Divulgando a coleta de Hemolinfas e a inoculação de blastósporos de Metarhizium em carrapatos de Rhipicephalus MICROPLUS para estudos de patologia de invertebrados

Resumo

A análise da hemolinfa de carrapato representa uma importante fonte de informações sobre como alguns patógenos causam doenças e como os carrapatos respondem imunologicamente a essa infecção. O presente estudo demonstra como inocular propágulos fúngicos e coletar hemolinfas de fêmeas de Rhipicephalus MICROPLUS ingurgizadas.

Resumo

Carrapatos são obrigatórios ectoparasitas hematófagos e Rhipicephalus MICROPLUS tem grande importância na medicina veterinária porque causa anemia, perda de peso, depreciação do couro dos animais e também pode atuar como um vetor de vários patógenos. Devido aos custos exorbitantes para controlar esses parasitas, danos ao meio ambiente causados pelo uso inadequado de acaricidas químicos, e o aumento da resistência contra parasiticidas tradicionais, controle alternativo de carrapatos, pelo uso de os fungos entomopatogénicos, por exemplo, foram considerados uma aproximação interessante. No entanto, poucos estudos demonstraram como o sistema imunológico do carrapato atua para combater esses entomopatógenos. Portanto, este protocolo demonstra dois métodos utilizados para a inoculação de entomopatógenos em fêmeas ingurgedadas e duas técnicas utilizadas para coleta de hemolinfas e hemócitos. A inoculação de patógenos na inserção da perna no corpo da fêmea do carrapato permite a avaliação de parâmetros biológicos femininos diferentemente da inoculação entre o Scutum e o capitulo, que freqüentemente danifica o órgão de Gené. A coleção dorsal do hemolinfa rendeu uma recuperação mais elevada do volume do que a coleção através das pernas. Algumas limitações da coleta e processamento de hemolinfas de carrapato incluem i) altas taxas de ruptura de hemócitos, II) contaminação da hemolinfa com intestino médio interrompido e III) baixa recuperação do volume da hemolinfa. Quando a hemolinfa é coletada através do corte da perna, a hemolinfa leva tempo para se acumular na abertura da perna, favorecendo o processo de coagulação. Além disso, menos hemócitos são obtidos na coleta através da perna em comparação com a coleta dorsal, embora o primeiro método seja considerado mais fácil de ser realizado. Compreender a resposta imune em carrapatos mediados por agentes entomopatogênicos ajuda a revelar sua patogênese e desenvolver novos alvos para o controle do carrapato. Os processos de inoculação aqui descritos requerem recursos tecnológicos muito baixos e podem ser utilizados não apenas para expor carrapatos a microrganismos patogênicos. Da mesma forma, a coleta de hemolinfa de carrapato pode representar o primeiro passo para muitos estudos fisiológicos.

Introdução

O carrapato de bovinos, Rhipicephalus MICROPLUS, é um ectoparasita hematófago com um enorme impacto negativo sobre o gado em áreas tropicais. Este carrapato é o vetor de agentes patogénicos, como Babesia bovis, Babesia bigemina, e Anaplasma marginale que, combinada com o dano de hemofeeding direto, pode reduzir a produção de leite e carne, causar anemia e, finalmente, a morte. As perdas causadas por este ectoparasita foram estimadas em 3.240.000.000 dólares anuais no Brasil¹. São exigidos métodos sustentáveis e a utilização de agentes entomopatogênicos é considerada uma alternativa promissora para reduzir o uso de acaricidas químicas^2,3,4.

Fungos entomopatogênicos, como Metarhizium spp., são inimigos naturais de artrópodes, incluindo carrapatos, e alguns isolados podem ser usados como biocontroladores. Esses patógenos infectam ativamente o hospedeiro através da cutícula e colonizam ocorpo^2,5,6. À medida que a infecção se desenvolve, as respostas celulares e humorais são mediadas pelo sistema imunológico do carrapato. A análise da hemolinfa do carrapato é relatada como uma ferramenta útil para avaliar as respostas imunes após o desafio com os patógenos^7,8.

A resposta imune dos artrópodes é dividida em respostas humorais e celulares. A resposta humoral envolve processos de hemaglutinação e produção de proteínas/peptídeos antimicrobianos, enquanto a resposta imune celular é realizada através dos hemócitos. Estas células estão presentes na hemolinfa de todos os artrópodes e são relatadas para desenvolver um papel expressivo em estudos envolvendo a resposta imune inata⁹, pois está diretamente relacionado com os processos de fagocitose e encapsulação. Assim, estudos sobre hemócitos podem ajudar a investigar a via de morte e compreender processos como autofagia, apoptose e necrose. Em alguns invertebrados como bivalves, a coleção de hemócitos enfrenta limitações como ruptura celular, baixo volume de hemolinfa obtido e baixa concentração de células recuperadas¹⁰. Muito freqüentemente, dependendo da metodologia aplicada, a concentração reduzida de células é obtida, impactando diretamente na quantificação e análise das células.

O número de hemócitos circulantes na hemolinfa é variável entre os diferentes artrópodes e pode mudar na mesma espécie devido a diferentes estágios fisiológicos, como sexo, idade e estágio de desenvolvimento do artrópode¹¹. Hemócitos também podem ser encontrados aderiram a alguns órgãos e ser liberado em circulação logo após o processo de infecção¹¹. No entanto, a maioria dos estudos relatou uso de insetos, enquanto os carrapatos permanecem menos explorados quanto à sua fisiologia e patologia. Apesar da inoculação do patógeno e da coleta de hemolinfas em carrapatos são técnicas menos utilizadas, o estabelecimento de métodos padrão auxilia no desenvolvimento de estudos mais precisos.

O objetivo do presente estudo foi comparar os métodos mais utilizados para coleta de hemolinfas e inoculação de patógenos em carrapatos de R. MICROPLUS , avaliando a eficácia na concentração de hemolinfas e hemócitos.

Protocolo

Os carrapatos utilizados no presente estudo foram obtidos de uma colônia artificial, mantido na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, que métodos foram aprovados pela Comissão de ética para o uso de animais vertebrados (ceua-IV/UFRRJ #037/2014).

1. carrapato fêmeas ingurgadas

1. Após a coleta de carrapatos, lave as fêmeas ingurgitadas usando água da torneira e mergulhe-as em 0,5% (v/v) solução de hipoclorito de sódio por 3 min em um recipiente de vidro de 500 mL, para higiene da cutícula (Figura 1), depois seque todas as fêmeas usando toalhas de papel estéreis (Figura 2).
2. Dividir fêmeas em grupos ponderados homogêneos (com 20 fêmeas cada): um grupo sem qualquer tratamento, um grupo controle inoculado com 5 μL de solução aquosa de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v) e um grupo infectado inoculado com 5 μL em 1,0 x 10 ⁷ blastosporos ml^-1.
   Nota: apenas carrapatos não tratados foram utilizados para concentração de volume e hemócitos. Foram realizadas três repetições de cada grupo.

2. inoculação de patógenos entre o Scutum e o capitulo

Nota: no presente estudo, foram utilizadas suspensões fúngicas entomopatogênicas como exemplo.

1. Suspender blastosporos fúngicos em 1 mL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) e ajustar a uma concentração final de 1,0 x 10⁷ Blastosporos ml^-1. Adicionar uma alíquota de 5 μL de blastósporos Metarhizium (Figura 3) suspensão à superfície de uma película de parafina plástica.
   Nota: a suspensão de blastósporos de Metarhizium foi ajustada com uma câmara de Neubauer. Para acelerar o processo de inoculação, múltiplas bolhas podem ser adicionadas à superfície do filme de parafina plástica, cada bolha correspondendo a 5 μL.
2. Use uma seringa de insulina de 1 mL ultrafina e uma agulha de 0,3 mm para puxar a suspensão e inocular-la no carrapato. Lembre-se de tirar todo o ar da seringa antes de usá-lo.
3. Inocular 5 μL de suspensão fúngica no carrapato feminino entre o Scutum e o capitulo. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de 0,1% de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano (v/v) sem fungo.
   Nota: um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no forame após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.

3. inoculação de fungos entomopatogênicos entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato

1. Inocular fêmeas com suspensão fúngica (5 μL em 1,0 x 10⁷ blastosporos ml^-1) entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea, utilizando uma seringa de insulina de 1 ml ultrafina acoplada a uma agulha de 0,3 mm. Inocular fêmeas do grupo controle com 5 μL de solução aquosa de monooleato de polioxietileno sorbitano de 0,1% (v/v).
   Nota: quando a inoculação de blastósporos de Metarhizium é realizada entre o Tigh da perna e o corpo da fêmea do carrapato, um pequeno volume de hemolinfa pode estar presente no Tigh após a inserção da agulha. Tenha cuidado para não inocular o ar.

4. hemolinfa dorsal coleção

1. Use a parte de borracha de um conjunto de infusão alada, um tubo capilar de 0,3 mm e uma ponta filtrada para realizar a coleta de hemolinfa.
2. Interrompa a cutícula dorsal fêmea usando uma agulha de 0,3 mm.
3. Após a interrupção, aplique uma pressão suave na parte anterior do corpo do carrapato. Observe um líquido quase transparente puxando para fora do local da perturbação. Colete a hemolinfa sugando o líquido através da ponta do filtro acoplada à parte de borracha de um conjunto de infusão alado, e um tubo capilar de 0,3 mm.
   Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.

5. coleção do hemolymph do pé do tiquetaque

1. Imobilizar o carrapato, cortar um pedaço de uma perna dianteira com um par de tesouras.
   Nota: uma ou mais pernas podem ser cortadas, bem como, a mesma perna pode ser cortada mais de uma vez.
2. Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observar uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte e coletá-la com o tubo capilar, conforme descrito na etapa 4,3.
   Nota: não pressione o corpo do carrapato dificilmente durante a sua imobilização, pois isso pode perturbar o intestino médio e contaminar a hemolinfa. Aguarde até que a pressão suave possa expelir o fluido sem contaminação.

6. hemolinfa de processamento

1. Após a coleta da hemolinfa, deposite-o em 1,5 mL de microtubos previamente preenchidos com 30 μL de coquetel de protease e 82 μL de tampão fisiológico. Mantenha os microtubos no gelo em toda a coleção da hemolinfa.
2. Amostras de centrifugação (500 x g durante 3 min a 4 ° c). Uma pelota macia dos hemócitos será dada forma após A centrifugação do hemolinfa.
   Nota: para a quantificação da hemolinfa, quantificar o volume de hemolinfa obtido contando o volume total dentro do microtubo e descontando o volume de coquetel de protease e tampão salino.
3. Retire cuidadosamente o sobrenadante (hemolinfa sem células). Ressuspender suavemente as células, por exemplo, a cultura L-15 de Leibovitz ajustada para pH 7,0-7,2. Quantifique os hemócitos colocando 10 μL de hemócitos ressuscitos em uma câmara de Neubauer.

7. preparação da corrediça da amostragem do hemocyte

1. Corte a perna dianteira do carrapato com um par de tesouras.
2. Aplique uma pressão suave na parte posterior do corpo do carrapato. Observe uma bolha líquida transparente que aparece no local de corte.
3. Aplique as gotas do hemolinfa diretamente em corrediças limpas do microscópio, depois disso, use métodos apropriados para manchar as pilhas.
   1. Para manchar hemócitos usando Giemsa, secar a hemolinfa na lâmina por 30 min, corrigi-lo em temperatura ambiente com metanol por 3 min, e mancha na solução de Giemsa (1:9 proporção de solução tampão de Sorensen, pH 7,2) por 30 min à temperatura ambiente. Lave as lâminas com água corrente para remover o excesso de corante, seque o slide e avalie as células em 400x em um microscópio óptico.

Resultados

Este artigo aborda métodos de coleta de inoculação e hemolinfa aplicados a carrapatos. Após a inoculação entre a coxa da perna e o corpo da fêmea do carrapato, algum fluido (hemolinfa) pode ser secretado durante o processo; no entanto, é importante notar que, quando a inoculação é terminada, nenhum líquido ou tecido estiveram presentes na ponta da agulha ou no local de inoculação, assegurando que a suspensão fúngica foi completamente inoculada. Quando o processo de inocula...

Discussão

A inoculação de patógenos é útil quando o estudo objetiva investigar a ação in vivo de microrganismos em modelos experimentais de artrópodes, pois assegura que o patógeno está dentro do hospedeiro. A técnica também pode ser aplicada para inocular moléculas como a interferência do RNA (RNAi). A inoculação entre o Scutum e o capitulo é considerada mais fácil de realizar, mas freqüentemente danifica o órgão de Gené, prejudicando a viabilidade dos ovos^12,13

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662