Hemolymph toplama ve Metarhizyum blastosporların omurgasız patoloji çalışmalarına doğru Rhipicephalus Microplus ticks içine inoculation

Özet

Kene hemolymph analizi, bazı patojenlerin hastalığa neden olduğu ve keneler immünolojik olarak bu enfeksiyona nasıl yanıt vereceği konusunda önemli bir bilgi kaynağını temsil eder. Bu çalışmada, mantar propagülleri aşılamak ve Rhipicephalus Microplus tıkanmış kadınlarda hemolymph toplamak gösterilmiştir.

Özet

Keneler, hematofajöz Ektoparazitleri ve Rhipicephalus mikroplus , anemi, kilo kaybı, hayvanların deri amortismanı ve aynı zamanda çeşitli patojenlerin bir vektör olarak hareket edebilir çünkü veteriner tıbbında büyük önem taşımaktadır. Bu parazitler kontrol etmek için fahis maliyetleri nedeniyle, kimyasal akaritelerin uygunsuz kullanımı nedeniyle çevreye zarar, ve geleneksel parazit karşı artan direnç, keneler alternatif kontrol, kullanımı ile Örneğin entomopatogenik mantar, ilginç bir yaklaşım olarak kabul edilmiştir. Yine de, birkaç çalışmada Tick bağışıklık sistemi bu entomopathogens mücadele nasıl davranır göstermiştir. Bu nedenle, bu protokol Entomopatojen aşı için kullanılan iki yöntem gösterilmiştir dişi ve iki teknikleri hemolymph toplama ve hemanosit hasat için kullanılır. Kene dişi vücudunda bacak eklemesinde patojenlerin aşı dişi biyolojik parametrelerin değerlendirilmesine izin verir, skutum ve başkentin arasındaki aşı, hangi sıklıkla Gené organı zarar. Dorsal hemolymph koleksiyonu bacaklardan koleksiyonundan daha yüksek hacimli iyileşme sağladı. Kene hemolymph toplama ve işleme bazı sınırlamalar dahil i) yüksek oranları hemanosit ' bozulma, ii) bozmuş midgut ile hemolymph kontaminasyonu, ve iii) düşük hemolymph ses kurtarma. Hemolymph bacak kesme yoluyla toplandığında, hemolymph bacak açılışında birikmesi için zaman alır, pıhtılaşma sürecini tercih. Buna ek olarak, ilk yöntemin gerçekleştirilmesi daha kolay kabul edilse bile, dorsal koleksiyona kıyasla bacak aracılığıyla koleksiyonda daha az hemanosit elde edilir. Entomopatogenik ajanlar tarafından aracılık edilen kenlerde bağışıklık tepkisini anlamak, patogenezini ortaya çıkarmak ve kene kontrolü için yeni hedefler geliştirmek için yardımcı olur. Burada açıklanan aşı süreçleri çok düşük teknolojik kaynaklar gerektirir ve sadece keneler patojen mikroorganizmalara maruz bırakmak için kullanılabilir. Benzer şekilde, kene hemolymph koleksiyonu birçok fizyolojik çalışmalar için ilk adımı gösterebilir.

Giriş

Sığır kene, Rhipicephalus Microplus, tropikal alanlarda Hayvancılık üzerinde büyük bir olumsuz etkisi olan bir hematofagus antiparazitik olduğunu. Bu kene, Babesia Bovis, Babesia bigeminave anaplasma obtus gibi patojenik ajanların vektörü olup, doğrudan hemofeeding hasar ile birlikte, süt ve et üretimini azaltabilir, anemi ve sonuçta ölüm neden olabilir. Bu ektoparasitin neden olduğu kayıplar Brezilya 'da yıllık 3.240.000.000 dolar olarak tahmin edildi¹. Sürdürülebilir Yöntemler talep edilir ve entomopatogenik ajanların kullanımı, kimyasal akarisitlerin kullanımını azaltmak için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir^2,3,4.

Metarhizyum spp. gibi entomopati ojenik mantarlar, keneler de dahil olmak üzere eklemropodların doğal düşmanlarıdır ve bazı izolatlar biyodenetleyici olarak kullanılabilir. Bu patojenler aktif olarak manikür yoluyla ev sahibi enfekte ve vücudunu kolonize^2,5,6. Enfeksiyon geliştikçe, hücresel ve humoral tepkiler kene bağışıklık sistemi tarafından aracılık edilir. Kene hemolymph Analizi patojenler ile zorlu sonra bağışıklık yanıtlarını değerlendirmek için yararlı bir araç olarak bildirilen^7,8.

Arthropods ' bağışıklık tepkisi humoral ve hücresel tepkiler ayrılmıştır. Humoral yanıt hemaglütinasyon süreçleri ve antimikrobiyal proteinler/peptidler üretimi içerir, hücresel bağışıklık yanıtı hemanositler aracılığıyla gerçekleştirilir ise. Bu hücreler tüm eklemropodlar hemolymph mevcut ve doğal bağışıklık tepkisi içeren çalışmalarda ifade rol geliştirmek için bildirilen⁹, doğrudan fagositoz ve kapsülleme süreçleri ile ilgili olduğu gibi. Buna göre, hemanositler hakkında çalışmalar ölüm yolunun araştırılması ve otophagy, apoptozis ve nekroz gibi süreçleri anlamanıza yardımcı olabilir. Bazı omurgasızlar olarak biyvalfler, hemanosit koleksiyonu hücre bozulması gibi sınırlamalar, düşük hemolymph hacmi elde, ve düşük konsantrasyon kurtarılmış hücreler¹⁰. Çok sık, uygulanan metodolojiye bağlı olarak, hücrelerin miktarlama ve analizini doğrudan etkileyen, azaltılmış hücre konsantrasyonu elde edilir.

Hemolymph içinde dolaşan hemanosit sayısı farklı eklemropodlar arasında değişkendir ve seks, yaş ve Artropod 'un gelişimsel aşaması¹¹gibi farklı fizyolojik aşamalar nedeniyle aynı türde değişebilir. Hemanositler de bazı organlara yapışmış bulunabilir ve enfeksiyon işleminden hemen sonra dolaşım içine salınabilir¹¹. Yine de, çoğu çalışmada böcek kullanımı bildirilmiştir, keneler ise fizyolojisi ve patolojileri ile ilgili daha az incelenmiştir. Patojen inokülasyon ve hemolymph koleksiyonuna rağmen keneler daha az kullanılan tekniklerdir, standart yöntemler kurulması daha doğru çalışmaların gelişmesine yardımcı olur.

Bu çalışmanın amacı, hemolymph toplama ve patojenlerin inokülasyon için en çok kullanılan metotlarını R. Microplus Ticks olarak karşılaştırmaya, hematositlerin elde edilmesi ve hemanosit konsantrasyonunda etkinliğini değerlendirmek idi.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan keneler, bir yapay koloniden elde edildi, Rio de Janeiro Federal kırsal Üniversitesi 'nde bulunan, hangi yöntemleri omurgalı hayvanların kullanımı için Etik Komitesi tarafından onaylandı (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).

1. tik dişiler

1. Kene toplama sonra, musluk suyu kullanarak kaynadı kadın yıkayın ve 0,5% (v/v) sodyum hipoklorit solüsyonu 3 dakika için bir 500 ml cam kabı alıcı, manikür hijyeni (Şekil 1), sonra kurutun tüm kadın steril kağıt havlu kullanarak (Şekil 2).
2. Kadın homojen ağırlıklı gruplarda bölmek (her biri 20 kadın): herhangi bir tedavi olmadan bir grup, bir kontrol grubu 5 μL 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu çözeltisi (v/v) ile aşı ve bir enfekte-Grup 1,0 x 10 de 5 μL ile aşı ⁷ blastospores ml^-1.
   Not: hacim ve hemocayt konsantrasyonu için sadece tedavi edilmemiş keneler kullanılmıştır. Her grubun üç çoğaltır gerçekleştirildi.

2. skutum ve başkentler arasında patojenlerin inokülasyon

Not: Bu çalışmada örnek olarak entomopatogenik mantar süspansiyonlar kullanılmıştır.

1. 1 ml 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu çözeltisi (v/v) içinde mantar blastospores askıya ve 1,0 x 10⁷ blastospores ml^-1son konsantrasyonuna ayarlayın. Plastik parafin film yüzeyine 5 μL metarhizium blastospores (Şekil 3) süspansiyon bir kısım ekleyin.
   Not: Metarhizium blastospores süspansiyonu, Neubauer odası kullanılarak ayarlandı. Aşı sürecini hızlandırmak için, plastik parafin film yüzeyine birden fazla kabarcıklar eklenebilir, her kabarcık 5 μL 'ye karşılık gelen.
2. 1 ml Ultra-ince insülin şırınga ve 0,3 mm iğne süspansiyon çekmek ve kene içine aşılamak kullanın. Kullanmadan önce şırıngadan tüm havayı almak unutmayın.
3. Scutum ve başaç arasındaki kene dişi içine 5 μL mantar süspansiyonu inoculate. 0,1% 5 μL ile kontrol grubundan inoculate kadın polioksietilen Sorbitan monooleat sulu solüsyon (v/v) hiçbir mantar ile.
   Not: iğne eklendikten sonra foramen üzerinde küçük bir hemolymph hacmi mevcut olabilir. Hava aşılamak değil dikkatli olun.

3. bacak uyluk ve kene dişi vücudu arasında entomopatogenik mantar inoculation

1. Mantar süspansiyon ile inoculate kadın (5 μL at 1,0 x 10⁷ blastospores ml^-1) bacak Tigh ve dişi vücudu arasında, bir 1 ml Ultra-ince insülin şırınga kullanarak bir 0,3 mm iğne ile birleştiğinde. Kontrol grubundan 5 μL 0,1% polioksietilen Sorbitan monooleat sulu solüsyon (v/v) ile inoculate kadın.
   Not: ne zaman metarhizium blastospores aşı bacak Tigh ve kene dişi vücudu arasında gerçekleştirilir, hemolymph küçük bir hacim iğne ekleme sonra Tigh üzerinde mevcut olabilir. Hava aşılamak değil dikkatli olun.

4. dorsal hemolymph koleksiyonu

1. Kanat infüzyon kümesinin kauçuk parçasını, 0,3 mm kapiller tüpünü ve hemolymph koleksiyonunu gerçekleştirmek için süzülmüş bir ucu kullanın.
2. 0,3 mm iğne kullanarak dişi dorsal manikür bozar.
3. Kesintinden sonra, kene gövdesinin ön kısmına nazik basınç uygulayın. Bozulma yerinin dışına çekerek neredeyse şeffaf bir sıvıya uyun. Bir kanatlı infüzyon seti kauçuk parçasına bağlı filtre ucu ile sıvı emme ve 0,3 mm kapiller tüp hemolymph toplayın.
   Not: Bu midgut bozabilir ve hemolymph kontamine olabilir çünkü onun immobilizasyon sırasında neredeyse kene vücut basın etmeyin. Nazik basınç kirliliğe gerek kalmadan sıvıyı dışarı atıncaya kadar bekleyin.

5. kene bacak hemolymph koleksiyonu

1. Kene immobilize, bir makas bir çift ön bacak bir parça kesti.
   Not: bir veya daha fazla bacak kesilebilir, yanı sıra, aynı bacak birden fazla kez kesilebilir.
2. Tick 'in posterior vücut parçasına nazik basınç uygulayın. 4,3 adımda açıklandığı gibi, kesim yerinde görünen ve kapiller tüpü ile toplamak şeffaf bir sıvı kabarcık gözlemlemek.
   Not: Bu midgut bozabilir ve hemolymph kontamine olabilir çünkü onun immobilizasyon sırasında neredeyse kene vücut basın etmeyin. Nazik basınç kirliliğe gerek kalmadan sıvıyı dışarı atıncaya kadar bekleyin.

6. hemolymph işleme

1. Hemolymph koleksiyonundan sonra, daha önce 30 μL proteaz kokteyl ve 82 μL tuz tamponu ile dolu 1,5 ml mikrotüpler içinde yatırın. Mikrotüpler hemolymph koleksiyonu boyunca buz üzerinde tutun.
2. Santrifüjü örnekleri (500 x g 4 °c ' de 3 dakika). Hemolymph Santrifüjden sonra yumuşak bir hemanosit Pelet oluşturulacaktır.
   Not: hemolymph ölçme Için, mikrotüp içinde toplam hacmi sayma ve proteaz kokteyl ve tuzlu tampon hacminin sayılarak elde edilen hemolymph hacmi ölçmek.
3. Dikkatle süpernatant kaldırmak (hücre-ücretsiz hemolymph). Örneğin, Leibovitz 'in L-15 kültürü pH 7.0-7.2 olarak ayarlanmış olan hücreleri yavaşça pelletini. Neubauer odasına 10 μL resuspended hemocayt koyarak hemanositleri ölçün.

7. hemocayt örnekleme slayt hazırlama

1. Bir çift makas ile kene ön bacak kes.
2. Tick 'in posterior vücut parçasına nazik basınç uygulayın. Kesim bölgesinde görünen şeffaf bir sıvı balonu izleyin.
3. Uygulamak hemolymph doğrudan temiz mikroskop slaytlar üzerine düşer, bundan sonra, hücreleri leke için tahsis yöntemleri kullanın.
   1. Giemsa kullanarak hemanosit leke için, 30 dakika boyunca slayt üzerinde hemolymph hava kuru, 3 dakika için metanol ile Oda sıcaklığında düzelt, ve Giemsa çözeltisi leke (1:9 Sorensen tampon çözeltisi oranı, pH 7,2) Oda sıcaklığında 30 dakika. Boya fazlalığını çıkarmak, slaydı hava kurutmak ve hücreleri optik mikroskop içinde 400x olarak değerlendirmek için akan suyla kaydırmaları yıkayın.

Sonuçlar

Bu makalede kenelere uygulanan aşı ve hemolymph toplama yöntemleri yaklaşmaktadır. Bacak uyluk ve kene dişi vücudu arasındaki aşı sonra, bazı sıvı (hemolymph) süreci sırasında salgılanan olabilir; Ancak, aşı bittiğinde, iğne ucunda veya aşı bölgesinde sıvı veya doku bulunmadığını, mantar süspansiyonun tamamen inoculated olduğundan emin olmak önemlidir. Aşı işlemi doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, iğne ekleme kene kadınların ölümü neden olm...

Tartışmalar

Patojenlerin inoculation çalışması, çalışmada deneysel Artropod modellerinde mikroorganizmaların in vivo eylemini araştırmayı amaçladığından, çünkü patojenin ev sahibinin içinde olduğunu garanti eder. Bu teknik Ayrıca RNA parazitleri (RNAi) gibi aşılamak moleküllere de uygulanabilir. Scutum ve başkentlik arasında inoculation gerçekleştirmek için daha kolay kabul edilir ama sık zarar Gené organı, yumurtalarını zayıflatır^12,13. G...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662