JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا نقوم بوصف والتحقق من صحة طريقه لتوليد باستمرار قويه الإنسان المستحثة مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي وتميز وظيفتها. هذه التقنيات قد تساعد في تطوير البصيرة الميكانيكية في مسارات الإشارات ، وتوفير منصة للكشف عن المخدرات علي نطاق واسع ، ونموذج موثوق امراض القلب.

Abstract

وتوفر العضلي المشتقة من الخلايا الجذعية مستحث البشرية (iPSC-CMs) مصدرا بشريا قيما لدراسة العلوم الاساسيه لمعالجه الكالسيوم (Ca2 +) ومسارات الإشارات ، فضلا عن فحص العقاقير عاليه الانتاجيه واختبارات السمية. هنا ، نقدم وصفا مفصلا للمنهجيات المستخدمة لتوليد عاليه الجودة iPSC-CMs التي يمكن ان تتكاثر باستمرار الخصائص الجزيئية والوظيفية عبر خطوط الخلايا المختلفة. بالاضافه إلى ذلك ، يتم وصف أسلوب لتقييم التوصيف الوظيفي بشكل موثوق به من خلال تقييم خصائص التعامل مع Ca2 + . انخفاض الأكسجين (O2) الشروط ، واختيار اللاكتات ، والوقت لفترات طويلة في الثقافة تنتج عاليه النقاء وعاليه الجودة البطين مثل عضلي. مماثله لعضلي الفئران البالغين المعزولة (ARCMs) ، 3 أشهر من العمر iPSC-CMs يحمل اعلي Ca2 + السعه ، ومعدل أسرع من ca2 + امتصاص (تسوس تاو) ، واستجابه lusitropic ايجابيه لتحفيز β-الكظر مقارنه مع اليوم 30 ipsc-CMs. والاستراتيجية بسيطه من الناحية التقنية وفعاله من حيث التكلفة وقابله للتكرار. ويوفر منصة قويه لنموذج امراض القلب وللكشف عن المخدرات علي نطاق واسع لاستهداف Ca2 + التعامل مع البروتينات.

Introduction

الإنسان المستحث مستحث الخلايا الجذعية المشتقة عضلي (ipsc-CMs) هي منصة الإنسان جذابة لنمذجة مجموعه كبيره ومتنوعة من امراض القلب في المختبر1،2،3،4،5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، يمكن استخدام ipsc-CMs للتنبؤ بردود المريض علي الادويه الجديدة أو القائمة ، لفحص مركبات الضرب ، وتطوير ادويه شخصيه جديده9،10. ومع ذلك ، وعلي الرغم من التقدم الكبير ، هناك حاجه إلى النظر في العديد من القيود والتحديات عند استخدام iPSC-CMs11. التالي ، طرق لتحسين بروتوكولات التمايز القلبي ، لتعزيز كفاءه ipsc-CMs والنضج ، وتوليد أنواع فرعيه عضله محدده (البطين ، الأذيني ، والعقدي) قد درست بشكل مكثف وأديت بالفعل إلى العديد من استراتيجيات الثقافة للتغلب علي هذه العقبات12،13،14،15.

وعلي الرغم من متانة هذه البروتوكولات ، فان أحد الشواغل الرئيسية لاستخدام الاتفاقية هو استنساخ الإجراءات الطويلة والمعقدة للحصول علي عضلي عاليه الجودة يمكن ان تضمن نفس الأداء والنتائج القابلة للتكرار. استنساخ أمر بالغ الاهميه ليس فقط عند مقارنه خطوط الخلايا مع الخلفيات الوراثية المختلفة ، ولكن أيضا عند تكرار المقارنات الخلوية والجزيئية لنفس خط الخلية. وقد يؤثر تباين الخلايا ، مثل الاختلافات الجيدة في كثافة iPSCs ، علي التمايز القلبي ، وتوليد غله منخفضه وعضلي رديئه النوعية. ويمكن استخدام هذه الخلايا لا يزال لتنفيذ التجارب التي لا تتطلب السكان نقيه من CMs (علي سبيل المثال ، عند تنفيذ Ca2 + القياسات عابر). في الواقع ، عند اجراء تحليل إلكتروفيزيولوجي ، فان غير CMs لن تهزم ، لا تلقائيا ولا تحت التحفيز الكهربائي ، لذلك سيكون من السهل استبعادها من التحليل. ومع ذلك ، بسبب نوعيه رديئه ، iPSC-CMs يمكن ان تظهر الخصائص الكهربية المتغيرة (علي سبيل المثال ، غير النظامية Ca2 + عابر ، منخفضه ca2 + السعه) التي ليست بسبب ماكياج الوراثية. ولذلك ، وخاصه عند استخدام iPSC-CMs لنموذج امراض القلب ، فمن المهم عدم الخلط بين النتائج من سم رديئه الجودة مع النمط الظاهري للمرض. تتطلب عمليات الفحص الدقيق والاستبعاد قبل الانتقال إلى الدراسات الكهربية الفسيولوجية.

وتتضمن هذه الطريقة بروتوكولات محسنه لتوليد عضلي عاليه النقاء وعاليه الجودة ولتقييم وظيفتها عن طريق اجراء قياسات Ca2 + عابره باستخدام نظام اكتساب الكالسيوم والانقباض والتحليل. هذه التقنية هي وسيله بسيطه ، ولكنها قويه ، للتمييز بين الكفاءة العالية والكفاءة المنخفضة iPSC-CM الاستعدادات وتوفير توصيف أكثر اهميه من الناحية الفسيولوجية للإنسان iPSC-CMs.

Protocol

أجريت التجارب باستخدام عضلي الفئران الكبار في هذه الدراسة مع المعتمدة المؤسسات الرعاية الحيوانية والاستخدام البروتوكولات (IACUC) من المدرسة Icahn للطب في جبل سيناء. عزلت ال [جرذ عضلي] بالغه كان من [سبرغ] [ددلي] جرذ قلوب بالأسلوب [لنغندوف] يؤسس بما ان سابقا يوصف16.

1-اعداد وسائل الاعلام

  1. اعداد وسائل الاعلام hiPSC.
    1. تتوازن الملحق والمتوسطة القاعدية إلى درجه حرارة الغرفة (RT). تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 400 مل من المتوسطة القاعدية و 100 مل من الملحق وتصفيه باستخدام فلتر الفراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  2. اعداد RPMI + B27.
    1. تتوازن الملحق B27 والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 مل من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  3. اعداد الانسولين RPMI + B27 (-).
    1. تتوازن B27 (-) الملحق الانسولين والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 مل من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  4. اعداد وسائط الاختيار (RPMI (-) الجلوكوز + B27 + لاكتات).
    1. تتوازن الملحق B27 والمتوسطة القاعدية (RPMI 1640 (-) الجلوكوز) إلى RT. تاكد من ان الملحق قد ذاب تماما. مزيج 490 mL من المتوسطة القاعدية و 10 مل من الملحق 50x ، أضافه 4 اللاكتات الصوديوم التي تشكلت في المياه المعقمة ، وتصفيه باستخدام فلتر فراغ يحركها 0.22 μm. يخزن عند درجه حرارة 4 درجات مئوية وتتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  5. اعداد RPMI 20.
    1. تتوازن المتوسطة القاعدية (RPMI 1640) إلى RT. مزيج مصل الأبقار الجنيني (التركيز النهائي 20 ٪) و RPMI. تصفيه باستخدام 0.22 μm فراغ مدفوعة فلتر وتخزين في 4 درجه مئوية. تتوازن إلى RT قبل الاستخدام.
  6. اعداد وسائل الاعلام المرور عن طريق أضافه رو المرتبطة ، ملفوف لفائف التي تحتوي علي البروتين كيناز (روك) المثبط (2 μM التركيز النهائي) لوسائل الاعلام hiPSC.
  7. اعداد D0 وسائل الاعلام عن طريق أضافه GSK-3 مثبطات ، CHIR 99021 إلى RPMI + B27 (-) وسائل الاعلام الانسولين (10 μM النهائي).
  8. اعداد D3 و D4 وسائل الاعلام عن طريق خلط RPMI + B27 (-) وسائل الاعلام الانسولين مع IWR-1 (5 μM النهائي).
    ملاحظه: يتم تشكيل الوسائط D1 و D5 من RPMI + B27 (-) الانسولين. وتتكون وسائل الاعلام من الدالة دال-RPMI + B27.
  9. اعداد حظر العازلة (2 ٪ الزلال المصل البقري [جيش صرب الجمهورية] ، 2 ٪ ، 0.05 ٪ NP-40 في الفوسفات-مخزنه المالحة [التلفزيونية العامة]): في أنبوب مخروطي 50 mL ، أضافه 1 غرام من جيش الصرب البوسني ، 1 مل من ، 49 مل من تلفزيوني ، و 250 μL من NP-40. اخلطه حتى يذوب تماما.

2. اعداد الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESC)-لوحات مصفوفة المغلفة المؤهلة والشفتين

ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات تحت غطاء المحرك الثقافي تعقيم الانسجه.

  1. ذوبان الجليد المؤهلين الحل مصفوفة الأسهم بين عشيه وضحيها علي الثلج في 4 ° c. راجع ورقه مواصفات المنتج لتحديد وحدات التخزين المناسبة لان هذا قد يختلف اعتمادا علي المخزون. تخزين هذه قسامات في-20 درجه مئوية في 1.5 mL أنابيب الطرد المركزي الصغير.
  2. من أجل استخدام مصفوفة لوحات الطلاء أو الزجاج الشفتين ، أولا ذوبان الجليد من المصفوفة المؤهلة hESC في 4 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  3. Aliquot 24 مل من الباردة دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة (DMEM): مزيج المغذيات F-12 (DMEM/F: 12) وسائل الاعلام في أنبوب مخروطي 50 mL.
  4. اخلط الوسائط الباردة DMEM/F: 12 مع ماصه زجاجيه 2 مل من أجل تهدئه سطح الماصة.
  5. باستخدام نفس الماصة ، تناول ما يقرب من 500 − 700 μL من DMEM/F: 12 الباردة وتخلط مع المصفوفة المؤهلة hESC داخل أنبوب الطرد المركزي نفسه.
  6. مره واحده بشكل صحيح مختلطة ، نقل الحل إلى أنبوب مخروطي 50 mL التي تحتوي علي DMEM الباردة/F: 12 وتخلط مره أخرى.
  7. للوحه 6 القياسية جيدا ، أضافه 1 مل من هذا الخليط لكل بئر. التاكد من ان البئر مغطاه بالبالكامل. اترك الصفائح في RT تحت غطاء النسيج الثقافي لمده 30 دقيقه علي الأقل. إذا رغبت في ذلك ، تخزين في 4 درجه مئوية مباشره بعد الطلاء لمده تصل إلى 1 أسبوع و تتوازن إلى RT لمده 30 دقيقه قبل الاستخدام.
  8. من أجل استخدام لوحات ، ويستنشق المصفوفة واستبدال مع وسائل الاعلام المناسبة. استخدمه فورا.
  9. خزن الشفتين الزجاجيتين في بيئة معقمه (علي سبيل المثال ، داخل غطاء لزراعه الانسجه المعقمة).
  10. قبل طلاء ، ومسح كل كوفيرسليب الفردية مع 70 ٪ الايثانول. مره واحده في كوفيرسليب جافه ، وضعه داخل بئر من 6 لوحه جيده معقمه.
  11. خذ 250 − 300 μL من محلول مصفوفة المؤهل hESC والاستغناء بعناية مباشره علي مركز الزجاج المشبك. ترك الشفتين في RT تحت غطاء النسيج الثقافي لمده 30 دقيقه علي الأقل قبل الاستخدام.

3. اعداد جزيئات صغيره

ملاحظه: أعاده تشكيل جميع الجزيئات الصغيرة والمغيرون Wnt في DMSO ما لم يذكر خلاف ذلك.

  1. اعداد قسامات 10 ملم من 25 μl كل من iwr-1 و chir 99021 وتخزين في-20 درجه مئوية.
  2. أعاده تشكيل 10 ملم قسامات من 50 μl كل من thiazovivin (المانع روك) وتخزين في-20 درجه مئوية.

4. صيانة والمرور من iPSCs

ملاحظه: قم بتنفيذ كافة الخطوات التالية تحت غطاء للثقافة الانسجه المعقمة.

  1. الحفاظ علي iPSCs في القياسية 6 لوحات جيدا وتنفيذ جميع الخطوات في ظل ظروف معقمه. الحفاظ علي الخلايا مع 2 مل من وسائل الاعلام hiPSC لكل بئر. تغيير الوسائط كل يوم. الحفاظ علي الخلايا في 37 درجه مئوية ، 6 ٪ س2، 5 ٪ CO2. مرور الخلايا عندما تكون بين 70 − 80 ٪ متموج.
  2. تتوازن تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + إلى RT.
  3. لبدء عمليه المرور ، أضافه 1 مل من تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 + إلى البئر الذي يحتاج إلى ان يكون العبور. احتضان في RT لمده 7 − 10 دقيقه. تحقق من الخلايا تحت المجهر للتاكد من ان العلاج بالتليفزيون لم ينتج عنه تفكك كامل لطبقه الاحاديه.
  4. أزاله التلفزيونية واستبدال مع 1 مل من وسائل الاعلام passaging. استخدام رافع الخلية لكشط بلطف ورفع الخلايا من سطح البئر.
  5. الانفصال الميكانيكي للخلايا باستخدام ماصه زجاجيه معقمه 2 مل. كرر حتى يتم فصل الخلايا بشكل جيد بالتساوي في مستعمرات صغيره عندما لوحظ تحت المجهر.
  6. مره واحده وقد تم فصل الخلايا بما فيه الكفاية ، أضافه 5 مل من وسائل الاعلام العبور لتقسيم الخلايا 1:6. ضبط مقدار وسائط المرور التي ستتم اضافتها لمطابقه نسبه التقسيم المفضلة.
  7. يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من لوحه مصفوفة المغلفة المؤهلة hESC واستبدال مع 1 مل من وسائل الاعلام المرور لكل بئر. أضف 1 مل من الخلايا المنفصلة لكل بئر.

5. عضله التمايز

  1. استخدام خطوط hiPSC التي هي راسخة (أكثر من 20 الممرات) ويحمل المورفولوجية متجانسة قبل البدء في التمايز القلب.
  2. تاكد من ان iPSCs حوالي 70 − 80% متموج.
  3. غسل الخلايا 1x في التلفزيونية دون Ca2 + و Mg2 +.
  4. أضافه 2 مل من وسائل الاعلام D0 (الخطوة 1.7) لكل بئر ونقل الخلايا مره أخرى إلى الحاضنة.
  5. بعد 24 ساعة ، استبدل مع 3 مل من وسائل الاعلام D1 لكل بئر ل 48 h.
  6. في اليوم الثالث ، استبدل الوسائط ب 2 مل من الوسائط D3 لكل بئر. كرر مع الوسائط D4 في اليوم 4.
  7. في اليوم الخامس ، استبدل الوسائط بثلاثه مل من وسائل الاعلام D5 لكل بئر.
  8. في اليوم 7, استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام السابعةوالثانيةلكل بئر ونقل إلى حاضنه مع 37 درجه مئوية, 5% CO 2, والعادي O2 تركيز. استبدل الوسائط الدالة 7 (RPMI + B27) كل يومين.

6. إجراءات الاختيار والتفكك iPSC-CM

  1. قبل عشره أيام من اجراء القياسات Ca2 + عابر أو اي تحليل وظيفي ، استبدل الوسائط Rpmi + B27 مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار في بئر ل 48 h.
  2. استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار لأخر 48 h.
  3. استبدال وسائل الاعلام مع 2 مل من RPMI + B27 وسائل الاعلام في بئر لمده 24 ساعة.
  4. معطف معيار 6 لوحات جيدا كما هو موضح في القسم 2.
  5. أضافه 1 مل من العقيمة 0.25 ٪ التريبسين مع أدتا لكل بئر. احتضان لوحه في 37 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
  6. باستخدام ماصه 1,000 μL ، الانفصال ميكانيكيا الخلايا بحيث يمكن رؤية خلايا واحده عندما لوحظ تحت المجهر.
  7. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل معقمه وأضافه 2 مل من وسائل الاعلام RPMI 20 لكل بئر. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 800 x g.
  8. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في rpmi + B27 وسائل الاعلام. يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من لوحات واستبدال مع 1 مل من RPMI + B27 وسائل الاعلام.
  9. باستخدام طرف ماصه 1,000 mL ، الانفصال ميكانيكيا بيليه الخلية حتى يظهر الحل متجانسة.
  10. نقل تقريبا 500,000 خلايا إلى كل بئر. نقل إلى حاضنه لمده 24 ساعة.
  11. استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من وسائل الاعلام الاختيار لكل بئر ل 48 h.
  12. استبدال وسائل الاعلام مع 3 مل من RPMI + B27 لكل بئر. الحفاظ علي الخلايا في الوسائط المتعددة الوظائف (RPMI + B2 تغيير الوسائط كل يومين حتى تصبح جاهزه للتحليل الوظيفي.

7. اعداد iPSC-CMs لقياس التدفق الخلوي

  1. مره واحده في الخلايا هي من العمر المطلوب وخضعت لاختيار الأيض (القسم 6) ، وغسل الخلايا مع تلفزيوني دون Ca2 + و Mg2 +.
  2. أضافه 1 مل لكل بئر من التربسين 0.25 ٪ واحتضان لمده 5 − 7 دقيقه في 37 درجه مئوية.
  3. ماصه الخليط 5 − 10x مع تلميح P1000 لجعل الخلايا ، ونقل إلى أنبوب 15 مل يحتوي علي 2 مل من RPMI 20.
  4. تدور الخلايا في 600 x g لمده 5 دقائق.
  5. أضافه 100 μL من محلول التثبيت (4 ٪ PFA) إلى بيليه الخلية. أضافه الحل قطره مع المستمر ، والفورتكينغ لطيف ثم تعيين علي الجليد لمده 15 دقيقه.
  6. أضافه 1.5 mL من تلفزيوني. جمع الخلايا عن طريق طرد ويستنشق supernatant.
  7. لكل تجربه ، وتشمل واحده السيطرة غير ملون لكل حاله التثبيت/تخلل.
  8. أعاده التعليق الخلايا في 500 μL من الحل الحظر (2 ٪ الجيش الصربي البوسني/2 ٪ في الاذاعه التلفزيونية مع 0.1 ٪ NP-40) لمده 30 دقيقه في RT.
  9. دون أزاله الحل حجب ، أضافه الأجسام المضادة الاساسيه MLC2V/MLC2A (5 ملغ/مل) ، واحتضان 45 دقيقه في RT.
  10. غسل مع حجب العازلة. جمع الخلايا عن طريق الطرد والمحلول الطامح.
  11. أضافه الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور 555/488 (1:750) المخفف في المخزن المؤقت لحجب لمده 45 دقيقه في RT أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  12. أضافه 1.5 mL من تلفزيوني. جمع الخلايا عن طريق الطرد والمحلول الطامح.
  13. أعاده التعليق الخلايا في 250 − 300 μL من تلفزيوني. استخدم ماصه P1000 لتصنيف الخلايا.
  14. اعداد أنابيب أسفل الجولة مع 35 μm النايلون شبكه غطاء مصفاه الخلية. قبل الرطب مصفاه الخلية مع 50 μL من تلفزيوني وتعيين أنبوب علي الجليد.
  15. نقل الحل مع الخلايا المصنفة إلى أنابيب أسفل الجولة مع قبعات مصفاه الخلية. السماح للحل الخلية لاستنزاف بشكل طبيعي أو الاستفادة من الجزء السفلي من الأنبوب ضد سطح مستو ، حسب الضرورة ، لضمان الصرف الكامل وجمع الخلايا في الأنبوب. تاكد من وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد في أقرب وقت ممكن.
  16. شطف مصفاه الخلية مع 250 μL من تلفزيوني لاستعاده اي الخلايا المتبقية.
  17. الحفاظ علي الأنابيب علي الجليد وتغطيه مع رقائق ألومنيوم حتى تحليل تدفق الخلوي.

8. طلاء عضلي علي الزجاج الشفتين

ملاحظه: تنفيذ كافة الخطوات في بيئة معقمه.

  1. اعداد الشفتين الزجاجية كما هو موضح في الخطوات 2.10 و 2.11.
  2. وبمجرد اختيار iPSC-CMs وهي من العمر المطلوب ، اتبع الخطوات 6.5 − 6.7 للفصل بين iPSC-CMs.
  3. يستنشق ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في كميه كافيه من rpmi 20 وسائل الاعلام لديها ما يقرب من 300,000 الخلايا في 250 μl.
  4. باستخدام ماصه الزجاج 2 مل ، والانفصال ميكانيكيا بيليه الخلية حتى يظهر الحل متجانسة.
  5. يستنشق المصفوفة المؤهلة hESC من الشفتين.
  6. باستخدام ماصه 1000 μL ، مزيج وسحب 250 μL من الحل من أنبوب مخروطي 15 مل.
  7. ببطء الاستغناء عن 250 μL من الحل علي الشفتين الزجاج ، مع الحرص الزائد لأضافه فقط إلى المنطقة حيث الطبقة المؤهلة hESC الطلاء هو موجود.
  8. نقل بعناية إلى الحاضنة وترك بين عشيه وضحيها ، مع الحرص علي عدم هز أو انتشار الخلايا علي الشفتين. في صباح اليوم التالي ، أضافه بلطف 2 مل من الوسائط الدالة 7 (RPMI + B27) إلى كل بئر مع coverslip. تغيير وسائل الاعلام بعد 24 ساعة وكل يومين بعد ذلك.

9. تحديد الخلايا

  1. تاكد من ان كميه كافيه من التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + معايرتها إلى 4 ° c.
  2. اعداد محلول بارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) المخفف في الاذاعه التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + و تتوازن إلى 4 ° c.
  3. مره واحده iPSC-CMs هي من العمر المناسب ، خضعت للاختيار الأيضي (القسم 6) ، وقد تم مطلي علي الشفتين (القسم 8) ، وغسل الخلايا 3x مع 1 مل من البرد التلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 + لكل بئر.
  4. أضافه 1 مل من البرد 4 ٪ PFA وترك الخلايا في RT تحت غطاء محرك الساعة لمده 15 دقيقه.
  5. غسل الخلايا مع تلفزيونيه الباردة لأزاله PFA الزائدة.
  6. أضافه 2 مل من تلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 + وتخزين في 4 ° c.

10. تلطيخ المناعي

  1. أزاله تلفزيوني من الخلايا الثابتة وأضافه 1 مل من حظر المخزن المؤقت. احتضان لمده 1 ساعة في RT.
  2. أزاله المخزن المؤقت حظر وأضافه الأجسام المضادة الاساسيه (5 ملغ/مل) المخفف في حظر العازلة. احتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
  3. غسل 3x في التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 + لمده 5 دقيقه لكل منهما.
  4. أضافه الأجسام المضادة الثانوية المخفف في حظر المخزن المؤقت 1:1000.
  5. تغطيه لوحه مع رقائق ألومنيوم لحمايتها من الضوء واحتضان لمده 45 دقيقه في RT. الحفاظ علي رقائق ألومنيوم للخطوات التالية.
  6. غسل 3x في التلفزيونية مع Ca2 + و Mg2 +، 5 دقيقه لكل منهما.
  7. أضافه كميه كافيه من الحل DAPI العمل لتغطيه تماما الخلايا واحتضان في RT لمده 10 دقيقه.
  8. غسل العينة جيدا مع الاذاعه مع Ca2 + و Mg2 + لأزاله الزائدة dapi.
  9. اتخاذ الشرائح الزجاجية الجديدة وأضافه قطره من وسائل الاعلام المتصاعدة في الوسط. استخدام القطارة لنشر بالتساوي وسائل الاعلام المتصاعدة. وضع الشفتين مع الخلايا وجها لأسفل علي الشرائح.
    ملاحظه: يمكن تخزين الخلايا لمده 30 يوما إذا كانت محمية من الضوء.

11. تقييم الكالسيوم داخل الخلايا2 + العابرون

  1. مره واحده iPSC-CMs هي علي الأقل 3 أشهر من العمر ، خضعت للاختيار الأيضي (القسم 6) ، وقد تم مطلي علي الشفتين ، وعلاج لهم مع 2 μL من Fura-2 ، AM (التركيز النهائي: 1 μM) واحتضان في 37 درجه مئوية لمده 10 دقيقه.
    ملاحظه: Fura-2 حساسة للضوء. تنفيذ جميع إجراءات التحميل والتجارب في الظلام.
  2. اعداد نظام الحصول علي الكالسيوم والانقباض والتحليل.
    1. السلطة النظام ضمان ان يتم بدء تشغيل مصباح قوس (الشكل 1ب).
    2. مكان الغرفة علي النظام وربط الأنابيب من المضخة إلى مدخل المناسبة ومنافذ والأسلاك الكهربائية من المحفز إلى الغرفة كما هو مبين في الشكل 1ج.
    3. ملء أنبوب ترويه الذي يمتد من خلال سخان المضمنة فلويديك مع 37 درجه مئوية الحل تيرودي الحرارة المسبقة.
    4. ضبط الكاميرا وتاطير ابعاد الفتحة لتقليل مساحة الخلفية.
  3. جبل الزجاج كوفيرسليب مع ipsc-CMs في الغرفة وربط.
  4. أضافه 500 μl من الحل تيرودي مباشره علي راس الزجاج المثبتة بلطف والبدء النبض الغرفة (1.5 mL/min) مع حل تيرودي.
  5. بيس iPSC-CMs مع 1 هرتز التحفيز الميداني باستخدام محفز الكهربائية (10 فولت ، 4 مللي ثانيه).
  6. احتضان iPSC-CMs في الغرفة مع التحفيز لمده لا تقل عن 3 − 5 دقيقه للخلايا لغسل الصبغة Fura-2 والتكيف مع البيئة ويغسل صبغه الفلورسنت.
  7. اضبط نافذه العرض علي المنطقة العلوية اليسرى من الزجاج الزجاجي.
  8. أبدا التسجيل.
  9. بعد تجميع دفق متناسق من القمم من 5 − 10 ، انقر فوق إيقاف مؤقت لإيقاف التسجيل باستمرار.
  10. ضمان عدم تغيير التركيز ولا ابعاد نافذه العرض ، وتحريك مرحله المجهر إلى المنطقة المجاورة ، والتحرك نحو الطرف المعاكس ، واستئناف التسجيل.
  11. كرر الخطوات 11.9 و 11.10 للمسح الضوئي عبر المشبك ، والانتقال في البداية إلى اليسار ، ثم إلى أسفل في التعرج الأزياء لتغطيه منطقه كامل الشفة. هذا يتكون من 80 − 100 قياسات لكل coverslip.
    ملاحظه: تقييد الوقت الإجمالي للقياس إلى 10 دقيقه كعوامل ثانويه تسبب انخفاضا في Ca2 + عابر.
  12. مره واحده يتم الحصول علي Ca2 + العابرين, تحليل البيانات مع البرمجيات تحليل اثار مضان وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

النتائج

البروتوكول الموصوف في الشكل 1(ا ) ولد عضلي نقيه للغاية التي تكتسب النمط الظاهري البطين/البالغين مثل مع الوقت في الثقافة. كما تقييمها تلطيخ المناعي للأذيني والبطين ميوسين التنظيمية سلسله الضوء 2 اشكال الاسويه (MLC2A و MLC2V ، علي التوالي) ، وكانت غالبيه الخلايا المتولدة ?...

Discussion

الخطوات الحاسمة لاستخدام الإنسان iPSC-CMs كنماذج تجريبية هي: 1) توليد عضلي عاليه الجودة (CMs) التي يمكن ان تضمن الأداء المتسق ونتائج استنساخه ؛ 2) السماح للخلايا لتنضج في الثقافة لمده لا تقل عن 90 يوما لتقييم ما يكفي من النمط الظاهري ؛ 3) أداء الدراسات الكهربية ، علي سبيل المثال الكالسيوم (Ca2 +) ...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعم هذا البحث من قبل العلماء AHA منحه التنمية 17SDG33700093 (F.S.); جائزه الباحثين في جبل سيناء KL2 للتطوير الوظيفي للبحوث السريرية والانتقالية KL2TR001435 (F.S.) ؛ المعاهد القومية للصحة R00 HL116645 و AHA 18TPA34170460 (سي كي).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouseInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbitInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI nuclear stainThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 wellCorning353046
Fluidic inline heaterLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualified matrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Live cell imaging chamberLive Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse AntibodySynaptic Systems311011
Myocyte calcium and contractility systemIonoptixISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES MembraneThermoFisher124-0045
PBS with Calcium and MagnesiumCorning21-030-CV
PBS without Calcium and MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Sodium L-lactateSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's solutionBoston BioproductsBSS-355wAdjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

References

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 iPSC CMs Ipsc

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved