연구에 사용되었으며, 이후 암 생물학^29,30에만적용되었다. 이 방법은 연겔^{배양물(31)에서}제약 없이 확장되는 암 줄기세포 본질적 성...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase cell dissociation reagent	Gibco	A1110501	Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
Celigo	Nexcelom	Celigo	Microwell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type II	Life Technologies	17101015	Tissue digestion enzyme
Dispase II, protease	Life Technologies	17105041	Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose media	Gibco	11965092	Component of tumor cells media
DMEM/F12 Media	Gibco	11320033	Component of tumosphere media
EDTA	ThermoFisher	S312500	Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse protein	Gibco	PMG8041	Component of tumosphere media
FACSAria II Flow Cytometry	BD Biosciences	650033	Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agent	MWI Vet Supply	502017	Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet Stain	Life Technologies	F10347	Discriminate live and dead cells
Goat Serum	Life Technologies	16210072	Component of FACS buffer
Ham's F10 Media	Life Technologies	11550043	Component of FACS buffer
Horse Serum	Life Technologies	16050114	Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagent	ThermoFisher	L3000015	Transfection Reagent
Matrigel membrane matrix	Corning	CB40234	Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X)	Gibco	17502048	Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic Ointment	MWI Vet Supply	701008	Eyes ointment
PBS	Gibco	10010023	Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1	Addgene	6084-1	GFP plasmid
Penicillin - Streptomyocin	Life Technologies	15140163	Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basic	Peprotech	10018B	Component of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand Protein	R&D Systems	427-FL-005	Recombinant protein
Trypan blue	ThermoFisher	15250061	Discriminate live and dead cells