JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sürekli olarak sağlam insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler üretmek ve işlevlerini karakterize etmek için bir yöntem tanımlamak ve doğrulamak. Bu teknikler sinyal yolları içine mekanistik anlayış geliştirilmesinde yardımcı olabilir, büyük ölçekli ilaç tarama için bir platform sağlamak, ve güvenilir model kalp hastalıkları.

Özet

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) kalsiyum temel bilim (Ca2 +) işleme ve sinyal yollarının yanı sıra yüksek iş gücü ilaç tarama ve toksisite tahlilleri eğitimi için değerli bir insan kaynağı sağlar. Burada, farklı hücre hatlarında moleküler ve işlevsel özellikleri sürekli olarak üretebilen yüksek kaliteli iPSC-CM'ler üretmek için kullanılan metodolojilerin ayrıntılı bir açıklamasını salıyoruz. Ayrıca, Ca2+ işleme özelliklerinin değerlendirilmesi yoluyla işlevsel karakterizasyonlarını güvenilir bir şekilde değerlendirmek için bir yöntem tanımlanır. Düşük oksijen (O2)koşulları, laktat seçimi ve kültürde uzun süreli yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli ventriküler benzeri kardiyomiyositler üretir. İzole yetişkin sıçan kardiyomiyositlerine (ARCM) benzer şekilde, 3 aylık iPSC-CM'ler daha yüksek Ca2+ genlik, daha hızlı Ca2+ geri alım oranı (bozunma-tau) ve 30 gün iPSC-CM'lere göre β-adrenerjik stimülasyona pozitif lusitropik yanıt sergiler. Strateji teknik olarak basit, uygun maliyetli ve tekrarlanabilir. Bu kardiyak hastalığı modellemek için sağlam bir platform sağlar ve büyük ölçekli ilaç tarama hedef Ca2 + işleme proteinleri.

Giriş

İnsan indüklenen pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (iPSC-CMs) in vitro1,2,3,4,5,6,7,8kalp hastalıklarının büyük bir çeşitlilik modellemek için çekici bir insan tabanlı platformvardır. Ayrıca, iPSC-CMs yeni veya mevcut ilaçlara hasta yanıtlarının tahmin için kullanılabilir, vurmak bileşikleri ekrana, ve yeni kişiselleştirilmiş ilaçlar geliştirmek9,10. Ancak, önemli ilerleme rağmen, çeşitli sınırlamalar ve zorluklar iPSC-CMs11kullanırken dikkate alınması gerekir. Sonuç olarak, yöntemleri kardiyak farklılaşma protokolleri geliştirmek için, iPSC-CMs verimliliği ve olgunlaşma geliştirmek için, ve spesifik kardiyomiyosit alt türleri oluşturmak için (ventriküler, atriyal, ve nodal) yoğun olarak incelenmiş ve zaten bu engelleri aşmak için çok sayıda kültür stratejileri yol açtı12,13,14,15.

Bu protokollerin sağlamlığına rağmen, iPSC-CM'lerin kullanımı için önemli bir endişe, aynı performansı ve tekrarlanabilir sonuçları sağlayabilen yüksek kaliteli kardiyomiyositler elde etmek için uzun ve karmaşık prosedürlerin tekrarlanabilirliğidir. Tekrarlanabilirlik sadece farklı genetik arka planlar ile hücre hatları karşılaştırırken değil, aynı zamanda aynı hücre hattının hücresel ve moleküler karşılaştırmalar tekrarlanırken önemlidir. Hücre değişkenliği, örneğin iPSCs yoğunluğundaki iyi-iyi farklılıklar, kardiyak farklılaşmayı etkileyerek düşük verim ve düşük kaliteli kardiyomiyositler üretebilir. Bu hücreler hala saf cm popülasyonu gerektirmeyen deneyler yapmak için kullanılabilir (örneğin, Ca2+ geçici ölçümler icra ederken). Gerçekten de, elektrofizyolojik analiz yaparken, olmayan CM'ler ne kendiliğinden ne de elektriksel stimülasyon altında yenmez, bu nedenle onları analizden dışlamak kolay olacaktır. Ancak, kalitesiz olması nedeniyle, iPSC-CM'ler genetik yapısına bağlı olmayan değiştirilmiş elektrofizyolojik özellikleri (örneğin, düzensiz Ca2+ geçici, düşük Ca2+ genliği) gösterebilirler. Bu nedenle, özellikle kalp hastalığı modellemek için iPSC-CMs kullanırken, hastalık fenotip ile düşük kaliteli CM sonuçları karıştırmak için önemlidir. Elektrofizyolojik çalışmalara devam edilmeden önce dikkatli tarama ve dışlama işlemleri gereklidir.

Bu yöntem, yüksek saflıkta ve yüksek kaliteli kardiyomiyositler üretmek ve kalsiyum ve kontraktillik edinimi ve analiz sistemi kullanarak Ca2+ geçici ölçümler yaparak işlevlerini değerlendirmek için optimize edilmiş protokolleri içerir. Bu teknik, yüksek verimlilik ve düşük verimli iPSC-CM preparatları ayırt etmek ve insan iPSC-CM'lerin fizyolojik olarak daha alakalı bir karakterizasyonu sağlamak için basit, ama güçlü bir yoldur.

Protokol

Bu çalışmada erişkin sıçan kardiyomiyositleri kullanılarak yapılan deneyler, Mount Sinai'deki Icahn Tıp Fakültesi'nin onaylı Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) protokolleri ile gerçekleştirilmiştir. Erişkin sıçan kardiyomiyositler daha önce açıklandığı gibi Langendorff tabanlı yöntem ile Sprague Dawley sıçan kalplerinden izole edildi16.

1. Medyanın Hazırlanması

  1. HiPSC ortamını hazırlayın.
    1. Ek ve bazal orta oda sıcaklığına (RT) dengeleyin. Ek tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak 400 mL bazal orta ve 100 mL ek ve filtreyi karıştırın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  2. RPMI + B27 hazırlayın.
    1. B27 takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640) RT için dengeleyin. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  3. RPMI + B27 (-) insülin hazırlayın.
    1. B27 (-) insülin takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640) RT. Ek tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  4. Seçim ortamı (RPMI (-) glikoz + B27 + laktat) hazırlayın.
    1. B27 takviyesi ve bazal orta (RPMI 1640 (-) glikoz) RT için dengeleyin. Bazal ortamın 490 mL'sini ve 50x takviyesinin 10 mL'ini karıştırın, steril suda oluşan 4 mM sodyum laktat ekleyin ve 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın. 4 °C'de saklayın ve kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  5. RPMI 20'yi hazırlayın.
    1. Bazal orta (RPMI 1640) rt. Mix fetal sığır serumu (FBS) (%20 nihai konsantrasyon) ve RPMI dengeleyin. 0,22 μm vakumlu filtre kullanarak filtre uygulayın ve 4 °C'de saklayın. Kullanmadan önce RT'ye dengeleyin.
  6. HiPSC ortama protein kigaz (ROCK) inhibitörü (2 μM son konsantrasyon) içeren Rho ilişkili, sarmal bobin ekleyerek passaging ortamı hazırlayın.
  7. RPMI + B27 (-) insülin ortama (10 μM son) GSK-3 inhibitörü, CHIR 99021 ekleyerek D0 ortam hazırlayın.
  8. RPMI + B27 (-) insülin ortamını IWR-1 (5 μM final) ile karıştırarak D3 ve D4 ortamını hazırlayın.
    NOT: D1 ve D5 ortamları RPMI + B27 (-) insülinden oluşmuştur. D7 medya RPMI + B27 oluşturmaktadır.
  9. Engelleme tamponu (%2 büyükbaş serum albumin [BSA], %2 FBS, %0,05 NP-40 fosfat tamponlu salin [PBS]): 50 mL konik tüpte 1 g BSA, 1 mL FBS, 49 mL PBS ve 250 μL NP-40 ekleyin. Tamamen eriyene kadar karıştırın.

2. İnsan Embriyonik Kök Hücre (hESC) nitelikli Matris Kaplı Plaka ve Kapaklarıhazırlanması

NOT: Sterilize doku kültürü başlığı altında tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 4 °C'de buz üzerinde bir gecede hESC nitelikli matris stok çözeltisi çözülme. Stoka bağlı olarak değişebileceğinden, uygun aliquot hacimlerini belirlemek için ürün belirtimi sayfasına bakın. Bu aliquotları -20 °C'de 1,5 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın.
  2. Matrisi kaplama plakaları veya cam kapaklar için kullanmak için, önce hESC nitelikli matrisin bir aliquot'u 4 °C'de 30 dk.'da eritin.
  3. Aliquot 24 mL soğuk Dulbecco modifiye Kartal orta (DMEM): besin karışımı F-12 (DMEM/ F:12) medya 50 mL konik tüp içine.
  4. Pipetyüzeyini soğutmak için soğuk DMEM/F:12 ortamını 2 mL cam pipetle karıştırın.
  5. Aynı pipeti kullanarak, yaklaşık 500−700 μL soğuk DMEM/F:12 alın ve mikrosantrifüj tüpünün içindeki hESC nitelikli matris aliquot ile karıştırın.
  6. Düzgün bir şekilde karıştırıldıktan sonra çözeltiyi soğuk DMEM/F:12 içeren 50 mL konik tüpe aktarın ve tekrar karıştırın.
  7. Standart bir 6 iyi plaka için, her kuyuya bu karışımın 1 mL ekleyin. Kuyunun tamamen kapalı olduğundan emin olun. En az 30 dakika için doku kültürü başlık altında RT plakaları bırakın. İstenirse, kaplamadan hemen sonra 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın ve kullanımdan önce 30 dakika boyunca RT'ye dengeleyin.
  8. Plakaları kullanmak için, matris aspire ve uygun ortam ile değiştirin. Hemen kullanın.
  9. Cam kapakları steril bir ortamda saklayın (örn. steril bir doku kültürü başlığı içinde).
  10. Kaplamadan önce, her bir coverslip'i %70 etanol ile silin. Coverslip kuruduktan sonra, steril 6 kuyu plakasının içine yerleştirin.
  11. HESC nitelikli matris çözeltisinin 250−300 μL'sini alın ve dikkatlice doğrudan cam kapak lının ortasına dağıtın. Kullanımdan önce en az 30 dakika boyunca doku kültürü başlık altında RT kapakları bırakın.

3. Küçük Moleküllerin Hazırlanması

NOT: Aksi belirtilmedikçe DMSO'daki tüm küçük molekülleri ve Wnt modülatörlerini yeniden oluşturun.

  1. IWR-1 ve CHIR 99021'in her biri 25°L'lik 10 mM aliquot hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.
  2. 10 mM aliquots 50 μL her Thiazovivin (ROCK inhibitörü) ve -20 °C'de saklayın.

4. IPSC'lerin Bakımı ve Geçişi

NOT: Steril doku kültürü başlığı altında aşağıdaki adımların tümlerini gerçekleştirin.

  1. IPSC'leri standart 6 kuyu plakalarında saklayın ve steril koşullarda tüm adımları gerçekleştirin. Her kuyuda 2 mL hiPSC ortam ile hücreleri koruyun. Medyayı her gün değiştirin. Hücreleri 37 °C, %6 O2,%5 CO2'detutun. Hücreleri %70−80 arasında olduklarında iletin.
  2. PBS'yi Ca2+ ve Mg2+ olmadan RT'ye dengeleyin.
  3. Geçiş işlemini başlatmak için, geçiş yapılması gereken kuyuya Ca2+ ve Mg2+ olmadan 1 mL PBS ekleyin. 7−10 dk. Rt'de kuluçka, PBS tedavisinin monokatmanın tamamen ayrıştırılmasıyla sonuçlanmadığından emin olmak için mikroskop altındaki hücreleri kontrol edin.
  4. PBS'yi çıkarın ve 1 mL'lik geçiş li ortamla değiştirin. Yavaşça kazımak ve kuyunun yüzeyinden hücreleri kaldırmak için bir hücre kaldırıcı kullanın.
  5. Steril 2 mL cam pipet kullanarak hücreleri mekanik olarak ayırın. Hücreler mikroskop altında gözlendiğinde küçük kolonilere eşit olarak ayrıştırılanıncaya kadar tekrarlayın.
  6. Hücreler yeterince ayrıştırıldıktan sonra, hücreleri 1:6 bölmek için 5 mL passaging ortam ekleyin. Tercih edilen bölme oranıyla eşleşecek şekilde eklenecek geçiş ortamı miktarını ayarlayın.
  7. HESC nitelikli matrisi hESC nitelikli matris kaplamalı plakadan aspire edin ve kuyu başına 1 mL passaging ortam ile değiştirin. Kuyu başına 1 mL ayrıştırılmış hücre ekleyin.

5. Kardiyomiyosit Farklılaşması

  1. İyi kurulmuş (20'den fazla pasaj) hiPSC çizgileri kullanın ve kardiyak farklılaşmaya başlamadan önce homojen bir morfoloji sergiler.
  2. IPSC'lerin %70−80 civarında bir aksak olduğundan emin olun.
  3. Hücreleri 1x'i Ca2+ ve Mg2+olmadan PBS'de yıkayın.
  4. Kuyu başına 2 mL D0 ortam (adım 1.7) ekleyin ve hücreleri kuvöze geri aktarın.
  5. 24 saat sonra, 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL D1 ortam ile değiştirin.
  6. 3. günde, ortam yerine her kuyu başına 2 mL D3 ortam değiştirin. 4. günde D4 medya ile tekrarlayın.
  7. 5. günde, her kuyuda 3 mL D5 ortam ile ortam değiştirin.
  8. 7. günde, ortam yerine kuyu başına 3 mL D7 ortam değiştirin ve 37 °C, %5 CO2ve normal O2 konsantrasyonu ile bir kuvöze aktarın. Her 2 günde bir D7 (RPMI + B27) ortamını değiştirin.

6. Seçim Prosedürü ve iPSC-CM Dissociation

  1. Ca2+ geçici ölçümlerini veya herhangi bir fonksiyonel analizi gerçekleştirmeden on gün önce, RPMI + B27 ortamını 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL seçim ortamıyla değiştirin.
  2. 48 saat boyunca ortamı 3 mL seçim ortamıyla değiştirin.
  3. 24 saat boyunca her kuyuda 2 mL RPMI + B27 ortam ile ortam değiştirin.
  4. Bölüm 2'de açıklandığı gibi kat standart 6 kuyu plakaları.
  5. Her kuyuya EDTA ile %0,25 tripsin içeren 1 mL steril ekleyin. Plakayı 37 °C'de 5 dk kuluçkaya yatırın.
  6. 1.000 μL'lik pipet kullanarak, mikroskop altında gözlemlendiğinde tek hücrelerin görülebilmeleri için hücreleri mekanik olarak ayrıştırın.
  7. Hücreleri steril 15 mL konik bir tüpe aktarın ve kuyu başına 2 mL RPMI 20 ortam ekleyin. 800 x g5 dakika santrifüj .
  8. Supernatant aspire ve RPMI + B27 medya hücreleri resuspend. Plakalardan hESC nitelikli matris aspire ve RPMI + B27 medya 1 mL ile değiştirin.
  9. 1.000 mL'lik pipet ucu kullanarak, çözelti homojen görünene kadar hücre peletini mekanik olarak ayrıştırın.
  10. Her kuyuya yaklaşık 500.000 hücre aktarın. 24 saat boyunca kuvöze transfer.
  11. 48 saat boyunca her kuyu başına 3 mL seçim ortamı ile ortamı değiştirin.
  12. Ortamı kuyu başına 3 mL RPMI + B27 ile değiştirin. D7 ortam (RPMI + B2 değişen medya her 2 gün fonksiyonel analiz için hazır olana kadar hücreleri koruyun.

7. Akış Sitometrisi için iPSC-CM'lerin hazırlanması

  1. Hücreler istenilen yaşa geldikten ve metabolik seçimden geçtikten sonra (bölüm 6), Ca2+ ve Mg2+olmadan pbs ile hücreleri yıkayın.
  2. Tripsin kuyusu başına 1 mL %0,25 ve 37 °C'de 5−7 dk inkübte ekleyin.
  3. Pipet karışımı 5−10x p1000 ucu ile hücreleri tekilleştirmek ve RPMI 20 2 mL içeren 15 mL tüp aktarın.
  4. Hücreleri 600 x g'de 5 dk çevirin.
  5. Hücre peletine 100 μL fiksasyon çözeltisi (%4 PFA) ekleyin. Sürekli, nazik girdap ile damla doğru çözelti ekleyin ve sonra 15 dakika buz üzerinde ayarlayın.
  6. 1,5 mL PBS ekleyin. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve supernatant aspire.
  7. Her deneme için, fiksasyon/permeabilizasyon durumu başına bir lekesiz kontrol ekleyin.
  8. RT'de 30 dakika boyunca 500 μL blokaj çözeltisindeki hücreleri (PBS'de %0,1 NP-40 ile %2 FBS/%BSA) yeniden askıya alın.
  9. Bloke çözeltisini çıkarmadan, birincil antikor MLC2V/MLC2A (5 mg/mL) ekleyin ve RT'de 45 dk kuluçkaya yatırın.
  10. Engelleme arabelleği ile yıkayın. Santrifüj ve aspire çözeltisi ile hücreleri toplayın.
  11. İkincil antikor Alexa Fluor 555/488 (1:750) rt veya gece 4 °C 45 dakika için engelleme tampon seyreltilmiş ekleyin.
  12. 1,5 mL PBS ekleyin. Santrifüj ve aspire çözeltisi ile hücreleri toplayın.
  13. PBS'nin 250−300 μL'lik hücrelerini yeniden askıya alın. Hücreleri dağıtmak için p1000 pipet kullanın.
  14. 35 μm naylon kafes hücresüz kapağı ile yuvarlak alt tüpler hazırlayın. Hücre süzgecini 50 μL PBS ile önceden ıslayın ve tüpü buza yerleştirin.
  15. Hücre süzgeci kapakları ile yuvarlak alt tüpleriçin ayrıştırılmış hücreleri ile çözüm aktarın. Hücre çözeltisinin doğal olarak boşalmasına veya tüpün dibine düz bir yüzeye değmesine izin verin, gerektiğinde hücrelerin tam drenajını ve tüpiçine toplanmasını sağlayın. Tüpü mümkün olan en kısa sürede buza geri koyduğundan emin olun.
  16. Kalan hücreleri kurtarmak için hücre süzgecini 250 μL PBS ile durulayın.
  17. Akış sitometri analizi kadar buz ve alüminyum folyo ile kapak tüpleri koruyun.

8. Cam Kapakları üzerine Kaplama Kardiyomiyositler

NOT: Steril bir ortamda tüm adımları gerçekleştirin.

  1. 2.10 ve 2.11 adımlarında açıklandığı gibi cam kapakları hazırlayın.
  2. iPSC-CM'ler seçildikten ve istenilen yaşta olduktan sonra, iPSC-CM'leri ayrıştırmak için 6.5−6.7 adımlarını izleyin.
  3. Supernatant aspire ve RPMI 20 medya yeterli miktarda hücreleri yeniden askıya 250 μL başına yaklaşık 300.000 hücre ye sahip.
  4. 2 mL cam pipet kullanarak, çözelti homojen görünene kadar hücre peletini mekanik olarak ayrıştırın.
  5. Kapaklardan hESC nitelikli matrisi aspire edin.
  6. 1000 μL'lik pipet kullanarak çözeltinin 250 μL'sini 15 mL konik tüpten karıştırın ve çekin.
  7. Çözeltinin 250 μL'sini cam kapaklara yavaşça dağıtın ve sadece hESC'ye uygun matris kaplamanın bulunduğu alana ilave özen tinleyin.
  8. Kuvöze dikkatlice aktarın ve kapaklarda hücreleri sallamamaya veya yaymamaya özen tayarak geceboyunca ayrılın. Ertesi sabah, coverslip ile her kuyuya 2 mL D7 (RPMI + B27) ortam ekleyin. 24 saat sonra ve bundan sonra her 2 gün medya değiştirin.

9. Hücreleri Sabitleme

  1. Ca2+ ve Mg2+ ile yeterli miktarda PBS'nin 4 °C'ye eşit olduğundan emin olun.
  2. PBS'de Ca2+ ve Mg2+ ile seyreltilmiş %4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisi hazırlayın ve 4 °C'ye dengeleyin.
  3. IPSC-CM'ler uygun yaşa geldikten, metabolik seçimden (bölüm 6) geçtikten ve kapak lara (bölüm 8) büründükten sonra, hücreleri 1 mL soğuk PBS ile 1 mL'lik Ca2+ ve Mg2+ kuyu başına yıkayın.
  4. 1 mL soğuk % 4 PFA ekleyin ve 15 dakika için kaputun altında RT hücreleri bırakın.
  5. Aşırı PFA'yı ortadan kaldırmak için hücreleri soğuk PBS ile yıkayın.
  6. Ca2+ ve Mg2+ ile 2 mL PBS ekleyin ve 4 °C'de saklayın.

10. İmmünofluoresan Boyama

  1. PBS'yi sabit hücrelerden çıkarın ve 1 mL engelleme arabelleği ekleyin. RT'de 1 saat kuluçka.
  2. Engelleme tamponu çıkarın ve birincil antikor ekleyin (5 mg /mL) engelleme tampon seyreltilmiş. Gece boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  3. Her biri 5 dakika boyunca Ca2+ ve Mg2+ ile PBS'de 3 x yıkayın.
  4. Tampon 1:1.000 engelleme seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin.
  5. Plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve RT'de 45 dakika boyunca inkübün.
  6. Her biri Ca2+ ve Mg2+ile PBS'de 3x yıkayın.
  7. Hücreleri tamamen kapsayabilmek ve 10 dakika boyunca RT'de kuluçkaya yatmak için yeterli miktarda DAPI çalışma çözeltisi ekleyin.
  8. Fazla DAPI'yi gidermek için ca2+ ve Mg2+ ile numuneyi PBS ile iyice yıkayın.
  9. Yeni cam slaytlar alın ve ortasına bir damla montaj ortamı ekleyin. Montaj ortamını eşit olarak yaymak için damlalık kullanın. Kapakları, hücreler slaytlara yüzüstü koyun.
    NOT: Hücreler ışıktan korunursa 30 gün boyunca saklanabilir.

11. Hücre İçi Ca2+ Geçicilerinin Değerlendirilmesi

  1. IPSC-CM'ler en az 3 aylıkken, metabolik seçilimden (bölüm 6) geçtikten sonra, kapak kapaklarına kaplandıktan sonra, 2 μL Fura-2, (son konsantrasyon: 1 μM) ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    NOT: Fura-2 ışığa duyarlıdır. Karanlıkta tüm yükleme yordamları ve deneyleri gerçekleştirin.
  2. Kalsiyum ve kontraktilite alım ve analiz sistemini hazırlayın.
    1. Yay lambasının başlatılmasını sağlayan sistemi güçlendirin (Şekil 1B).
    2. Odayı sisteme yerleştirin ve pompadaki tüpleri şekil 1C'degösterildiği gibi uyarıcıdan odaya uygun giriş ve çıkışlara ve elektrik kablosuna bağlayın.
    3. Akışkan sıralı ısıtıcıdan geçen perfüzyon tüpünü 37 °C önceden ısıtılmış Tyrode çözeltisi ile doldurun.
    4. Arka plan alanını en aza indirmek için kamerayı ve çerçeve diyafram boyutlarını ayarlayın.
  3. IPSC-CMs ile cam bir kapak yıkın ve odaya bağlayın.
  4. Tyrode'un çözeltisinin 500 μL'ini doğrudan sabitlenmiş cam kapağının üzerine hafifçe ekleyin ve hazneyi (1,5 mL/dk) Tyrode'un çözeltisiyle perfüzyona başlayın.
  5. Hız iPSC-CMs ile 1 Hz alan stimülasyonu elektrik stimülatörü kullanarak (10 V, 4 ms).
  6. Hücreler için en az 3−5 dk uyarım ile odasında iPSC-CMs inkübatma Fura-2 boya yıkamak ve çevreye uyum ve floresan boya yıkamak için.
  7. Görüntüleme penceresini cam kapak kaymasının sol üst alanına ayarlayın.
  8. Kaydetmeye başla.
  9. Tutarlı bir 5−10 tepe akışı topladıktan sonra, kaydı geçici olarak durdurmak için Duraklat'ı tıklatın.
  10. Görüntüleme penceresinin ne odağının ne de boyutlarının değiştirilmemesini sağlayarak, mikroskobun sahne aşamasını bitişik alana taşıyın, karşı uca doğru hareket edin ve kayda devam edin.
  11. Coverslip boyunca tatmak için 11.9 ve 11.10 adımlarını tekrarlayın, başlangıçta sola doğru hareket, sonra tüm coverslip alanı kapsayacak şekilde bir zig-zag moda aşağı doğru. Bu, kapak başına 80−100 ölçümden oluşur.
    NOT: İkincil faktörler Ca2+ geçici sinde azalmaya neden olduğu için toplam ölçüm süresini 10 dakikaya kadar azaltın.
  12. Ca2+ geçicileri elde ediledikten sonra, verileri üreticinin talimatlarına göre floresan izleme analiz yazılımı ile analiz edin.

Sonuçlar

Şekil 1 A'da açıklanan protokol, kültürde zamanla ventrikül/yetişkin benzeri fenotip elde eden son derece saf kardiyomiyositler üretmiştir. Atriyal ve ventriküler miyozin düzenleyici ışık zinciri 2 izoform (MLC2A ve MLC2V, sırasıyla) için immünoforesans boyama ile değerlendirildiği gibi, bu protokol tarafından oluşturulan hücrelerin çoğunluğu MLC2A-pozitif gün 30 kardiyak farklılaşma indüksiyonsonra, MLC2V aynı anda çok daha düşük miktarlar...

Tartışmalar

Deneysel modeller olarak insan iPSC-CMs kullanmak için kritik adımlar şunlardır: 1) tutarlı performans ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayabilir yüksek kaliteli kardiyomiyositler (CMs) üreten; 2) hücrelerin en az 90 gün boyunca kültür içinde olgunlaşmasına izin vererek fenotiplerini yeterince değerlendirmek; 3) insan iPSC-CM'lerinin fizyolojik olarak ilgili fonksiyonel karakterizasyonunu sağlamak için kalsiyum (Ca2+) geçici ölçümler gibi elektrofizyolojik çalışmalar yapmak. Yüksek kal...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu araştırma AHA Scientist Development Grant 17SDG33700093 (F.S.) tarafından desteklenmiştir; Mount Sinai KL2 Bilim Adamları Klinik ve Çevirisel Araştırma Kariyer Geliştirme KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 ve AHA 18TPA34170460 (K.K.).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonalSigma AldrichA5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouseInvitrogenA11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbitInvitrogenA21428
B27 SupplementGibco17504-044
B27(-) insulin SupplementGibcoA18956-01
CHIR-99021SelleckchemS2924
DAPI nuclear stainThermoFisherD1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM HepesGibco11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-HookCelltreat229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 wellCorning353046
Fluidic inline heaterLive Cell InstrumentIL-H-10
Fura-2, AMInvitrogenF1221
hESC-qualified matrixCorning354277Matrigel Matrix
hPSC mediaGibcoA33493-01StemFlex Basal Medium
IWR-1Sigma AldrichI0161
Live cell imaging chamberLive Cell InstrumentEC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse AntibodySynaptic Systems311011
Myocyte calcium and contractility systemIonoptixISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)Proteintech10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES MembraneThermoFisher124-0045
PBS with Calcium and MagnesiumCorning21-030-CV
PBS without Calcium and MagensiumCorning21-031-CV
Premium Glass Cover SlipsLab Scientific7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)Gibco11879-020
RPMI medium 1640 (1X)Gibco11875-093
Sodium L-lactateSigma AldrichL7022
StemFlex SupplementGibcoA33492-01
ThiazovivinTocris3845
Trypsin-EDTA (0.25%)ThermoFisher25200056
Tyrode's solutionBoston BioproductsBSS-355wAdjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride

Referanslar

  1. Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955 (2015).
  2. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  3. Davis, R. P., et al. Cardiomyocytes derived from pluripotent stem cells recapitulate electrophysiological characteristics of an overlap syndrome of cardiac sodium channel disease. Circulation. 125 (25), 3079-3091 (2012).
  4. Fatima, A., et al. In vitro modeling of ryanodine receptor 2 dysfunction using human induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 28 (4), 579-592 (2011).
  5. Novak, A., et al. Cardiomyocytes generated from CPVTD307H patients are arrhythmogenic in response to beta-adrenergic stimulation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (3), 468-482 (2012).
  6. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  7. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  8. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. eLife. 6, (2017).
  9. Matsa, E., Burridge, P. W., Wu, J. C. Human stem cells for modeling heart disease and for drug discovery. Science Translational Medicine. 6 (239), (2014).
  10. Mordwinkin, N. M., Lee, A. S., Wu, J. C. Patient-specific stem cells and cardiovascular drug discovery. Journal of the American Medical Association. 310 (19), 2039-2040 (2013).
  11. Youssef, A. A., et al. The Promise and Challenge of Induced Pluripotent Stem Cells for Cardiovascular Applications. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1 (6), 510-523 (2016).
  12. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation: Insight. 3, 12 (2018).
  13. Keung, W., Boheler, K. R., Li, R. A. Developmental cues for the maturation of metabolic, electrophysiological and calcium handling properties of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research, Therapy. 5 (1), 17 (2014).
  14. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e52010 (2014).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  16. Gorski, P. A., et al. Measuring Cardiomyocyte Contractility and Calcium Handling In Vitro. Methods in Molecular Biology. 1816, 93-104 (2018).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells and Development. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/beta-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  19. Patterson, A. J., Zhang, L. Hypoxia and fetal heart development. Current Molecular Medicine. 10 (7), 653-666 (2010).
  20. Correia, C., et al. Combining hypoxia and bioreactor hydrodynamics boosts induced pluripotent stem cell differentiation towards cardiomyocytes. Stem Cell Reviews. 10 (6), 786-801 (2014).
  21. Tohyama, S., et al. Glutamine Oxidation Is Indispensable for Survival of Human Pluripotent Stem Cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Tu, C., Chao, B. S., Wu, J. C. Strategies for Improving the Maturity of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Circulation Research. 123 (5), 512-514 (2018).
  24. Lundy, S. D., Zhu, W. Z., Regnier, M., Laflamme, M. A. Structural and functional maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 22 (14), 1991-2002 (2013).
  25. Hwang, H. S., et al. Comparable calcium handling of human iPSC-derived cardiomyocytes generated by multiple laboratories. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 85, 79-88 (2015).
  26. Scuderi, G. J., Butcher, J. Naturally Engineered Maturation of Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 5, 50 (2017).
  27. Jung, G., et al. Time-dependent evolution of functional vs. remodeling signaling in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes and induced maturation with biomechanical stimulation. FASEB Journal : Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 30 (4), 1464-1479 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 155ind klenen pluripotent k k h cre kaynakl kardiyomiyositler iPSC CMsiPSCskalsiyum ge icikalsiyum kullan mkardiyak hastal k modellemekardiyomiyosit olgunla ma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır