무척 추 병리학 연구를 향한 Rhipicephalus 마이크로 플러스 진드기에 Metarhizium 발 파 포자의 혈 림프 수집 및 접종을 공개

요약

진드기 혈 림프의 분석은 몇몇 병원 체가 질병을 일으키는 원인이 되는 방법에 대 한 정보의 중요 한 근원 및 어떻게 진드기 면역 학적으로이 감염에 반응 하는지 나타냅니다. 본 연구는 곰 팡이 propagules 접종 하 고 rhipicephalus 마이크로 플러스 튀 여성에서 혈 림프를 수집 하는 방법을 보여줍니다.

초록

진드기는이 빈 혈, 체중 감량, 동물의 감가 상각을 유발 하 고 또한 여러 병원 체의 벡터로 작용할 수 있기 때문에, 적 혈 기생충 및 Rhipicephalus 마이크로 플러스 는 수의학에서 매우 중요 하다. 이러한 기생충을 제어 하는 엄청난 비용으로 인해, 화학 살 비제 부적절 하 게 사용 하 여 발생 하는 환경에 대 한 손상, 전통적인 parasiticides에 대 한 저항성 증가, 진드기의 대체 제어, 사용 병원 성 진 균은 예를 들어, 흥미로운 접근법으로 간주 되어 왔다. 그럼에도 불구 하 고, 진드기의 면역 체계가이 병원 균을 싸우는 것을 어떻게 작용 하는지 몇몇 연구 결과는 보여주었습니다. 따라서,이 프로토콜은 혈 림프 수집 및 혈 세포 채취에 사용 되는 두 가지 기술, 튀 여성에 게 토모 병원 균 접종에 사용 되는 두 가지 방법을 보여줍니다. 진드기 여성의 몸에서 다리 삽입 시 병원 균의 접종은 종종 제의 기관을 손상 시키는 스 쿠 툼과 카피 수 사이의 접종과는 달리 여성 생물학 매개 변수를 평가할 수 있습니다. 등 쪽 혈 림프 컬렉션은 다리를 통해 수집 보다 더 높은 볼륨 복구를 산출. 진드기 혈 림프 수집 및 처리의 몇 가지 제한 포함 i) 혈 세포의 붕괴의 높은 속도, ii) 혈 림프 오염 된 미드 창 및 iii) 낮은 혈 림프 볼륨 복구. 혈 림프이 다리 절단을 통해 수집 될 때, 혈 림프는 다리 개 구 부에 축적 되어 응고 과정을 선호 하는 데 시간이 걸립니다. 또한, 첫 번째 방법이 수행 되기 쉬운 것으로 간주 되더라도, 등 쪽 컬렉션에 비해 다리를 통해 수집에서 얻어진 혈 세포 수가 적습니다. En토모 병원 성 에이전트에 의해 매개 된 진드기에 있는 면역 반응을 이해 하는 것은 그들의 병 인을 공개 하 고 진드기 통제를 위한 새로운 표적을 개발 하는 것을 돕습니다. 여기에 설명 된 접종 과정은 매우 낮은 기술 자원이 필요 하며 병원 성 미생물에 진드기를 노출 시키는 데에만 사용할 수 있습니다. 유사 하 게, 틱 혈 림프의 수집은 많은 생리 적 연구를 위한 첫 번째 단계를 나타낼 수 있다.

서문

가축 진드기, Rhipicephalus 마이크로 플러스, 열 대 지역에서 가축에 엄청난 부정적인 영향을 미치는 적혈구. 이 진드기는 직접적인 혈액 공급 손상과 결합 하 여 우유와 육류 생산을 감소 시키고, 빈 혈을 일으키고 궁극적으로 사망을 유발할 수 있는 babesia 우 황, babesia비에 미 나, 그리고 anaplasma 마르지 오와 같은 병원 성 대리인의 벡터입니다. 이 ectoparasite에 기인한 손실은 브라질¹에 있는 32억4000만 달러에서 해마다 추정 되었습니다. 지속 가능한 방법은 요구 되 고,도 토모 병원 성 대리인의 사용은 화학 살 비제의 사용을 감소 시키기 위하여 유망한 대 안으로 고려 됩니다^2,3,4.

곤충 병원 성 진 균, 예컨대 Metarhizium 의 미생물은 진드기를 포함 한 절지동물의 자연 적 이며, 일부 분리는 바이오 컨트롤러로 서 사용 될 수 있다. 이 병원 체는 표 피를 통해 호스트를 활발 하 게 감염 시키고 그들의 바디^2,5,6를 식민지 화 합니다. 감염이 발달 함에 따라, 세포 및 체액 반응은 진드기 면역 계통에 의해 중재 됩니다. 진드기 혈 림프의 분석은 병원 균^7,8에 도전 한 후 면역 반응을 평가 하는 유용한 도구로 보고 된다.

절지동물의 면역 반응은 체액 성 및 세포 반응으로 나뉩니다. 체액 성 반응은 hemagglutination 과정 및 항균 단백질/펩 티 드의 생산을 포함 하는 반면, 세포 면역 반응은 혈액 세포를 통해 수행 됩니다. 이 세포는 모든 절지동물에서 혈 림프에 존재 하며 식 균 작용 및 캡슐화 과정과 직접적으로 관련 되어 있기 때문에 타고 난 면역 반응⁹를 포함 하는 연구에서 표현 역할을 개발 하는 것으로 보고 됩니다. 따라서, 혈 세포에 대 한 연구는 죽음 통로를 조사 하 고 자동 포식, 세포 사 멸 및 괴 사와 같은 과정을 이해 하는 것을 도울 수 있습니다. 이중 밸브로 서 일부 무척 추 동물에서, 혈 세포의 수집은 세포 파괴, 낮은 혈 림프 부피 및 회복 된 세포의 낮은 농도와 같은 한계를 직면 하 게 된다¹⁰. 매우 자주 적용 되는 방법론에 따라 세포의 농도가 감소 하 여 세포 정량화 및 분석에 직접적으로 영향을 미칩니다.

혈 림프에서 순환 하는 혈 세포의 수는 다른 절지동물 들 사이에서 가변적 이며 성, 나이 및 절지동물의 발달 단계¹¹과 같은 상이한 생리 적 단계 들로 인해 동일한 종에서 변할 수 있다. 혈 세포는 또한 몇몇 기관에 고착 하 고 감염 과정¹¹직후에 회람으로 풀어 놓을 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대부분의 연구 보고 사용 곤충, 진드기 남아 그들의 생리학 및 병리학에 대 한 탐구. 진드기에 있는 병원 체 접종 그리고 혈 림프 수집은 적게 사용 된 기술에도 불구 하 고, 표준 방법을 확립 하는 것은 더 정확한 연구의 발달을 돕습니다.

본 연구의 목적은 병원 균의 혈 림프 수집 및 접종을 위한 가장 많이 사용 되는 방법을 r. 마이크로 플러스 틱에 비교 하 여 혈 림프 획득 및 혈 세포 농도에서의 효능을 평가 하는 것 이었습니다.

프로토콜

본 연구에서 사용 되는 진드기는 척추 동물 동물 (CEUA/UFRRJ #037/2014)의 사용에 대 한 윤리 위원회에 의해 승인 된 리오 데 자네이로의 연방 농촌 대학에서, 인공 식민지 로부터 얻어 졌다.

1. 진드기를 안은 여성

1. 진드기 채집 후, 수돗물을 사용 하 여 암컷을 세척 하 고 500 mL 유리 비 커 수용자에 3 분 동안 0.5%의 차 아 염소 산 나트륨 용액에 담가 두고, 큐티 클 위생을 위해 (그림 1) 멸 균 페이퍼 타월을 사용 하 여 모든 여성을 건조 시키십시오 (그림 2).
2. 여성을 동종의가 중 그룹 (각각 20 여 명의 여성)으로 나눕니다: 1 개의 대조 군에는 아무런 처리도 없이, 0.1%의 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노로 에이트 수 용액 (v/v)을 5 µ로 접종 하 고, 1.0 x 10에서 5 µ L을 접종 하 고 1 개 감염 기 ⁷ 블^{로 투 포자 mL-1}
   참고: 치료 되지 않은 진드기만 부피 및 혈액 세포 농도에 사용 되었다. 각 그룹에 대 한 3 개의 반복이 수행 되었습니다.

2. 흠집과 카피의 병원 균 접종

참고: 본 연구에서는,도 토모 병원 성 진 균 현 탁 액을 일례로 사용 하였다.

1. 0.1% 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노로 에이트 수 용액 (v/v)의 1 mL에 곰 팡이 발 포 포자를 일시 중단 하 고 최종 농도의 1.0 × 10⁷ 배도 포자 mL^-1로 조절 한다. 5 µ L Metarhizium 의 배 반 포자를 추가 합니다 (그림 3) 플라스틱 파라핀 필름의 표면에 현 탁 액을 첨가 한다.
   참고: 노이 바 우 어 ´ s 챔버를 사용 하 여 조정 된 발 포 포자 현 탁 액. 접종 과정을 가속화 하기 위해, 다중 버블은 5 µ L에 대응 하는 각 버블, 플라스틱 파라핀 막 표면에 첨가 될 수 있다.
2. 1 mL 초 미세 인슐린 주사기와 0.3 mm 바늘을 사용 하 여 현 탁 액을 당기고 진드기에 접종 하십시오. 사용 하기 전에 주사기에서 모든 공기를 꺼내 잊지 마십시오.
3. 스 쿠 툼과 카피 자리 사이의 진드기 암컷으로 진 균 현 탁 액의 5 µ L 접종. 균 류 없이 0.1%의 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 수 용액 (v/v)을 5 µ L의 대조 군 으로부터 암컷 접종.
   참고: 바늘을 삽입 한 후에 혈 림프 작은 양이 있을 수 있습니다. 공기를 접종 하지 않도록 주의 하십시오.

3. 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이에 토모 병원 성 진 균의 접종

1. 암컷은 0.3 mm 바늘에 결합 된 1 mL 초 미세 인슐린 주사기 를 사용 하 여 다리 tigh와 여성의 몸 사이에 곰 팡이 현 탁 액 (5 µ l 1.0에서 107blasto포자 mL^-1)으로 여성을 접종 합니다. 0.1% 폴 리 옥 시 에틸렌 소 르 비 탄 모노 롤 레이트 수 용액 (v/v)의 5 µ L을 사용 하 여 대조 군 으로부터 암컷을 접종 한다.
   참고: 다리 tigh와 진드기 여성의 신체 사이에서 수행 되는 양 발 포 포자 접종 시, 소량의 혈 림프 바늘 삽입 후 tigh에 존재할 수 있다. 공기를 접종 하지 않도록 주의 하십시오.

4. 등 쪽 혈 림프 컬렉션

1. 날개 달린 주입 세트의 고무 부분, 0.3 mm 모 세관 튜브 및 필터링 된 팁을 사용 하 여 혈 림프 컬렉션을 수행 하십시오.
2. 0.3 mm 바늘을 사용 하 여 여성 등 쪽 큐티 클을 파괴 하십시오.
3. 중단 후, 진드기 몸체의 앞쪽 부분에 완만 한 압력을가 하십시오. 붕괴 부위를 잡아당기면 서 거의 투명 한 액체가 관찰 됩니다. 날개 달린 주입 세트의 고무 부분에 결합 된 필터 팁과 0.3 mm 모 세관을 통해 액체를 흡입 하 여 혈 림프를 수집 한다.
   주:이 중간 장을 방해 하 고 혈 림프을 오염 시킬 수 있기 때문에 진드기의 몸을 고정 하는 동안 거의 누르지 마십시오. 부드러운 압력이 오염 없이 유체를 추방 할 수 있을 때까지 기다리십시오.

5. 진드기의 다리에서 혈 림프 컬렉션

1. 진드기를 움직이지 않게 하 고, 앞 다리의 한 조각을가 위 한 쌍으로 자릅니다.
   주: 하나 이상의 다리를 절단 할 수 있을 뿐만 아니라 동일한 다리를 한 번 이상 절단할 수 있습니다.
2. 진드기의 후부 몸통 부분에 부드러운 압력을가 합니다. 4.3 단계에서 설명한 바와 같이 절단 부 위에 표시 되는 투명 한 액체 버블을 관찰 하 고 모 세관 튜브로 수집 합니다.
   주:이 중간 장을 방해 하 고 혈 림프을 오염 시킬 수 있기 때문에 진드기의 몸을 고정 하는 동안 거의 누르지 마십시오. 부드러운 압력이 오염 없이 유체를 추방 할 수 있을 때까지 기다리십시오.

6. 혈 림프 처리

1. 혈 림프 수집 후, 이전에 30 µ L 프로 테아 제 칵테일 및 82 µ L 염 수 완충 액으로 채워진 1.5 mL 마이크로 튜브에 보관 하십시오. 혈 림프 컬렉션 전체에 마이크로 튜브를 얼음 위에 보관 하십시오.
2. 원심 분리기 샘플 (4 ° c에서 3 분 500 x g ). 혈 림프 원심 분리 후에 혈 세포의 부드러운 펠 렛이 형성 됩니다.
   주: 혈 림프 정량화의 경우, 마이크로 튜브 내부의 총 부피를 세어 얻은 혈 림프 부피를 정량화 하 고 프로 테아 제 칵테일 및 염 분 완충 액의 부피를 할인 합니다.
3. 상 등 액 (무 세포 혈 림프)을 조심 스럽게 제거 하십시오. 예를 들어, 라이 보 비 츠의 L-15 배양 액을 pH 7.0-7.2로 조정 하 여 세포를 부드럽게 소생 시켰다. 재현 탁 혈 세포의 10 µ L을 노이 바 우 어 챔버에 배치 하 여 혈 세포를 정량화 합니다.

7. 혈액 모 세포 샘플링 슬라이드 준비

1. 한 쌍의가 위를 사용 하 여 진드기의 앞쪽 다리를 자릅니다.
2. 진드기의 후부 몸통 부분에 부드러운 압력을가 합니다. 절단 부 위에 나타나는 투명 한 액체 버블을 관찰 하십시오.
3. 깨끗 한 현미경 슬라이드에 직접 혈 림프 방울을 바르 십시오, 그 후에, 세포를 염색 하기 위하여 충당 된 방법을 사용 하십시오.
   1. Giemsa를 사용 하 여 혈 색을 염색 하기 위해, 슬라이드 상에 서 혈 림프를 30 분간 공기 건조 하 고, 상 온에서 3 분간 메탄올을 이용 하 여 실 온에서 30 분간, Giemsa 용액 (1:9의 완충 용액, pH 7.2)에서 얼룩을 고정 시켰다. 과량의 염료를 제거 하 고, 슬라이드를 공기 건조 하 고, 광학 현미경으로 400x에서 세포를 평가 하기 위해 흐르는 물로 슬라이드를 씻으십시오.

결과

이 문서에서는 틱에 적용 된 접종 및 혈 림프 수집 방법에 접근 합니다. 다리 허벅지와 진드기 여성의 몸 사이에 접종 후, 일부 유체 (혈 림프) 과정 동안 분 비 될 수 있다; 그러나 접종이 완료 되 면 바늘 끝 이나 접종 현장에 액체 나 조직이 존재 하지 않아 곰 팡이 현 탁 액이 완전히 접종 되었는지 확인 하는 것이 중요 합니다. 접종 과정이 올바르게 수행 되 면, 바늘 삽입?...

토론

병원 균의 접종은 병원 균이 숙주 내에 있다는 것을 보장 하기 때문에 실험에 있어서 미생물의 생체 내 작용을 조사 하는 것을 목적으로 연구를 하는 것이 유용 하다. 이 기술은 또한 RNA 간섭 (RNAi)과 같은 예방 접종 분자에 적용 될 수 있다. 스 쿠 툼과 카피 수 사이에 접종 하는 것은 수행 하기가 더 쉽지만, 종종 계란 생존 율^12를저해 하는 게 나의 기관?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662