JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה המיומנת לבידוד של תאים ראשוניים של העכבר השרירים, היווצרות tumorsphere וטיפול, השתלת השתלת החל בתרבויות tumorsphere.

Abstract

הרדויוסרקומה (RMS) הוא סרקומה רקמת רך השכיח ביותר אצל ילדים. למרות מאמצים משמעותיים אפשרו זיהוי של מוטציות נפוצות הקשורות RMS ומותר אפליה של תתי סוגים שונים, האתגרים העיקריים עדיין קיימים לפיתוח של טיפולים חדשניים כדי לשפר עוד יותר פרוגנוזה. למרות שהוא מזוהה על ידי הביטוי של סמנים מיוגניים, יש עדיין מחלוקת משמעותית על האם RMS יש מקורות או לא מזוגניים, כמו תא המוצא עדיין מובן בצורה גרועה. במהלך המחקר הנוכחי, שיטה אמינה מסופקת עבור הספק הטמורספירה עבור העכבר RMS. המנה מבוססת על תכונות פונקציונליות של תאים סרטניים ומאפשרת זיהוי של אוכלוסיות נדירות בגידול עם פונקציות tuמוריגניים. מתוארים גם הליכים עבור בדיקות רקומביננטי חלבונים, שילוב פרוטוקולי החצייה עם שיטת tumorsphere, והערכת גנים המועמדים המעורבים בפיתוח וצמיחה הגידול. תיאר עוד הוא הליך השתלת השתלת של tumorspheres לתוך עכברי הנמען כדי לאמת את הפונקציהtumorspheres ב vivo. באופן כללי, השיטה המתוארת מאפשרת זיהוי ובדיקה אמינים של אוכלוסיות מתוגני מחלות מחלות שניתן להחילם על RMS העולות בהקשרים שונים. לבסוף, הפרוטוקול יכול להיות מנוצל כפלטפורמה עבור הקרנת סמים ופיתוח עתידי של therapeutics.

Introduction

סרטן היא מחלה הטרוגנית; יתר על כן, אותו סוג של גידול יכול להציג מוטציות גנטיות שונות בחולים שונים, ובתוך החולה גידול מורכב על ידי אוכלוסיות מרובות של תאים1. טרוגניות מציג אתגר בזיהוי של תאים האחראים על ייזום והפצת סרטן, אבל האפיון שלהם חיוני לפיתוח של טיפולים יעילים. הרעיון של הגידול תאים הפצת (TPC), אוכלוסייה נדירה של תאים שתורמים להתפתחות הגידול, כבר נבדקו בעבר בהרחבה2. למרות העובדה tpcs התאפיין בסוגים מרובים של סרטן, זיהוי של סמנים עבור בידוד אמין שלהם נשאר אתגר עבור מספר סוגי גידולים3,4,5,6 , מיכל סבן , בן שמונה , 9. Thus, שיטה שאינה נשענת על סמנים מולקולריים אלא על תכונות פונקציונליות tpc (התחדשות עצמית גבוהה ויכולת לצמוח בתנאים בעלי קבצים מצורפים נמוכים), המכונה שיטת היווצרות tumorsphere, ניתן להחיל נרחב על ה זיהוי של TPCs מרוב הגידולים. חשוב מכך, שיטת הפעולה יכולה גם להיות מועסק להרחבת tpcs ובכך להחיל ישירות על הקרנת תרופות לסרטן ומחקרים על התנגדות לסרטן1,10.

הרדויוסרקומה (RMS) היא צורה נדירה של סרקומה של רקמה רכה הנפוצה ביותר בילדים צעירים11. לאחר ההערכה ניתן לזהות היסטולוגית באמצעות הערכת הביטוי של סמנים מיוגניים, תא RMS של המקור לא כבר univocally מאופיין בשל תת הסרטניים מרובים טרוגניות גבוהה של גירויים התפתחותיים הגידול. ואכן, מחקרים שנעשו לאחרונה יצרו דיון מדעי משמעותי על האם rms הוא של מקורות מיוגניים או לא מיוגניים, הרומז כי rms עשוי לנבוע מסוגי תאים שונים בהתאם להקשר12,13, מיכל בן 14 , מיכל בן 15 , מיכל בן 16 , 17. מחקרים רבים על קווי התאים של RMS בוצעו באמצעות שיטת היווצרות tumorsphere לזיהוי של מסלולים מעורבים בפיתוח הגידול ואפיון של סמנים הקשורים לאוכלוסיות התחדשות עצמית מאוד מיכל בן 18 , מיכל בן 19 , מיכל בן 20 , . עשריםואחד

עם זאת, למרות היכולת של היווצרות הצורה tumorsphere לזיהוי תאי RMS של המקור, שיטה אמינה שניתן ליישם בתאי RMS ראשוניים עדיין לא תוארה. בהקשר זה, מחקר שנערך לאחרונה מהקבוצה שלנו מועסקים שיטת היווצרות ממוטבת tumorsphere לזיהוי של תאי RMS המקור ב ניוון שרירים Duchenne (DMD) העכבר מודל22. סוגים מרובים של תא מראש, מבודדים מרקמות שרירים, נבדקים על יכולתם לצמוח בתנאים מצורפים נמוכה, המאפשר זיהוי של תאי גזע שריר כמו תאים של מוצא RMS בהקשרים הדיסטרומכולה. מתואר כאן הוא פרוטוקול מהימן ואמין עבור שיטת היווצרות tumorsphere (איור 1), אשר הועסק בהצלחה לזיהוי של אוכלוסיות תאים נדירים ביותר האחראים לפיתוח העכבר RMS.

Protocol

הדיור, הטיפול והקרבת העכברים בוצעו בעקבות פרוטוקול IACUC מאושר של מכון הגילוי הרפואי סנפורד ברנהם.

1. הכנה מגיב

  1. להכין 100 mL של בידוד התא מדיה: מדיום F10 בתוספת עם 10% סרום סוסים (HS).
  2. הכינו 50 mL של הפתרון השני של הקולגן מסוג II: לפזר 1 גרם של אבקת קולגן סוג II ב 50 mL של מדיה בידוד התא (לשים לב יחידות של האנזים עבור 1 mL של מדיה, מאז מספר היחידות שינויים בהתאם למגרש). הגבר את הפתרון ואחסן במקפיא של 20 ° c עד שהוא מוכן לשימוש.
    הערה: כל הרבה הקולגן צריך להיבדק לפני השימוש, מאז פעילות האנזים עשוי להשתנות בין הרבה שונים.
  3. הכינו 10 מ ל לכל מדגם של פתרון העיכול השני: תאים בידוד מדיה עם 100 יחידות/mL של הפתרון סוג II של הקולגן ו 2 יחידות/mL של dispase השני טרי משוקלל. הכן מיד לפני השימוש.
  4. להכין 500 mL של מדיה תאים סרטניים: הגלוקוז גבוהה DMEM בתוספת 20% FBS ו 1% עט/דלקת.
  5. הכינו 500 mL של מאגר FACS: 1x PBS בתוספת עם 2.5% v/v/סרום עז רגיל 1 מ"מ EDTA.
  6. להכין 500 mL של מדיה tumorsphere: Dמאמ/F12 שיושלם עם 1% עט/דלקת. רק לפני השימוש, להוסיף את גורמי הצמיחה הבאים: 1% N2 תוספת, 10 ng/mL EGF, ו 10 ng/mL β-FGF.

2. בידוד תאים ותרבות

  1. להכין צלחת 10 ס מ המכיל 5 מ ל של תאים בידוד מדיה (צלחת אחת לכל מדגם הגידול) ולמקם אותו בחממה ב 37 ° צ' עד מוכן לקצור את רקמת הגידול.
  2. RMS דווחו באופן ספונטני להתפתח בשני מודלים העכבר זכר ונקבה עבור ניוון שרירים duchenne, כגון עכברים B10 mdx בסביבות 18 חודשים של גיל ו-B6 mdx/ה-mTR עכברים על ידי 9 חודשים22,23. העבר את העכבר שמפתח את הגידול של RMS באמצעות isof, ולהקריב את החיה דרך נקע בצוואר הרחם או על פי הנחיות IACUC של המוסד. עם מספריים, לעשות חתך על העור באזור שבו הגידול הוא מקומי, ו (באמצעות מספריים) למשוך את העור הרחק מאזור העניין. , להעסיק סכין גילוח. לבלו את הגידול מהחיה
  3. שוקלים 500 – 1000 מ"ג של רקמת הגידול ומניחים אותו בצלחת מוכן בשלב 2.1 (איור 1A).
    הערה: כמויות גדולות יותר של רקמות משפיעות לרעה על צעדי העיכול ומפחיתים את התשואה הכוללת. אם הגידול שנקטפו גדול מ 1000 מ"ג, לחלק אותו לחלקים ולדגום באקראי עד המשקל הרצוי מגיע. דגימה אקראית נחוצה להערכת טרוגניות רקמות.
  4. מניחים את הצלחת המכילה רקמות הגידול במכסה התרבותי של התרבות התא והוא מציץ אותו עם להב תער. רקמת הגידול מ-RMS היא הטרוגנית; כך, אזורים שונים עשויים להציג התנגדות שונה החתכים. ודא כי הגדלים של חתיכות העוף הנובעות הם אחידים כדי להבטיח עיכול אופטימלי.
    הערה: RMS קיים כתערובות של סוגים שונים של רקמות (בעיקר פיברוטיק, וברקמות שומניות) שניתן לזהות בכל גידול. 1) לבודד את האוכלוסייה התא הטרוגנית באופן מדויק משנה את ההרכב של הגידול המקורי 2) לא הטיה הליך בידוד, לבצע דגימה אקראית של רקמת שנקטפו. תאים מאזורים שונים של הגידול צריך להיות מתעכל ונבדק במקביל בתוך מבחנה באותו הסדר המתואר בסעיף 3.
  5. להעביר את הרקמה בידוד טחון תא בתוך 15 מ"ל שפופרת צנטריפוגה, לשטוף את הצלחת עם 4 מ ל של מדיה בידוד התא ולמקם אותו בצינור.
  6. הוסף 700 יחידות/mL של הפתרון הקולגן כדי לעכל את הרקמה והדגירה באמבט מים רועד ב 37 ° צ' עבור 1.5 h.
  7. לאחר הדגירה, לסובב את הרקמה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT. מבלי להפריע את הגלולה, להשעות את הגלולה ב 10 מ ל של פתרון העיכול השני (dispase), ו דגירה באמבט מים רועד ב 37 ° צ' עבור 30 דקות.
  8. לאחר העיכול השני הושלמה, ללטף למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא דרך מסנן ניילון 70 יקרומטר על שפופרת צנטריפוגה 50 mL. ואז להוסיף 10 מ ל של מדיה בידוד התא כדי לשטוף את המסנן ולדלל את פתרון העיכול, ולסובב את הרקמה ב 300 x g ו RT עבור 5 דקות.
  9. ולהשעות את הגלולה ב -20 מ ל. של מדיית תאי הגידול ואז להעביר את ההשעיה התא בלוח 15 ס מ לתרבות התא. הציבו את התאים בחממה ב-37 ° c בלילה. לוחית זו תזוהה כ-P0.
  10. , יום אחרי בידוד. שנה את התקשורת שלב זה נחוץ להבטחת הסרת פסולת ותאים מתים שעלולים להשפיע לרעה על הישרדות התאים.
  11. הערכת שליטה בתאים לאחר המדיה משתנה, הנעה בין 30%-60% בהתאם לכמות החומר ההתחלתי וגודל התא. השאירו את התאים גדלים בחממה עד שהם מגיעים 90% שליטה. מפקחים על התאים כל יום ומחליפים מדיה כל יומיים. הזמן הדרוש עבור תאים סרטניים להיות confluent משתנה בהתאם לפרמטרים מרובים: תוקפנות הגידול, גנוטיפ של הגידול, גיל של העכבר, טרוגניות של הרקמה.
  12. עבור הפסנת תא, בצע את הפעולות הבאות:
    1. לחמם מראש את פתרון הניתוק התא ואת תאי הגידול מדיה באמבט מים ב 37 ° c.
    2. לשטוף את התאים עם ה-PBS 1 x סטרילי ו-דגירה אותם ב 37 ° c ב 10 מ ל של פתרון התנתקות התא חם עבור 5 – 10 דקות.
    3. כאשר כל התאים מנותקים מהצלחת, להוסיף 10 מ ל של מדיה תאים סרטניים חמים, להעביר את הפתרון לתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL ותאי ספין למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
    4. להשעות את התאים בתוך 5 – 10 מ ל של מדיה בתאי הגידול, בהתאם לגודל הגלולה, ולספור תאים חיים באמצעות טרילון כחול (1:5 דילול) כדי לא לכלול תאים מתים.
    5. צלחת 105 תאים 10 ס"מ לוחות או 3 x 105 תאים ב 15 ס מ לוחות. זמן ההכפלה של התא משתנה בהתאם לגורמים המפורטים בשלב 2.10.

3. הנגזרת של טומורספירה

  1. השתמש בתאי הגידול במעבר P1 או P2 כדי למנוע בחירת התא באמצעות מספר פסקאות (איור 1B). כדי לנתק את התאים מהצלחת, ראשית לשטוף את הצלחת עם 1x PBS, מבלי להפריע את התאים, לאחר מכן לכסות אותם באמצעות התנתקות תא פתרון (5 מ ל על צלחת 10 ס"מ או 10 מ ל על צלחת 15 ס מ) ולמקם אותם בחממה עבור 5 – 10 דקות.
  2. ודא כי תאים מנותקים על ידי מסתכל על הצלחת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, להוסיף 1:1 נפח של תאים סרטניים מדיה (התנתקות תא פתרון: מדיה תאים הגידול), מקום ההשעיה התא בצינור צנטריפוגה ולסובב את התאים למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT.
  3. השהה את התאים מחדש במאגר ה-FACS (סעיף 3.4) או באמצעי מדיה (סעיף 3.5), בהתאם לשיטה המשמשת לציפוי.
  4. ציפוי תאים באמצעות cytometer זורם
    1. השהה תאים מחדש במאגר FACS (הסכום תלוי בגודל הגלולה) ותספור באופן ידני את התאים החיים באמצעות טריפה כחול הדרה. ודא כי ריכוז התא הסופי הוא 107 תאים/mL (100 μl של מאגר facs לכל 106 תאים). הוסף 1 μL של Fx מחזור סגול כתם לכל 106 תאים כדי להפלות חיים מתאים מתים במהלך מיון התא. הכינו שליטה בלתי מוכתמת שבה הכתם Fx מחזור סגול אינו מתווסף לתאים.
      הערה: הריכוז ממוטב לצביעת ומהירות יעילים במהלך המיון. ריכוז תא נמוך יותר יגרום לזמן מיון ארוך יותר, בעוד ריכוז גבוה יותר ישפיע על כתמים.
    2. העסקת שליטה ללא ויטראז ', להגדיר את השער FACS פנקסי בחיים (Fx מחזור סגול-) מן המתים (Fx מחזור סגול+) תאים. לאחר מכן, מעסיקים מיון תא פלורסנט המופעל (עם 450/50 הלהקה מסנן לעבור) עבור הפרדה לספור של תאים חיים/מתים לציפוי המספר הרצוי של תאים חיים בכל טוב של 96 היטב לוחיות מצורף נמוך. כל טוב של הצלחת צריך להיות מלא עם 200 μL של מדיה tumorspheres לפני תחילת המיון.
      הערה: בהינתן כי TPCs הם אוכלוסיית משנה נדירה בתוך הגידול כולו, למטב את הפרוטוקול על ידי ציפוי 100 תאים/גם מ-RMS העכבר כדי להתבונן היווצרות של הספירות בתרבות ההשעיה. מספר התא לכל טוב צריך להיות מותאם עבור הגידול המסוים נבדק.
    3. הצב תאים בחממה עד לסוף הניסוי. נסה לא להפריע לצלחת. אלא אם כן יש צורך עבור ניסוי של 30 יום, כל טוב צריך להיות מתחדש עם התקשורת ואת החלק המתאים של גורמי הצמיחה מדי שבוע (התקשורת נוטים להתאדות וגורמי גדילה אינם יעילים לאחר 1 שבוע).
    4. לאחר סיום הניסוי, לוחיות המסך באופן ידני תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לזהות כדורי הטמורים (ראה שלב 3.6).
      הערה: נקודת זמן של 30 ימים היה ממוטב כדי לזהות בקלות את כדורי העכבר של RMS בגדלים הנע בין 50-300 יקרומטר קוטר. נקודת הזמן צריך להיות מותאם בהתאם לתוקפנות של הגידול נבדק ואת שיעור ההתרבות שלה.
  5. ציפוי תאים באופן ידני
    1. השהה תאים מחדש במדיית tumorsphere (הסכום תלוי בגלולה) ולספור באופן ידני תאים חיים באמצעות טריפה כחול (1:10 דילול). לחשב את הריכוז התא בצינור ולוחית את המספר הנכון של תאים בלוח 96 מצורף נמוכה היטב. הצב תאים בחממה עד לסוף הניסוי. נסה לא להפריע את הצלחת אלא אם כן הצורך לחידוש מדיה וגורמי גדילה, כפי שמתואר בשלב 3.4.3.
    2. לאחר סיום הניסוי, לוחיות המסך באופן ידני תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לזהות כדורים מבוססי או באמצעות התוכנה Celigo, כפי שתוארה בעבר Kessel et al.24 ראה שלב 3.6 למטה.
  6. שים לב שניתן להעריך שתי קריאות נפרדות כתוצאה מהחישוב הזה: מספר וגודל הספירות הנוצרות.
    הערה: כאשר יותר מתא אחד מצופה בבאר, כדורים או אשכולות תאים יכולים ליצור (איור 1C, לוחות שלישי וארבעה). אשכולות התא הם אגרגטים סלולריים קטנים היוצרים בתרבות ההשעיה המשפרים את הישרדות התאים ומאופיינים בצורה לא סדירה. כדורי טומורו הם גדולים ויש להם מבנה קומפקטי יותר עם צורה ספרואיד. הם נובעים מתא אחד שיש לו את היכולת לשרוד באופן עצמאי מעגן ומתרבים בקצב גבוה25. בתאי ציפוי דרך cytometer או באופן ידני ניתן להשתמש לסירוגין, בהתאם ליכולות הזמינות במעבדה. כמו-כן, שימוש בלוחות מצורפים נמוכים בגודל שונה מ-96 לוחיות הרישוי אפשרי ותלוי בתוצאה הנדרשת. אכן, הערכה של תדר tumorsphere צריך להיעשות העסקת 96 היטב לוחות מצורף נמוך, ואילו הקרנה ראשונית להערכת תאים הפוטנציאל tumorsphere תניב התוצאות מהיר ואמין על 6 היטב לוחות מצורף נמוך.

4. הטיפול ברקומביננטי בחלבונים

  1. חזור על שלבים 3.1 ו-3.2.
  2. אם הגדרת טיפול עם חלבונים רקומביננטי, תחילה קבע את הריכוז הטוב ביותר לשימוש בסעיף 4.3, או אם הריכוז האופטימלי נקבע בעבר, לדלג על סעיף 4.4.
  3. לקבוע את הריכוז טיפול בחלבון רקומביננטי.
    1. השהה מחדש את התאים במדיית tumorsphere (אמצעי האחסון תלוי בגודל גלולה) ולספור באופן ידני תאים חיים באמצעות טריפה כחול הדרה. לחשב ריכוז תא בצינור ואת הצלחת 100,000 תאים ב 6 היטב מצורף לוחית. צלחת שתי בארות לכל ריכוז נבדק ושתי בארות עבור פקדים לא מטופלות (איור 2). ריכוזי חלבונים שיש לבחון מבוססים על חיפוש ספרות.
    2. לטפל כל הטוב של תאים ההשעיה עם ריכוז חלבון שונה ומניחים את התאים בחממה עבור 48 h (הזמן הדרוש כדי להיות מסוגל להעריך את ההשפעה של הטיפול הן על הכדאיות התא והן על הביטוי של גנים היעד במטה). לאחר מכן, העריכו את הפרמטרים הבאים:
      1. הישרדות התא: באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, כמו גם השוואה עם פקדים לא מטופל, לבדוק מורפולוגיה התא. תאים בריאים נראים בהירים רפלקטיבית מתחת למיקרוסקופ, בעוד מוות תאים מוגזם יגרום להצטברות של פסולת בתקשורת. לקביעת כימות של מוות תאים, הדרה כחול של טרילון, כתמים סגולים בדולח, MTT, או שיטת TUNEL יכול להיות מועסק (במקרה זה, להוסיף היטב את הציפוי המקורי).
      2. ההשפעה של חלבונים רקומביננטי על מסלולים במורד הזרם: לבצע חיפוש ספרות באמצעות הפומד לזיהוי של גנים המטה ידוע להיות מושפע חלבון נבדק. רביעיית עיצוב-PCR התחל את הגנים המטרה ובצע ניתוח של רביעיית ה-PCR ב-RNA המבודד מהתאים התייחסו (איור 2).
  4. . לטפל בחלבון רקומביננטי
    1. השהה מחדש את התאים במדיית tumorsphere (אמצעי האחסון תלוי בגודל גלולה) ולספור באופן ידני תאים חיים באמצעות טריפה כחול הדרה. לקבוע את המספר הכולל של תאים הדרושים עבור הניסוי הרצוי (100 תאים לכל הבאר של 96 מצורף היטב לוחית המצורף) ולדלל אותם בעוצמת המדיה המתאימה tumorsphere. אם מבצעים יותר מטיפול אחד, הכינו שפופרות תאים נפרדות.
    2. התייחס לכל צינור עם הריכוז המתאים של חלבון רקומביננטי וצלחת התאים בבאר נפרדת של 96 היטב לוחית מצורף נמוכה. הטיפול יחזור על כל הטוב בהתאם למחצית החיים של החלבון הרקומביננטי עד לנקודת הקצה של 30 הימים של הניסוי.
    3. בסוף הניסוי, בצע את השלבים 3.4.4 ו 3.6 כדי לנתח את הנתונים.

5. הטיפול בטמורספירה באמצעות פלמידים

  1. חזור על שלבים 3.1 ו-3.2.
  2. אם הגדרת את הטיפול על סוג הגידול החדש, תחילה לקבוע את הריכוז הטוב ביותר של פלבמיד להשתמש בסעיף 5.3, או אם ריכוז ה-DNA האופטימלי נקבע בעבר, לדלג על סעיף 5.4.
  3. קביעת ריכוז פלסטי מיטבי.
    1. השהה תאים מחדש בתאי הגידול במדיה (אמצעי האחסון תלוי בגודל הגלולה) ומספור באופן ידני תאים חיים באמצעות הדרה של טריבין כחול. צלחת התאים שנספרו כדי להשיג שליטה מ 70% – 90% (מספר התא הוא תלוי מאוד בגודל התא מורפולוגיה). GFP-פלגמיד יהיה לבדוק את יעילות הזיהום בעקבות פרוטוקול היצרן של הזיהום מגיב עבור תאים חסיד. במקביל, בדוק גם שליטה לא מטופלת (איור 3A). לבצע בדיקת יעילות בצלחת 24 היטב.
      הערה: התאים החסיד משמשים כדי לשפר את יעילות התרגום, כמו העברה המבוצעת על התאים ההשעיה אינו יעיל לרעה משפיע על הכדאיות בתאים.
    2. 48 h לאחר מידת הזיהוי של תאים עבור הפרמטרים הבאים:
      1. הישרדות התא: באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר, להשוות את מספר התאים הקיימים כל-טוב ולהשוות אותו לתאים מטופל היטב.
      2. ביטוי GFP: לספור את אחוז התאים שהם GFP חיוביים על המספר הכולל של תאים בכל טוב (איור 3B).
  4. ביטוי מופרז בטיפול פלמיד
    1. השהה מחדש את התאים במדיית תאי הגידול (אמצעי האחסון תלוי בגודל הגלולה) ומונה באופן ידני תאים חיים באמצעות טריפה כחול הדרה. צלחת 200,000 תאים לכל טוב של צלחת 6 היטב. כל טוב ישמש לאירוע. התמרה עצמאי כל טוב יהיה מקורה באמצעות הגדרת שפותחה עבור סוג הגידול הספציפי (איור 3A).
    2. 24 שעות לאחר החצייה, לשטוף כל באר עם 1x PBS ו מודתאת התאים בפתרון התנתקות התא חם (מספיק כדי לכסות את הבאר). מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c עבור 5 – 10 דקות, בהתאם לגורמים המפורטים בסעיף 2.15.
    3. כאשר תאים מנותקים, לספור את התאים הנגזרים מכל אחד היטב באופן עצמאי באמצעות טריפה כחול הדרה. מקום 100,000 תאים לכל טוב של 6 לוחית מצורף נמוכה היטב, ומוודאים לא לערבב תאים נגזר בארות שונות. מניחים את הצלחת בחממה ב 37 ° c ויוצאים ללא הפרעה במשך שבוע.
      הערה: משך התקופה הזאת הוא 7 ימים, זמן מספיק כדי לאפשר היווצרות של tumorsphere תוך מניעת היתוך tumorsphere. פיוז ' ן tumorsphere היא תופעה הופכת להיות ברור כאשר 100,000 או יותר תאים מצופים יחד בהשעיה במשך למעלה משבוע אחד, אשר יכול הטיה הערכה של היכולת היווצרות tumorsphere. במקרה שהניסוי דורש זמן דגירה ארוך יותר, צפיפות התא צריכה להיות מותאמת או פולימר מקפלים המשמשים כדי למנוע היתוך tumorsphere26.
    4. בסוף הניסוי, בצע את השלבים 3.5.2 ו 3.6 כדי לנתח את הנתונים.

6. הכנה של טומורספירה להשתלה אלושתל

  1. המקום החילוץ מטריצה (ECM) פתרון (50 μL לכל allograft) ותאים סרטניים מדיה (50 μL לכל allograft) על הקרח.
  2. ניתן להשתמש בטמורספירות עבור השתלה של אלושתלים. משוך יחד את כל הכדוריות המתקבלות מסוג תא מסוים או טיפול בצינור 15 מ"ל או 50 mL (בהתאם לנפח הכולל של המדיה) (איור 1D). לסובב את הכדורים למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT. הסר את הסופרנטנט מעל הספירות ולשטוף אותם עם 10 מ ל סטרילי 1 x PBS.
  3. לסובב את הספירות מחדש למטה ב 300 x g עבור 5 דקות ב-RT, ולאחר מכן לאכול את ה-PBS 1x, ולהוסיף 500 μl אל 1 מ ל של פתרון ניתוק התא על גבי הגלולה התא, אשר מתחיל את תהליך הדיסוציאציה. מכהים את הספירות בתמיסה העיכול לאמבט מים רועד ב-37 ° c ובודקים את התקדמות העיכול כל 10 דקות. על מנת לסייע בקבלת הדיסוציאציה לפתרון תא בודד, פיפטה את התאים למעלה ולמטה להפרעה מכנית. תהליך העיכול עשוי להימשך עד 30 דקות.
    הערה: למרות שזמן הדגירה משתנה באופן משמעותי כאשר הכדוריות נגזרות מתאי RMS שונים, ירידה משמעותית בכדאיות התאים ביחס לזמן העיכול מעולם לא נצפתה.
  4. כאשר פתרון תא בודד מתקבל, להוסיף נפח של תאים סרטניים מדיה (1:1, פתרון התנתקות התא: תאים סרטניים מדיה) ולסובב אותו ב 300 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
    הערה: מרגע זה והלאה, כל השלבים צריכים להתבצע על קרח. לאחר ספינינג, כדורים לא יוצרים גלולה יציבה כמו פתרונות התאים היחידים לעשות. כדי לוודא שלא להוציא או לבשל את הטוטליות, השתמש בפיפטה משנת mL ומפה בעדינות את הנוזל. מעבר לפיפטה ב200 μL כאשר נותרו רק 1 mL.
  5. להשעות את התאים בתאי הגידול הקר מדיה (אמצעי האחסון יהיה תלוי בגודל גלולה), למקם את התאים על קרח ולספור תאים חיים באמצעות טריפה כחול הדרה. לאחר קביעת כמות נאותה של תאים להשתמש עבור allograft, השהה אותם מחדש בנפח כולל של 50 μL של מדיה בתאי הגידול הקר. להתקרר טיפ של פיפטה. בתאי גידול קרים בתקשורת כאשר הטיפ קר, השתמש בו כדי לקחת 50 μL של פתרון ECM ולהוסיף אותו לצינור המכיל את התאים. אין להסיר את הצינורות מהקרח במהלך תהליך זה.
    הערה: מספר התאים שבהם יש להשתמש עבור ההשתלה צריך להיקבע על פי הגידול נבדק וניסיוני המטרה: מספר גדול יותר של תאים מושתלים תפחית את הזמן של פיתוח הגידול (20,000 תאים מתוך העכבר מווריספירות RMS הוכחו ל להתפתח לגידול 6 שבועות לאחר ההזרקה). כדי להיות מסוגל להשוות קווי תאים שונים או טיפולים שונים, חשוב להתחיל מאותו מספר תאים.
  6. כמו תאים עכשיו מוכנים להשתלה, לשמור על הקרח עד ההזרקה. מקום הכתיר 0.5 mL מזרק אינסולין עם מחט של 29 גרם על קרח, כדי למנוע את פתרון התא מלהיות מוצק על השאיפה.
  7. הפעל את ה-flowmeter ל-200 mL/min חמצן ו-isofלוריאן מאדה כדי 2.5%. באמצעות הצבת אותו בתוך חדר האינדוקציה. המתן 2 – 3 דקות עד שהעכבר מופיע ישן והרבייה האטה. לפני תחילת ההליך, לאשר תחילה דרך צביטה ברגל כי העכבר ישן, ולאחר מכן להחיל משחה וטרינר על העיניים. גלח את הצד הימני של בעל החיים, מחלק את תמיסת התאים במזרק הטרום-מקורר, והכנס אותם תת-עורי לאזור המגולח. בליטה גלויה מתחת לעור יהיה ליצור אם הזריקה מבוצעת כראוי.
    הערה: האלושתלים Cell ניתן לבצע באותו זן העכבר כמו זה של התאים המושתלים. לדוגמה, אם תאי RMS מבודדים במקור מעכבר C57BL/6, ניתן לבצע את ההשתלה בעכברים C57BL/6. אם המתח הוא שונה, אז עכברים לקויה הנמען צריך להיות מנוצל כדי למנוע דחייה. הגילאים של עכברי הנמען יכולים גם להיות מותאמים בהתאם למטרה הניסיונית.
  8. לעקוב אחר העכברים להיווצרות הגידול פעם בשבוע.
    הערה: כדי לאמת את הזהות של הגידול שנגזר השתלת השתלת, זה צריך להיות מושווה לגידול המקורי שממנו התאים היו מבודדים. למטרה זו, ניתוח היסטולוגית לתכונות מורפולוגיות וביטוי של סמנים מיוגניים, כמו גם RNAseq מקיף יותר ניתן לבצע.

תוצאות

כדורי טומורזה
בידוד התא היה אופטימיזציה כדי לקבל את הטרוגניות המרבי של אוכלוסיות תאים נוכח רקמת הגידול. ראשית, מאז רקמות מבודדות הציגו אזורים שונים מורפולוגית, כדי לשפר את הסיכויים לבודד אוכלוסיות תאים נדירים, הדגימה בוצעה מאזורים מרובים של הגידול (

Discussion

שיטות מרובות מועסקים לבידוד ואפיון של TPCs מן הגידול אוכלוסיות תאים הטרוגנית: הגידול clonogenic assays, בידוד FACS, ו-tumorsphere שיטת היווצרות. שיטת הגידול clonogenic תוארה לראשונה ב 1971, משמש ללימודי תאי גזע, ורק לאחר מכן להחיל על הביולוגיה סרטן29,30. שיטה זו מבוססת על תאי גזע סרטן ה...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו נתמכת על ידי מענק אליסון הקרן רפואי המענק AG-NS-0843-11, ואת מענק הפיילוט NIH בתוך מרכז הסרטן NCI תמיכה גרנט P30CA030199. ס. י.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase cell dissociation reagentGibcoA1110501Detach adherent cells and dissociate tumorspheres
CeligoNexcelomCeligoMicrowell plate based image cytometer for adherent and suspension cells
Collagenase, Type IILife Technologies17101015Tissue digestion enzyme
Dispase II, proteaseLife Technologies17105041Tissue digestion enzyme
DMEM high glucose mediaGibco11965092Component of tumor cells media
DMEM/F12 MediaGibco11320033Component of tumosphere media
EDTAThermoFisherS312500Component of FACS buffer
EGF recombinant mouse proteinGibcoPMG8041Component of tumosphere media
FACSAria II Flow CytometryBD Biosciences650033Fluorescent activated cell sorter
Fetal Bovine SerumOmega ScientificFB-11Component of tumor cells media
Fluriso (Isofluornae) anesthetic agentMWI Vet Supply502017Anesthetic reagent for animals
FxCycle Violet StainLife TechnologiesF10347Discriminate live and dead cells
Goat SerumLife Technologies16210072Component of FACS buffer
Ham's F10 MediaLife Technologies11550043Component of FACS buffer
Horse SerumLife Technologies16050114Component of cell isolation media
Lipofectamine 3000 transfection reagentThermoFisherL3000015Transfection Reagent
Matrigel membrane matrixCorningCB40234Provides support to trasplanted cells
N-2 Supplemtns (100X)Gibco17502048Component of tumosphere media
Neomycin-Polymyxin B Sulfates-Bacitracin Zinc Ophthalmic OintmentMWI Vet Supply701008Eyes ointment
PBSGibco10010023Component of FACS buffer and used for washing cells
pEGFP-C1Addgene6084-1GFP plasmid
Penicillin - StreptomyocinLife Technologies15140163Component of tumosphere and tumor cells media
Recombinant Human βFGF-basicPeprotech10018BComponent of tumosphere media
Recombinant mouse Flt-3 Ligand ProteinR&D Systems427-FL-005Recombinant protein
Trypan blueThermoFisher15250061Discriminate live and dead cells

References

  1. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  2. Wicha, M. S., Liu, S., Dontu, G. Cancer stem cells: an old idea--a paradigm shift. Cancer Research. 66 (4), 1883-1890 (2006).
  3. Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proceedings National Academy of Science of the United States of America. 100 (7), 3983-3988 (2003).
  4. Oishi, N., Yamashita, T., Kaneko, S. Molecular biology of liver cancer stem cells. Liver Cancer. 3 (2), 71-84 (2014).
  5. Crous, A. M., Abrahamse, H. Lung cancer stem cells and low-intensity laser irradiation: a potential future therapy. Stem Cell Research & Therapy. 4 (5), 129 (2013).
  6. Tomao, F., et al. Investigating molecular profiles of ovarian cancer: an update on cancer stem cells. Journal of Cancer. 5 (5), 301-310 (2014).
  7. Zhan, H. X., Xu, J. W., Wu, D., Zhang, T. P., Hu, S. Y. Pancreatic cancer stem cells: new insight into a stubborn disease. Cancer Letters. 357 (2), 429-437 (2015).
  8. Sharpe, B., Beresford, M., Bowen, R., Mitchard, J., Chalmers, A. D. Searching for prostate cancer stem cells: markers and methods. Stem Cell Reviews and Reports. 9 (5), 721-730 (2013).
  9. Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367 (6464), 645-648 (1994).
  10. Lee, C. -. H., Yu, C. -. C., Wang, B. -. Y., Chang, W. -. W. Tumorsphere as an effective in vitro platform for screening anti- cancer stem cell drugs. Oncotarget. 7 (2), 1215-1226 (2015).
  11. Sultan, I., Qaddoumi, I., Yaser, S., Rodriguez-Galindo, C., Ferrari, A. Comparing adult and pediatric rhabdomyosarcoma in the surveillance, epidemiology and end results program. Journal of Clinical Oncology. 27 (20), 3391-3397 (1973).
  12. Blum, J. M., et al. Distinct and overlapping sarcoma subtypes initiated from muscle stem and progenitor cells. Cell Reports. 5 (4), 933-940 (2013).
  13. Rubin, B. P., et al. Evidence for an unanticipated relationship between undifferentiated pleomorphic sarcoma and embryonal rhabdomyosarcoma. Cancer Cell. 19 (2), 177-191 (2011).
  14. Keller, C., et al. Alveolar rhabdomyosarcomas in conditional Pax3:Fkhr mice: cooperativity. of Ink4a/ARF and Trp53 loss of function. Genes & Development. 18 (21), 2614-2626 (2004).
  15. Tremblay, A. M., et al. The Hippo transducer YAP1 transforms activated satellite cells and is a potent effector of embryonal rhabdomyosarcoma formation. Cancer Cell. 26 (2), 273-287 (2014).
  16. Hatley, M. E., et al. A mouse model of rhabdomyosarcoma originating from the adipocyte lineage. Cancer Cell. 22 (4), 536-546 (2012).
  17. Drummond, C. J., et al. Hedgehog Pathway Drives Fusion-Negative Rhabdomyosarcoma Initiated From Non-myogenic Endothelial Progenitors. Cancer Cell. 33 (1), 108-124 (2018).
  18. Almazan-Moga, A., et al. Hedgehog Pathway Inhibition Hampers Sphere and Holoclone Formation in Rhabdomyosarcoma. Stem Cells International. , (2017).
  19. Walter, D., et al. CD133 positive embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population is enriched in rhabdospheres. PLoS One. 6 (5), (2011).
  20. Ciccarelli, C., et al. Key role of MEK/ERK pathway in sustaining tumorigenicity and in vitro radioresistance of embryonal rhabdomyosarcoma stem-like cell population. Molecular Cancer. 15, (2016).
  21. Deel, M. D., et al. The Transcriptional Coactivator TAZ Is a Potent Mediator of Alveolar Rhabdomyosarcoma Tumorigenesis. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2616-2630 (2018).
  22. Boscolo Sesillo, F., Fox, D., Sacco, A. Muscle Stem Cells Give Rise to Rhabdomyosarcomas in a Severe Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy. Cell Reports. 26 (3), 689-701 (2019).
  23. Chamberlain, J. S., Metzger, J., Reyes, M., Townsend, D., Faulkner, J. A. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. The FASEB Journal. 21 (9), 2195-2204 (2007).
  24. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. SLAS Technology. 22 (4), 454-465 (2017).
  25. Johnson, S., Chen, H., Lo, P. K. In vitro Tumorsphere Formation Assays. Bio-Protocol. 3 (3), (2013).
  26. Zhu, Z. W., et al. A novel three-dimensional tumorsphere culture system for the efficient and low-cost enrichment of cancer stem cells with natural polymers. Experimental and Therapeutic. 15 (1), 85-92 (2018).
  27. Takahashi, S. Downstream molecular pathways of FLT3 in the pathogenesis of acute myeloid leukemia: biology and therapeutic implications. Jornal of Hematology and Oncology. 4, (2011).
  28. Laouar, Y., Welte, T., Fu, X. Y., Flavell, R. A. STAT3 is required for Flt3L-dependent dendritic cell differentiation. Immunity. 19 (6), 903-912 (2003).
  29. Ogawa, M., Bergsagel, D. E., McCulloch, E. A. Differential effects of melphalan on mouse myeloma (adj. PC-5) and hemopoietic stem cells. Cancer Research. 31 (12), 2116-2119 (1971).
  30. Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197 (4302), 461-463 (1977).
  31. Hamburger, A. W. The human tumor clonogenic assay as a model system in cell biology. The International Journal of Cell Cloning. 5 (2), 89-107 (1987).
  32. Jimenez-Hernandez, L. E., et al. NRP1-positive lung cancer cells possess tumor-initiating properties. Oncology Reports. 39 (1), 349-357 (2018).
  33. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  34. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
  35. Salerno, M., et al. Sphere-forming cell subsets with cancer stem cell properties in human musculoskeletal sarcomas. International Journal of Oncology. 43 (1), 95-102 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved