בגילוי המוליל אוסף והחיסונים של מטרהיזיפיאוס לתוך ריפיקו מיקרופלוס קרציות לקראת לימודי חסרי חוליות פתולוגיה

Summary

ניתוח של שנתות המוליקמ מייצג מקור חשוב של מידע על איך כמה פתוגנים לגרום למחלה וכיצד קרציות מגיבים באופן חיסוני לזיהום זה. המחקר הנוכחי מדגים כיצד לחסן מפיץ פטרייתי ולאסוף המוליםקמ מ הנשים המנוסות מיקרופיאוס .

Abstract

קרציות הם מחייבים המטפנים ectop, ו המיקרופיקאוס מיקרופלוס יש חשיבות רבה ברפואה וטרינרית כי זה גורם לאנמיה, ירידה במשקל, פחת של עור בעלי חיים גם יכול לשמש וקטור של מספר פתוגנים. בשל העלויות הכרוכות בשליטה בטפילים אלה, נזק לסביבה הנגרמת על ידי שימוש לא הולם בחומר הדברה כימי, והתנגדות מוגברת נגד פרזיטים מסורתיים, שליטה אלטרנטיבית על קרציות, על ידי שימוש ב הפטריות הentomopathogenic, למשל, נחשבה לגישה מעניינת. עם זאת, מחקרים מעטים הוכיחו כיצד המערכת החיסונית של הקרצייה פועל כדי להילחם אלה entomopathogens. לפיכך, פרוטוקול זה מדגים שתי שיטות המשמשות לentomopathogen חיסונים לנקבות מנוגנות ושתי טכניקות המשמשות עבור אוסף המוליש וקצירת הומוציטים. החיסונים של פתוגנים בכניסה לרגל בגוף של שנתות הנשי מאפשר הערכה של הנשים פרמטרים ביולוגיים בניגוד החיסון בין scuulum לבין הקפיאולום, אשר לעתים קרובות לנזק עוגב של ג ' ו. מעבר לאוסף באמצעות הרגליים הניב התאוששות בנפח גבוה יותר. כמה מגבלות של שנתות המוליקמ האוסף ועיבוד כוללים i) שיעור גבוה של הפרעות הומוציטים, ii) המוליקמ זיהום עם שיבושים באמצע המעיים, ו iii) נמוך המוליקמ האחסון התאוששות. כאשר המוליקמ נאסף באמצעות חיתוך הרגל, המוליש לוקח זמן לצבור בפתיחת הרגל, העדפה תהליך קרישת דם. בנוסף, פחות הומוציטים מתקבלים באוסף דרך הרגל בהשוואה לאוסף הקודם, למרות שהשיטה הראשונה נחשבת קלה יותר לביצוע. הבנת התגובה החיסונית של קרציות בתיווך על ידי סוכני entomopathogenic מסייעת לחשוף פתוגנזה שלהם ולפתח מטרות חדשות עבור שליטה קרציות. תהליכי החיסונים המתוארים כאן דורשים משאבים טכנולוגיים נמוכים מאוד וניתן להשתמש בהם לא רק כדי לחשוף קרציות לאורגניזמים פתוגניים. באופן דומה, את האוסף של שנתות המוליקמ הוא עשוי לייצג את הצעד הראשון עבור מחקרים פיזיולוגיים רבים.

Introduction

שנתות הבקר, ריפיקאראוס מיקרופלוס, הוא hematophagus ectoparasite עם השפעה שלילית עצומה על בעלי חיים באזורים טרופיים. שנתות זה הוא וקטור של סוכני פתוגניים כגון babesia סטרפטקוקוס, babesia bigemina, ו אנקלמה מרגיא כי, בשילוב עם הנזק העוצר הישיר, יכול להפחית את ייצור החלב והבשר, לגרום לאנמיה ובסופו של דבר מוות. הפסדים שנגרמו על ידי הפקעון זה הוערך ב3,240,000,000 דולר בשנה בברזיל¹. שיטות בר-קיימא הינן מבוקשת והשימוש בסוכני entomopathogenic נחשב חלופה מבטיחה להפחתת השימוש בחומרי הדברה כימיים^2,3,4.

פטריות Entomopathogenic, כגון Metarhizium spp., הם אויבים טבעיים של פרוקי רגליים כולל קרציות, וכמה מבודד ניתן להשתמש כמו biocontrollers קרים. פתוגנים אלה באופן פעיל להדביק את המארח דרך קוטיקולה וליישב את גופם^2,5,6. ככל שהזיהום מתפתח, תגובות סלולריות ומוסריות מתווכת על ידי המערכת החיסונית שנתות. ניתוח של שנתות המוליקמ הוא דיווח ככלי שימושי כדי להעריך את התגובות החיסונית לאחר מאתגרת עם פתוגנים^7,8.

התגובה החיסונית של פרוקי רגליים מחולקת תגובות ומוראלית ו הסלולר. התגובה ההואתית כוללת תהליכים hemagglutination ייצור של חלבונים מיקרוביאלית/פפטידים, בעוד התגובה החיסונית הסלולר מבוצעת דרך הומוציטים. תאים אלה נמצאים המוליקמ מכל פרוקי רגליים והם דיווחו לפתח תפקיד הבעה במחקרים הכרוכים בתגובה החיסונית מולדת⁹, כפי שהוא קשור ישירות הפאגוציטוזה ותהליכים אנקפסולציה. לפיכך, מחקרים על הומוציטים יכולים לעזור לחקור את נתיב המוות ולהבין תהליכים כגון אוטומטי, אפופטוזיס, ו נמק. ביצורים מסוימים כמו bivalves, אוסף הומוציטים הפנים מגבלות כמו הפרעה לתא, נמוך נפח המוליש השיגה, וריכוז נמוך של תאים התאושש¹⁰. לעתים קרובות מאוד, בהתאם למתודולוגיה המוחלת, ריכוז מופחת של תאים מתקבל, להשפיע ישירות על התאים הקוונפיקציה וניתוח.

מספר הומוציטים במחזור המוליקמ הוא משתנה בין פרוקי רגליים שונים, זה יכול לשנות באותו מינים בשל שלבים פיסיולוגיים שונים כגון סקס, גיל, ואת השלב ההתפתחותי של פרוקי הרגליים¹¹. הומוציטים ניתן גם למצוא דבק לאיברים מסוימים ולהיות שוחרר לתוך זרימת הדם רק לאחר תהליך הזיהום¹¹. עם זאת, רוב המחקרים דיווחו על השימוש בחרקים, בעוד שקרציות נשארות פחות בחקר הפיזיולוגיה והפתולוגיה שלהם. למרות הפתוגן ואוסף המוליקמ בקרציות הם פחות טכניקות בשימוש, הקמת שיטות סטנדרטיות מסייעת לפיתוח מחקרים מדויקים יותר.

מטרת המחקר הנוכחי היתה להשוות את השיטות הנפוצות ביותר עבור המוליקמ אוסף וחיסונים של פתוגנים לתוך R. microplus קרציות, הערכת היעילות של רכישת המוליקמ רכש וריכוז הומוציטים.

Protocol

קרציות ששימשו במחקר הנוכחי התקבלו ממושבה מלאכותית, הנסבית באוניברסיטה הכפרית הפדרלית של ריו דה ז'ניירו, שיטות שאושרו על ידי הוועדה על אתיקה לשימוש בעלי חוליות (CEUA-IV/UFRRJ037/2014).

1. שנתות הנקבות

1. לאחר מפגש שנתות, לשטוף את הנקבות הנפוח באמצעות מי ברז לטבול אותם 0.5% (v/v) נתרן היפוכלוריט עבור 3 דקות ב-500 mL זכוכית בגביע הנמען, עבור היגיינה לקוטיקולה (איור 1), ואז לייבש את כל הנקבות באמצעות מגבות נייר סטרילי (איור 2).
2. חלוקת נקבות קבוצות משוקלל הומוגנית (עם 20 הנקבות כל אחד): קבוצה אחת ללא כל טיפול, קבוצת שליטה אחת מחוסנת עם 5 μL של 0.1% polyoxyethylene ביתן מונאובית מימית פתרון (v/v), ואחד נגוע הקבוצה מחוסן עם 5 μL ב 1.0 x 10 ^שבעה בלסטונבגים mL^-1.
   הערה: רק קרציות שאינן מטופלות שימשו לריכוז אמצעי האחסון והדימום. שלושה משכפל של כל קבוצה בוצעו.

2. גורמי פתוגנים בין הסטום לבין הקפיאולום

הערה: במחקר הנוכחי, שentomopathogenic פטריות שימשו כדוגמה.

1. השעיה פטריות בלייסטינבגים ב 1 מ ל של 0.1% polyoxyethylene יתן מונאובית הפתרון מימית (v/v) ולהתאים לריכוז הסופי של 1.0 x 10⁷ בלסטונבגים mL^-1. הוסף הארכה של 5 μL Metarhizium (איור 3) ההשעיה על פני השטח של סרט פרפין פלסטיק.
   הערה: מטרהיזיאום בלסטונבגים הבולם הותאם באמצעות תא נויבאואר ́s. כדי להאיץ את תהליך החיסונים, בועות מרובות ניתן להוסיף משטח הסרט פרפין פלסטיק, כל בועה המתאימה 5 μL.
2. השתמש 1 mL מזרק משובח במיוחד אינסולין ו מחט 0.3 מ"מ כדי למשוך את ההשעיה והאיחסן אותו לתוך הקרצייה. זכור להוציא את כל האוויר מתוך המזרק לפני השימוש בו.
3. האיחסן 5 μL של התליה פטרייתי לתוך הנקבה שנתות בין scutum ו capitulum. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v) ללא פטריה.
   הערה: נפח קטן של המוליקמ עשוי להיות נוכח על foramen לאחר החדרת מחט. . היזהר לא להיות בחיסון

3. החיסונים של פטריות entomopathogenic בין ירך הרגל לבין גוף הקרציה

1. הנשים הנחסן עם הבולם פטרייתי (5 μL ב 1.0 x 10⁷ blastospores mL^-1) בין הרגל טיי ואת הגוף של הנקבה, באמצעות מזרק 1 mL במיוחד אינסולין משולב למחט 0.3 מ"מ. איחסן נשים מקבוצת הביקורת עם 5 μL של 0.1% ביתן מימית הפתרון (v/v).
   הערה: כאשר החיסון מבוצע בין טיי לבין הגוף הנשי, נפח קטן של המוליקמ ניתן להציג על טיי לאחר החדרת המחט. . היזהר לא להיות בחיסון

4. אוסף של המוליע

1. השתמש בחלק הגומי של ערכת אינפוזיה מכונפת, שפופרת קפילר 0.3 מ"מ, וטיפ מסונן לביצוע אוסף המוליקמ.
2. יש לשבש את הקוטיקולה הנשית בעזרת מחט 0.3 מ"מ.
3. לאחר הפרעה, להחיל לחץ עדין על החלק הקדמי של הגוף הטיק. שימו לב לנוזל כמעט שקוף שיוצא מאתר השיבוש. לאסוף את המוליע על ידי יניקה הנוזל דרך קצה המסנן מצמידים לחלק גומי של ערכת עירוי מכונף, ו צינור 0.3 מ"מ נימי.
   הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.

5. המוליקמ אוסף מתוך הרגל שנתות

1. לשתק את הקרצייה, לחתוך חתיכת. רגל קדמית עם זוג מספריים
   הערה: ניתן לגזור את הרגליים אחת או יותר, כמו גם את אותה הרגל ניתן לגזור יותר מפעם אחת.
2. הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. צפו בבועה נוזלית שקופה אשר מופיע באתר לחתוך ולאסוף אותו עם צינור נימי, כפי שמתואר בשלב 4.3.
   הערה: אין ללחוץ על הגוף של הקרצייה כמעט בזמן השתק, כי זה עלול לשבש את המעיים ולזהם את המוליש. המתן עד שהלחץ העדין יכול לסלק את הנוזל ללא זיהום.

6. עיבוד המוליש

1. לאחר אוסף המוליקמ, להפקיד אותו 1.5 mL מיקרוצינוריות בעבר מילא 30 μL הקוקטייל פרוטאז ו 82 מאגר מלוחים μL. לשמור על המיקרוצינוריות על הקרח ברחבי אוסף המוליקמ.
2. דגימות צנטריפוגה (500 x g עבור 3 דקות ב -4 ° c). גלולה רכה של הומוציטים ייווצר לאחר המוליקמ צנטריפוגה.
   הערה: עבור כימות המוליקמ, לכמת את נפח המוליקמ שהושג על ידי ספירת הנפח הכולל בתוך מיקרופופרת ולממש את עוצמת הקול של קוקטייל פרוטאז מאגר מלוחים.
3. הסר בזהירות את הסופרנטנט (ללא תא המוליקמ). השהה מחדש בעדינות את התאים ב-, לדוגמה, התרבות L-15 של ליבוביץ הותאמה ל-pH 7.0-7.2. מכמת הומוציטים על ידי הצבת 10 μL של מושעה מחדש בתוך תא של נויבאואר.

7. הכנת שקופיות דגימת הומוציט

1. תחתוך את הרגל הקדמית של הקרצייה. עם זוג מספריים
2. הפעילו לחץ עדין על חלק גופו האחורי של הקרצייה. שימו לב לבועה נוזלית שקופה שתופיע באתר החתוך.
3. להחיל את המוליקמ טיפות ישירות על שקופיות מיקרוסקופ נקי, לאחר מכן, להשתמש בשיטות מופקעים להכתים את התאים.
   1. כדי להכתים הומוציטים באמצעות Giemsa, אוויר יבש המוליקמ על השקופית עבור 30 דקות, לתקן אותו בטמפרטורת החדר עם מתנול עבור 3 דקות, וכתם בתמיסה Giemsa (1:9 יחס של פתרון המאגר של סורנסן, pH 7.2) עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. רוחצים את השקופיות עם מים זורמים כדי להסיר את עודף הצבע, האוויר יבש את השקופית ולהעריך את התאים ב-400 x במיקרוסקופ אופטי.

תוצאות

מאמר זה מתקרב לחיסון ושיטות גבייה המוליקמ על קרציות. לאחר החיסון בין ירך הרגל לגוף הנשי, ניתן לפרש חלק מהנוזל (המוליקמ) במהלך התהליך; עם זאת, חשוב לציין כי כאשר החיסון מסתיים, לא נמצאו נוזלים או רקמות בקצה המחט או באתר החיסונים, ומבטיחים כי ההשעיה הפטרייתית מחוסנת לחלוטין. ?...

Discussion

החיסונים של פתוגנים הוא שימושי כאשר המחקר שואפת לחקור את הפעולה vivo של מיקרואורגניזמים במודלים פרוקי-רגליים ניסיוני כי זה מבטיח כי הפתוגן הוא בתוך המארח. ניתן להחיל את הטכניקה גם על מולקולות של החיסונים כגון RNA הפרעה (RNAi). החיסון בין הסטום לקפיאולום נחשב לקל יותר לביצוע, אך לעתים קרובות הוא ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alkaline Hypochlorite solution	Sigma-Aldrich	A1727
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
EDTA	Synth	2706
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000036
Flexible rubber	BD
Giemsa stain	Sigma-Aldrich	48900-500ML-F
Glass capillary	CTechGlass	CT95-02
Insulin syringe (needle)	BD	SKU: 324910
KH2PO4	Vetec	60REAVET014512
Leibovitz's L-15 culture medium	Gibco	11415-064
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
Microscope slides	Kasvi	K5-7105
Microtubes	BRAND	Z336769-1PAK
Na2HPO4	Vetec	60REAVET014593
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-1KG
Neubauer chamber	Kasvi	K5-0111
Penicillin	Gibco	15140163
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Tween 80	Vetec	60REAVET003662