الكشف عن مجموعه Hemolymph والتلقيح من المسام البدائية ميتارهيميوم في القراد Microplus Rhipicppus نحو دراسات علم الامراض لافقاريات

Summary

تحليل القراد الهيموليمف يمثل مصدرا هاما للمعلومات حول كيفيه بعض مسببات الامراض تسبب المرض وكيف القراد الاستجابة المناعية لهذه العدوى. توضح الدراسة الحالية كيفيه تطعيم المروج الفطرية وجمع الأورام اللمفية من الإناث المجهرية الصغيرة.

Abstract

القراد هي إلزام همتوفغوس طفيليات و rhipicephalus ميكروبلاس له اهميه كبيره في الطب البيطري لأنه يسبب فقر الدم ، وفقدان الوزن ، وانخفاض قيمه الجلد الحيوانية وأيضا يمكن ان تكون بمثابه ناقل للعديد من مسببات الامراض. بسبب التكاليف الباهظة للسيطرة علي هذه الطفيليات ، والاضرار التي لحقت البيئة الناجمة عن الاستخدام غير المناسب لمبيدات آلافات الكيميائية ، وزيادة المقاومة ضد الطفيليات التقليدية ، والسيطرة البديلة من القراد ، من خلال استخدام الفطريات الحشرية ، علي سبيل المثال ، وقد اعتبر نهجا مثيرا للاهتمام. ومع ذلك ، أظهرت دراسات قليله كيف يعمل جهاز المناعة في القراد لمحاربه هذه المركبات الحشرية. ولذلك ، يوضح هذا البروتوكول طريقتين المستخدمة لتلقيح الحشرات في الإناث محتقن واثنين من التقنيات المستخدمة لجمع الهيموليمف وحصاد الخلايا الدموية. التلقيح من مسببات الامراض في الادراج الساق في الجسم الإناث القراد يسمح تقييم المعلمات البيولوجية الإناث علي عكس التلقيح بين الشجار والاستسلام ، والتي كثيرا ما تضر الجهاز Gené's. وقد أسفرت مجموعه الأورام اللمفية الظهرية عن انتعاش أكبر في الحجم من الجمع عبر الساقين. وتشمل بعض القيود من جمع الهيموليمف القراد ومعالجه ط) معدلات عاليه من اضطراب الخلايا الدموية ' ، 2) التلوث النصفي مع الأمعاء المعطلة ، والثالث) انخفاض الانتعاش حجم الهيميميمف. عندما يتم جمع الهيموليمف من خلال قطع الساق ، يستغرق الوقت المستغرق في التراكم في الساق ، ويفضل عمليه التخثر. بالاضافه إلى ذلك ، يتم الحصول علي عدد اقل من الخلايا الدموية في المجموعة من خلال الساق مقارنه بالمجموعة الظهرية ، علي الرغم من ان الطريقة الاولي تعتبر أسهل في الأداء. فهم الاستجابة المناعية في القراد بوساطة وكلاء الحشرات يساعد علي كشف النقاب عن المرض وتطوير أهداف جديده للسيطرة علي القراد. عمليات التلقيح الموصوفة هنا تتطلب موارد تكنولوجية منخفضه جدا ويمكن استخدامها ليس فقط لفضح القراد إلى الكائنات المجهرية المسببة للامراض. المثل ، فان مجموعه من القراد الهيموليمف تمثل الخطوة الاولي للعديد من الدراسات الفسيولوجية.

Introduction

القراد الماشية ، rhipicpasus ميكروبلاس، هو المري ectoparite مع تاثير سلبي هائل علي الماشية في المناطق الاستوائية. هذا القراد هو المتجه من العوامل المسببة للامراض مثل babesia بوفيس]، babesia bigemina، والهامشية انبلازما انه ، بالاضافه إلى الضرر المباشر الأرقاء ، يمكن ان تقلل من إنتاج الحليب واللحوم ، وتسبب فقر الدم والموت في نهاية المطاف. وقدرت الخسائر الناجمة عن هذا الطفيليات في 3,240,000,000 دولار سنويا في البرازيل¹. ويطلب اتباع أساليب مستدامه ويعتبر استخدام عوامل الحشرات الحشرية بديلا واعدا للحد من استخدام مبيدات الجراثيم الكيميائية^2،3،4.

الفطريات الحشرية ، مثل Metarhizium spp. ، هي أعداء طبيعيه من المفصليات بما في ذلك القراد ، وبعض العزلات يمكن استخدامها كمتحكمات حيوية. هذه الممرضات تصيب بنشاط المضيف من خلال اهاب واستعمار الجسم^2,5,6. ومع تطور العدوى ، يتم التوسط في الاستجابات الخلوية والخلطيه من خلال نظام المناعة القراد. تم الإبلاغ عن تحليل القراد الهيموليمف كاداه مفيده لتقييم الاستجابات المناعية بعد التحدي مع مسببات الامراض^7,8.

وتنقسم استجابه المفصليات المناعية إلى استجابات الخلطيه والخلوية. وتنطوي الاستجابة الحميدة علي عمليات التراص الدموي وإنتاج البروتينات/الببتيدات المضادة للميكروبات ، في حين يتم تنفيذ الاستجابة المناعية الخلوية من خلال الخلايا الدموية. هذه الخلايا موجودة في الجسم اللمفي من جميع المفصليات ويقال لتطوير دور تعبيري في الدراسات التي تنطوي علي الاستجابة المناعية الفطرية⁹، كما انه يرتبط مباشره إلى كثرة الكريات وعمليات التغليف. وفقا لذلك ، يمكن ان تساعد الدراسات حول الخلايا الدموية في التحقيق في مسار الموت وفهم العمليات مثل الفحص الألى ، المبرمج ، والنخر. في بعض لافقاريات كصمامات ، تواجه مجموعه الخلايا الدموية قيودا مثل انقطاع الخلايا ، وانخفاض حجم الخلايا الدموية التي تم الحصول عليها ، وتركيز منخفض للخلايا المستردة¹⁰. في كثير من الأحيان ، اعتمادا علي المنهجية المطبقة ، يتم الحصول علي انخفاض تركيز الخلايا ، مما يؤثر مباشره علي القياس الكمي للخلايا وتحليلها.

عدد الخلايا الدموية المتداولة في الهيموسيفي هو متغير بين المفصليات المختلفة ، ويمكن ان تتغير في نفس النوع بسبب مراحل فسيولوجية مختلفه مثل الجنس ، والعمر ، والمرحلة التنموية المفصلية¹¹. يمكن أيضا العثور علي الخلايا الدموية الانضمام إلى بعض الأعضاء ويتم الإفراج عنهم في الدورة الدموية فقط بعد عمليه العدوى¹¹. ومع ذلك ، أبلغت معظم الدراسات عن استخدام الحشرات ، في حين لا تزال القراد اقل استكشافا فيما يتعلق بفسيولوجيتها وعلم الامراض. علي الرغم من التلقيح الممرض وجمع الهيموليمف في القراد هي تقنيات اقل استخداما ، وإنشاء أساليب قياسيه تساعد علي تطوير دراسات أكثر دقه.

وكان الهدف من هذه الدراسة للمقارنة بين الطرق الأكثر استخداما لجمع البوليمرات الدموية والتلقيح من مسببات الامراض في R. ميكروبلاس القراد ، وتقييم الفعالية في اكتساب الخلايا الدموية وتركيز الكريات الدموية.

Protocol

تم الحصول علي القراد المستخدمة في هذه الدراسة من مستعمره اصطناعية ، الستائر في الجامعة الريفية الاتحادية في ريو دي جانيرو ، والتي تمت الموافقة علي الأساليب من قبل لجنه الأخلاق لاستخدام الفقاري الحيوانية (خه/UFRRJ #037/2014).

1. القراد محتقن الإناث

1. بعد جمع القراد ، وغسل محتقن الإناث باستخدام مياه الصنبور وتزج بهم في 0.5 ٪ (v/v) محلول الصوديوم هيبوكلويد لمده 3 دقائق في المتلقي كوب الزجاج 500 mL ، لنظافة بشره (الشكل 1) ، ثم تجف جميع الإناث باستخدام المناشف الورقية العقيمة (الشكل 2).
2. تقسيم الإناث في مجموعات المرجح متجانسة (مع 20 الإناث لكل منهما): مجموعه واحده دون اي علاج ، واحده مجموعه التحكم تطعيم مع 5 μl من 0.1 ٪ بولي اوكسي اتيلين سوربيتان محلول مائي أحاديه الشكل (v/v) ، واحد المصابين-مجموعه تطعيم مع 5 μl في 1.0 x 10 ^{7 المسام البدائية mL-1}.
   ملاحظه: تم استخدام القراد غير المعالجة فقط لوحده التخزين وتركيز الخلايا الدموية. تم تنفيذ ثلاثه نسخ متماثلة من كل مجموعه.

2-مسببات الامراض التلقيح بين الشجار والاستسلام

ملاحظه: في هذه الدراسة ، استخدمت التعليقات الفطرية الحشرية كمثال.

1. التوقف المرحلي الفطرية المسام في 1 مل من 0.1 ٪ بولي اوكسي اتيلين سوربيتان محلول مائي أحاديه الشكل (v/v) والتكيف مع التركيز النهائي من 1.0 x 10⁷ المسام البدائية mL^-1. أضافه إلى الانسداد من 5 μL ميتارهيميوم المسام (الشكل3) تعليق علي سطح فيلم البارافين البلاستيك.
   ملاحظه: تم تعديل نظام التعليق البدائي المسام Metarhizium باستخدام غرفه نيوبوير. لتسريع عمليه التلقيح ، يمكن أضافه فقاعات متعددة إلى سطح الفيلم البارافين البلاستيك ، كل فقاعه المقابلة ل 5 μL.
2. استخدم حقنه انسولين فائقه الغرامة 1 مل وابره 0.3 مم لسحب التعليق وتطعيمه في القراد. تذكر ان تاخذ كل الهواء من الحقنه قبل استخدامه.
3. تطعيم 5 μL من تعليق الفطرية في القراد الإناث بين الشجار والاستسلام. تطعيم الإناث من مجموعه التحكم مع 5 μl من 0.1 ٪ بولي اوكسي اتيلين سوربيتان محلول مائي مونووليمات (v/v) مع عدم وجود الفطريات.
   ملاحظه: قد يكون هناك حجم صغير من الهيولوليمف موجود علي الورم بعد إدخال الابره. كن حذرا لعدم تطعيم الهواء.

3. تلقيح الفطريات الحشرية بين الفخذ الساق والجسم القراد الإناث

1. تطعيم الإناث مع تعليق الفطرية (5 μL في 1.0 x 10⁷ المسام البدائية mL^-1) بين tigh الساق وجسم الأنثى ، وذلك باستخدام 1 مل فائقه الدقة حقنه الانسولين إلى جانب ابره 0.3 mm. تطعيم الإناث من مجموعه التحكم مع 5 μl من 0.1 ٪ بولي اوكسي اتيلين سوربيتان محلول مائي مونوولياتي (v/v).
   ملاحظه: عندما يتم اجراء التلقيح البدائية ميتارهينيوم بين tigh الساق والجسم الإناث القراد ، وحجم صغير من الهيموليمف يمكن ان تكون موجودة علي tigh بعد إدخال ابره. كن حذرا لعدم تطعيم الهواء.

4. جمع الهيولوليمف الظهري

1. استخدم الجزء المطاطي من مجموعه التسريب المجنحة ، وأنبوب شعري 0.3 ملم ، وطرف مصفي لأداء مجموعه الهيمولياس.
2. تعطيل جلد الظهرية الإناث باستخدام ابره 0.3 mm.
3. بعد التعطيل ، ضع ضغطا لطيفا علي الجزء الامامي من جسم القراد. مراقبه سائل شفاف تقريبا سحب من موقع التعطيل. جمع الهيموليمف عن طريق مص السائل من خلال غيض مرشح إلى جانب المطاط جزء من مجموعه ضخ المجنح ، وأنبوب الشعرية 0.3 مم.
   ملاحظه: لا تضغط علي جسم القراد بالبالكاد اثناء التجميد لان هذا قد يعطل الأمعاء الوسطي ويلوث الهيميدوليف. الانتظار حتى ضغط لطيف يمكن ان يطرد السائل دون تلوث.

5. جمع hemolymph من الساق القراد

1. وضع القراد ، قطع قطعه من الساق الاماميه مع زوج من المقص.
   ملاحظه: يمكن قطع ساق واحده أو أكثر ، وكذلك ، يمكن قطع نفس الساق أكثر من مره واحده.
2. تطبيق ضغط لطيف علي جزء الجسم الخلفي القراد. مراقبه فقاعه سائله شفافة التي تظهر علي موقع قطع وجمعها مع أنبوب الشعرية ، كما هو موضح في الخطوة 4.3.
   ملاحظه: لا تضغط علي جسم القراد بالبالكاد اثناء التجميد لان هذا قد يعطل الأمعاء الوسطي ويلوث الهيميدوليف. الانتظار حتى ضغط لطيف يمكن ان يطرد السائل دون تلوث.

6. معالجه الهيوليمف

1. بعد جمع الهيموليمف ، إيداعه في الأنابيب المجهرية 1.5 mL معباه سابقا مع 30 μl البروتيني كوكتيل و 82 μl العازلة المالحة. الحفاظ علي الأنابيب المجهرية علي الجليد في جميع انحاء جمع الهيموليمف.
2. عينات الطرد المركزي (500 x g لمده 3 دقائق في 4 °c). سيتم تشكيل بيليه لينه من الخلايا الدموية بعد طرد الدموية.
   ملاحظه: بالنسبة للقياس الكمي للاوليمب النصفي ، يمكن قياس حجم الهيميميميه التي تم الحصول عليها من خلال احتساب الحجم الكلي داخل الأنبوب المجهري وخصم حجم كوكتيل الانزيم البروتيني والعازل الملحي.
3. بعناية أزاله سوبرناتانت (الخلايا الخالية من الهيسومف). برفق أعاده تعليق الخلايا في ، علي سبيل المثال ، الثقافة L-15 Leibovitz تعديلها لدرجه الحموضة 7.0-7.2. قياس الخلايا الدموية عن طريق وضع 10 μL من الخلايا الدموية المعاد تعليقها في غرفه نيوبوير.

7. اعداد شرائح الكريات الدموية

1. قطع الساق الاماميه القراد مع زوج من المقص.
2. تطبيق ضغط لطيف علي جزء الجسم الخلفي القراد. لاحظ فقاعه سائله شفافة تظهر علي موقع القطع.
3. تطبيق قطرات الهيموليمف مباشره علي الشرائح المجهر نظيفه ، وبعد ذلك ، استخدم الأساليب المعتمدة لوصمه عار الخلايا.
   1. لتلطيخ الخلايا الدموية باستخدام giemsa ، والهواء والجافة الهيموليمف علي الشريحة لمده 30 دقيقه ، وإصلاحه في درجه حرارة الغرفة مع الميثانول لمده 3 دقائق ، ووصمه عار في محلول giemsa (1:9 نسبه الحل العازلة سورينسن ، pH 7.2) لمده 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. غسل الشرائح مع المياه الجارية لأزاله الزائدة من صبغه ، الهواء الجاف الشريحة وتقييم الخلايا في 400x في المجهر البصري.

النتائج

تقترب هذه المقالة من التلقيح وطرق جمع الهيموليمف المطبقة علي القراد. بعد التلقيح بين الفخذ الساق والجسم القراد الإناث ، وبعض السوائل (hemolymph) يمكن ان يفرز اثناء العملية. مهما, هو مهمة ان يلاحظ ان عندما التلقيح يكون أنهيت, ما من سائل أو انسجه كان حاضره في الابره راس أو في التل...

Discussion

التلقيح من مسببات الامراض مفيد عندما تهدف الدراسة إلى التحقيق في العمل المجري من الكائنات المجهرية في نماذج المفصليات التجريبية لأنه يؤكد ان الممرض هو داخل المضيف. ويمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لتطعيم جزيئات مثل تداخل RNA (RNAi). اعتبرت تلقيح بين ال [سكوتثم] واستسلام يكون يسهل ان ينجز غير ان غا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662