Generación de cardiomiocitos derivados de HiPSC ventricular y preparaciones celulares de alta calidad para la caracterización del manejo del calcio

Resumen

Aquí describimos y validamos un método para generar consistentemente cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos robustos y caracterizar su función. Estas técnicas pueden ayudar a desarrollar información mecanicista sobre las vías de señalización, proporcionar una plataforma para la detección de drogas a gran escala y modelar de forma fiable las enfermedades cardíacas.

Resumen

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) proporcionan una valiosa fuente humana para estudiar la ciencia básica de las vías de manejo y señalización del calcio (Ca^2+),así como los ensayos de toxicidad y detección de fármacos de alto rendimiento. En este documento, proporcionamos una descripción detallada de las metodologías utilizadas para generar iPSC-CP de alta calidad que pueden reproducir consistentemente características moleculares y funcionales a través de diferentes líneas celulares. Además, se describe un método para evaluar de forma fiable su caracterización funcional mediante la evaluación de las propiedades de manipulación de Ca^2+. Las condiciones de bajo oxígeno (O_2),la selección de lactato y el tiempo prolongado en el cultivo producen cardiomiocitos ventriculares de alta pureza y alta calidad. Al igual que los cardiomiocitos adultos aislados de ratas (ARCM), los iPSC-CP de 3 meses de edad presentan una mayor amplitud de Ca^2+, una tasa más rápida de retoma de Ca²⁺ (decay-tau) y una respuesta lusitrópica positiva a la estimulación adrenérgica en comparación con el día 30 iPSC-CP. La estrategia es técnicamente simple, rentable y reproducible. Proporciona una plataforma robusta para modelar enfermedades cardíacas y para el cribado de fármacos a gran escala para apuntar a Ca²⁺ manipulando proteínas.

Introducción

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) son una atractiva plataforma basada en el hombre para modelar una gran variedad de enfermedades cardíacas in vitro^{1,2,3,4,5,6,7,8}. Además, los iPSC-CP se pueden utilizar para la predicción de las respuestas de los pacientes a fármacos novedosos o existentes, para detectar compuestos de éxito, y desarrollar nuevos fármacos personalizados^9,10. Sin embargo, a pesar de los progresos significativos, deben tenerse en cuenta varias limitaciones y desafíos al utilizar iPSC-CP¹¹. En consecuencia, se han estudiado intensamente métodos para mejorar los protocolos de diferenciación cardíaca, para mejorar la eficiencia y maduración de los IPSC-CPM, y para generar subtipos específicos de cardiomiocitos (ventricular, auricular y nodal) y ya han llevado a numerosas estrategias de cultivo para superar estos obstáculos^12,13,14,15.

A pesar de la robustez de estos protocolos, una de las principales preocupaciones para el uso de iPSC-CP es la reproducibilidad de procedimientos largos y complejos para obtener cardiomiocitos de alta calidad que pueden garantizar el mismo rendimiento reproducible y resultados ibles. La reproducibilidad es fundamental no sólo cuando se comparan líneas celulares con diferentes orígenes genéticos, sino también cuando se repiten las comparaciones celulares y moleculares de la misma línea celular. La variabilidad celular, como las diferencias bien a pozos en la densidad de los ISPc, pueden afectar la diferenciación cardíaca, generando un cardiomiocitos de bajo rendimiento y mala calidad. Estas células todavía podrían utilizarse para realizar experimentos que no requieren una población pura de CMs (por ejemplo, al realizar mediciones transitorias de Ca^2+). De hecho, al realizar análisis electrofisiológicos, los no-CMs no golpearán, ni espontáneamente ni bajo estimulación eléctrica, por lo que será fácil excluirlos del análisis. Sin embargo, debido a la mala calidad, iPSC-CP puede mostrar características electrofisiológicas alteradas (por ejemplo, Ca²⁺ irregular transitorio, baja ca²⁺ amplitud) que no se deben a su composición genética. Por lo tanto, especialmente cuando se utilizan iPSC-CM para modelar enfermedades cardíacas, es importante no confundir los resultados de un CM de mala calidad con el fenotipo de la enfermedad. Se requieren procesos cuidadosos de detección y exclusión antes de proceder a estudios electrofisiológicos.

Este método incluye protocolos optimizados para generar cardiomiocitos de alta pureza y alta calidad y para evaluar su función realizando mediciones transitorias de Ca²⁺ utilizando un sistema de adquisición y análisis de calcio y contractilidad. Esta técnica es una forma sencilla, pero potente, de distinguir entre preparaciones iPSC-CM de alta eficiencia y baja eficiencia y proporcionar una caracterización más relevante fisiológicamente de los iPSC-CM humanos.

Protocolo

Los experimentos con cardiomiocitos adultos de ratas en este estudio se llevaron a cabo con protocolos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai. Los cardiomiocitos adultos de ratas fueron aislados de los corazones de rata Sprague Dawley por el método basado en Langendorff como se describió anteriormente¹⁶.

1. Preparación de medios

1. Prepare los medios hiPSC.
   1. Equilibrar el suplemento y la temperatura basal media-ambiente (RT). Asegúrese de que el suplemento se ha desconscongelado por completo. Mezclar 400 ml del medio basal y 100 ml del suplemento y filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
2. Preparar RPMI + B27.
   1. Equilibrar el suplemento B27 y el medio basal (RPMI 1640) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconsado completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x y el filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
3. Preparar la insulina RPMI + B27 (-).
   1. Equilibrar el suplemento de insulina B27 (-) y el medio basal (RPMI 1640) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconshielo completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x y el filtro utilizando un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
4. Preparar medios de selección (RPMI (-) glucosa + B27 + lactato).
   1. Equilibrar el suplemento B27 y el medio basal (RPMI 1640 (-) glucosa) a RT. Asegúrese de que el suplemento se ha desconshielo completamente. Mezclar 490 ml del medio basal y 10 ml del suplemento 50x, añadir 4 mM de lactato sódico constituido en agua estéril y filtrar con un filtro accionado por vacío de 0,22 m. Conservar a 4oC y equilibrar a RT antes de su uso.
5. Prepare RPMI 20.
   1. Equilibrar el medio basal (RPMI 1640) a RT. Mezclar suero bovino fetal (FBS) (20% concentración final) y RPMI. Filtrar con un filtro accionado por vacío de 0,22 m y guardarlo a 4 oC. Equilibrar a RT antes de su uso.
6. Prepare los medios de paso añadiendo inhibidor de la proteína quinasa (ROCK) asociado a Rho a los medios de hiPSC.
7. Preparar los medios D0 añadiendo el inhibidor GSK-3, CHIR 99021 a LOS medios de insulina RPMI + B27 (-) (10 M final).
8. Preparar los medios D3 y D4 mezclando los medios de insulina RPMI + B27 (-) con IWR-1 (5 M final).
   NOTA: Los medios D1 y D5 están constituidos por insulina RPMI + B27 (-). Los medios D7 están constituidos por RPMI + B27.
9. Preparar el tampón de bloqueo (2% albúmina sérica bovina [BSA], 2% FBS, 0.05% NP-40 en solución salina con fosfato tamponada [PBS]): En un tubo cónico de 50 ml, agregue 1 g de BSA, 1 ml de FBS, 49 ml de PBS y 250 l de NP-40. Mezclar hasta que se disuelva por completo.

2. Preparación de células madre embrionarias humanas (hESC) calificadas con placas y cubiertas

NOTA: Realice todos los pasos bajo una capucha de cultivo de tejido esterilizado.

1. Descongelar la solución de matriz calificada por hESC durante la noche sobre hielo a 4 oC. Consulte la hoja de especificaciones del producto para determinar los volúmenes de alícuota apropiados, ya que esto puede variar dependiendo de la existencia. Almacene estas alícuotas a -20 oC en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
2. Para utilizar la matriz para placas de recubrimiento o tapas de vidrio, primero descongelar una alícuota de matriz calificada por hESC a 4 oC durante 30 min.
3. Aliquot 24 mL de medio águila modificado (DMEM) de Dulbecco en frío: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F:12) en un tubo cónico de 50 ml.
4. Mezcle el medio DMEM/F:12 frío con una pipeta de vidrio de 2 ml para enfriar la superficie de la pipeta.
5. Con la misma pipeta, tome aproximadamente 500-700 ml de DMEM/F:12 en frío y mezcle con la alícuota de matriz calificada por hESC dentro del propio tubo de microcentrífuga.
6. Una vez mezclado correctamente, transfiera la solución al tubo cónico de 50 ml que contiene el DMEM/F:12 frío y mezcle de nuevo.
7. Para una placa estándar de 6 pocillos, agregue 1 ml de esta mezcla a cada poca. Asegúrese de que el pozo esté completamente cubierto. Deje las placas en RT debajo de la campana de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos. Si lo desea, conservar a 4 oC inmediatamente después de la chapado durante un máximo de 1 semana y equilibrar a RT durante 30 minutos antes de su uso.
8. Para utilizar las placas, aspirar la matriz y reemplazarla con los medios apropiados. Utilícelo inmediatamente.
9. Almacene los cubreobjetos de vidrio en un ambiente estéril (por ejemplo, dentro de una capucha de cultivo de tejido estéril).
10. Antes de recubrir, limpie cada cubreobjetos individuales con 70% de etanol. Una vez que el cubreobjetos esté seco, colóquelo dentro de un pozo de una placa estéril de 6 pocillos.
11. Tomar 250 a 300 ml de la solución de matriz calificada por hESC y dispensarla cuidadosamente directamente en el centro de la cubierta de vidrio. Deje los cubreobjetos en RT debajo de la capucha de cultivo de tejido durante al menos 30 minutos antes de su uso.

3. Preparación de moléculas pequeñas

NOTA: Reconstituya todas las moléculas pequeñas y moduladores Wnt en DMSO a menos que se indique lo contrario.

1. Preparar alícuotas de 10 mM de 25 ml cada una de IWR-1 y CHIR 99021 y almacenar a -20 oC.
2. Reconstituir 10 mM alícuotas de 50 ml cada una de tiazovivin (inhibidor de LAN) y almacenar a -20 oC.

4. Mantenimiento y Passaging de iPSCs

NOTA: Realice todos los pasos siguientes bajo una capucha de cultivo de tejido estéril.

1. Mantenga los iPSC en 6 placas de pozo estándar y realice todos los pasos en condiciones estériles. Mantenga las células con 2 ml de medios hiPSC por pozo. Cambie los medios cada dos días. Mantenga las células a 37 oC, 6% O_2,5% CO₂. Pasaje de las células cuando están entre 70-80% confluentes.
2. Equilibrar PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺ a RT.
3. Para iniciar el proceso de passaging, agregue 1 mL de PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺ al pozo que necesita ser pasado. Incubar a RT durante 7 x 10 minutos. Compruebe las células debajo del microscopio para asegurarse de que el tratamiento con PBS no ha dado lugar a una disociación completa de la monocapa.
4. Retire PBS y sustitúyalo por 1 ml de medios de paso. Utilice un levantador de células para raspar y levantar suavemente las células de la superficie del pozo.
5. Disociar mecánicamente las células con una pipeta de vidrio estéril de 2 ml. Repita hasta que las células se disocien uniformemente en pequeñas colonias cuando se observen bajo un microscopio.
6. Una vez que las células se han disociado lo suficiente, agregue 5 ml de medios de paso para dividir las celdas 1:6. Ajuste la cantidad de medios de paso que se agregarán para que coincidan con la relación de división preferida.
7. Aspirar la matriz calificada por hESC de la placa recubierta de matriz calificada por hESC y reemplazarla con 1 ml de medios de paso por pocido. Añadir 1 ml de células disociadas por pozo.

5. Diferenciación de cardiomiocitos

1. Utilizar líneas hiPSC bien establecidas (más de 20 pasajes) y exhibir una morfología homogénea antes de iniciar la diferenciación cardíaca.
2. Asegúrese de que los iPSC son alrededor del 70-80% confluente.
3. Lave las células 1x en PBS sin Ca²⁺ y Mg^2+.
4. Agregue 2 ml de medios D0 (paso 1.7) por pozo y transfiera las células de nuevo a la incubadora.
5. Después de 24 h, reemplazar con 3 mL de medios D1 por pozo durante 48 h.
6. En el día 3, reemplace el medio por 2 ml de medios D3 por pozo. Repita con el soporte D4 el día 4.
7. En el día 5, reemplace el medio por 3 ml de medios D5 por pozo.
8. En el día 7, sustituya el medio por 3 ml de medios D7 por poca y transfiera a una incubadora con 37oC, 5%_CO2y concentración normal de_O2. Sustituya el soporte D7 (RPMI + B27) cada 2 días.

6. Procedimiento de selección y disociación iPSC-CM

1. Diez días antes de realizar las mediciones transitorias Ca²⁺ o cualquier análisis funcional, sustituya el soporte RPMI + B27 por 3 ml de soporte de selección por pozo durante 48 h.
2. Sustituya el soporte por 3 ml de soporte de selección por otros 48 h.
3. Sustituya el soporte por 2 ml de RPMI + B27 por pozo durante 24 horas.
4. Capa estándar 6 placas de pozo según se describe en la sección 2.
5. Añadir 1 ml de trippsina estéril 0.25% con EDTA a cada pocto. Incubar la placa a 37oC durante 5 min.
6. Usando una pipeta de 1.000 l, disocia mecánicamente las células para que se puedan ver células individuales cuando se observen bajo un microscopio.
7. Transfiera las células a un tubo cónico estéril de 15 ml y agregue 2 ml de RPMI 20 media por poca. Centrífuga durante 5 min a 800 x g.
8. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en medios RPMI + B27. Aspirar la matriz calificada por hESC de las placas y reemplazar con 1 mL de medios RPMI + B27.
9. Usando una punta de pipeta de 1.000 ml, disocia mecánicamente el pellet celular hasta que la solución parezca homogénea.
10. Transfiera aproximadamente 500.000 células a cada pozo. Traslado a incubadora durante 24 h.
11. Sustituya el soporte por 3 ml de soporte de selección por pozo durante 48 h.
12. Sustituya el soporte por 3 ml de RPMI + B27 por pozo. Mantenga las celdas en medios D7 (RPMI + B2 cambiando el medio cada 2 días hasta que estén listos para el análisis funcional.

7. Preparación de iPSC-CP para la citometría de flujo

1. Una vez que las células son de la edad deseada y han sido sometidas a selección metabólica (sección 6), lave las células con PBS sin Ca²⁺ y Mg²⁺.
2. Añadir 1 mL por pozo de tripsina 0,25% e incubar durante 5 x 7 min a 37 oC.
3. Pipetear la mezcla de 5 a 10x con una punta P1000 para singularizar las células, y transferir a un tubo de 15 ml que contiene 2 ml de RPMI 20.
4. Gire las células a 600 x g durante 5 min.
5. Añadir 100 l de solución de fijación (4% PFA) al pellet celular. Agregue la solución en gota con un vórtice continuo y suave y luego colóquela en hielo durante 15 minutos.
6. Agregue 1,5 mL de PBS. Recoger las células por centrifugación y aspirar el sobrenadante.
7. Para cada experimento, incluya un control sin mancha por condición de fijación/permeabilización.
8. Resuspender las células en 500 sL de solución de bloqueo (2% FBS/2% BSA en PBS con 0.1% NP-40) durante 30 min en RT.
9. Sin extraer la solución de bloqueo, añada el anticuerpo primario MLC2V/MLC2A (5 mg/mlL) e incubar 45 min a RT.
10. Lavar con tampón de bloqueo. Recoger las células por centrifugación y solución de aspiración.
11. Añadir anticuerpo secundario Alexa Fluor 555/488(1:750) diluido en el tampón de bloqueo durante 45 minutos a RT o durante la noche a 4 oC.
12. Agregue 1,5 mL de PBS. Recoger las células por centrifugación y solución de aspiración.
13. Resuspenda las células en 250 a 300 l de PBS. Utilice una pipeta P1000 para desagregar las células.
14. Prepare tubos inferiores redondos con una tapa de colador de celda de malla de nylon de 35 m. Humedezca previamente el colador celular con 50 ml de PBS y ponga el tubo en hielo.
15. Transfiera la solución con las células desagregadas a los tubos inferiores redondos con las tapas del colador de las células. Permita que la solución celular drene naturalmente o toque la parte inferior del tubo contra una superficie plana, según sea necesario, para asegurar el drenaje completo y la recolección de las células en el tubo. Asegúrese de volver a poner el tubo en hielo tan pronto como sea posible.
16. Enjuague el colador de células con 250 ml de PBS para recuperar las células residuales.
17. Mantenga los tubos sobre hielo y cubra con papel de aluminio hasta el análisis de citometría de flujo.

8. Placar cardiomiocitos en Glass Coverslips

NOTA: Realice todos los pasos en un entorno estéril.

1. Prepare los labios de las cubiertas de vidrio como se describe en los pasos 2.10 y 2.11.
2. Una vez que los iPSC-CP se han seleccionado y son de la edad deseada, siga los pasos 6.5-6.7 para disociar los iPSC-CP.
3. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en una cantidad suficiente de RPMI 20 medios para tener aproximadamente 300.000 células por 250 s.
4. Usando una pipeta de vidrio de 2 ml, disocia mecánicamente el pellet celular hasta que la solución parezca homogénea.
5. Aspirar la matriz calificada por hESC desde los labios de las cubiertas.
6. Con una pipeta de 1000 ml, mezcle y extraiga 250 ml de la solución del tubo cónico de 15 ml.
7. Dispensar lentamente los 250 ml de la solución en los revestimientos de vidrio, teniendo especial cuidado de añadir sólo a la zona donde está presente el recubrimiento de matriz calificado por hESC.
8. Transfiera cuidadosamente a la incubadora y deje durante la noche, teniendo cuidado de no agitar o esparcir las células en los labios de las cubiertas. A la mañana siguiente, agregue suavemente 2 ml de medios D7 (RPMI + B27) a cada poca con el cubreobjetos. Cambie el medio después de 24 h y cada 2 días después de eso.

9. Fijación de células

1. Asegúrese de que una cantidad adecuada de PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ se equilibra a 4 oC.
2. Preparar una solución de paraformaldehído (PFA) del 4% diluida en PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ y equilibrar a 4 oC.
3. Una vez que los iPSC-CMs son de edad apropiada, han sido sometidos a selección metabólica (sección 6), y han sido chapados en cubres (sección 8), lavar las células 3x con 1 mL de PBS frío con Ca²⁺ y Mg²⁺ por pozo.
4. Añadir 1 ml de frío 4% PFA y dejar las células en RT debajo de la campana durante 15 min.
5. Lave las células con PBS frío para eliminar el exceso de PFA.
6. Añadir 2 mL de PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ y almacenar a 4 oC.

10. Mancha de inmunofluorescencia

1. Quite el PBS de las células fijas y agregue 1 mL del buffer de bloqueo. Incubar durante 1 h a RT.
2. Retire el tampón de bloqueo y añada el anticuerpo primario (5 mg/ml) diluido en el tampón de bloqueo. Incubar durante la noche a 4oC.
3. Lavar 3 x en PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ durante 5 min cada uno.
4. Añadir anticuerpo secundario diluido en el tampón de bloqueo 1:1.000.
5. Cubra la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz e incubar durante 45 minutos en RT. Mantenga la lámina de aluminio para los siguientes pasos.
6. Lavar 3x en PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺, 5 min cada uno.
7. Agregue una cantidad suficiente de solución de trabajo DAPI para cubrir completamente las células e incubar a RT durante 10 minutos.
8. Lave bien la muestra con PBS con Ca²⁺ y Mg²⁺ para eliminar el exceso de DAPI.
9. Tome nuevos portaobjetos de vidrio y agregue una gota de soporte de montaje en el medio. Utilice el cuentagotas para extender uniformemente el soporte de montaje. Coloque los labios de las cubiertas con las células boca abajo en las diapositivas.
   NOTA: Las celdas se pueden almacenar durante 30 días si están protegidas de la luz.

11. Evaluación de los transitorios Intracellular Ca²⁺

1. Una vez que los iPSC-CMtengan al menos 3 meses de edad, hayan sido sometidos a selección metabólica (sección 6), y hayan sido chapados en cubreobjetos, trátenlos con 2 ol de Fura-2, AM (concentración final: 1 m) e incuban a 37 oC durante 10 min.
   NOTA: Fura-2 es sensible a la luz. Realice todos los procedimientos de carga y experimentos en la oscuridad.
2. Preparar el sistema de adquisición y análisis de calcio y contractilidad.
   1. Encienda el sistema asegurándose de que la lámpara de arco está iniciada(Figura 1B).
   2. Coloque la cámara en el sistema y conecte los tubos de la bomba a la entrada y salidas apropiadas y el cable eléctrico del estimulador a la cámara como se muestra en la Figura 1C.
   3. Llene el tubo de perfusión que atraviesa el calentador en línea fluido con la solución de Tyrode precalentada a 37 oC.
   4. Ajuste las dimensiones de apertura de la cámara y el encuadre para minimizar el área de fondo.
3. Monte una cubierta de vidrio con iPSC-CMs en la cámara y fíjela.
4. Agregue 500 ml de la solución de Tyrode directamente encima de la cubierta de vidrio sujetado suavemente y comience a perfumar la cámara (1,5 ml/min) con la solución de Tyrode.
5. Pace iPSC-CMs con estimulación de campo de 1 Hz utilizando el estimulador eléctrico (10 V, 4 ms).
6. Incubar iPSC-CMs en la cámara con estimulación durante al menos 3 x 5 min para que las células laven el tinte Fura-2 y se adapten al medio ambiente y lave el tinte fluorescente.
7. Ajuste la ventana de visualización a la parte superior izquierda del cubreobjetos de vidrio.
8. Comience a grabar.
9. Después de recopilar una secuencia coherente de 5 a 10 picos, haga clic en Pausar para detener temporalmente la grabación.
10. Asegurarse de que ni el enfoque ni las dimensiones de la ventana de visualización se alteren, mueva la etapa del microscopio al área adyacente, moviéndose hacia el extremo opuesto y reanude la grabación.
11. Repita los pasos 11.9 y 11.10 para escanear a través de la cubierta, moviéndose inicialmente a la izquierda, luego hacia abajo de una manera en zig-zag para cubrir toda el área de la cubierta. Esto consiste en 80 a 100 mediciones por cubretapa.
    NOTA: Restringir el tiempo total de medición a 10 min ya que los factores secundarios causan una disminución en Ca²⁺ transitorio.
12. Una vez adquiridos los transitorios Ca^2+, analice los datos con el software de análisis de trazas de fluorescencia de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Resultados

El protocolo descrito en la Figura 1A generó cardiomiocitos altamente puros que adquieren un fenotipo ventricular/adulto con tiempo en cultivo. Según se evalúa mediante la tinción de inmunofluorescencia para las isoformas de la cadena de luz reguladora de miosina auricular y ventricular 2 (MLC2A y MLC2V, respectivamente), la mayoría de las células generadas por este protocolo fueron MLC2A-positivas en el día 30 después de la inducción de la diferenciación cardíaca...

Discusión

Los pasos críticos para utilizar iPSC-CM humanos como modelos experimentales son: 1) generar cardiomiocitos (CM) de alta calidad que pueden garantizar el rendimiento consistente y resultados reproducibles; 2) permitir que las células maduren en cultivo durante al menos 90 días para evaluar adecuadamente su fenotipo; 3) realizar estudios electrofisiológicos, por ejemplo, mediciones transitorias de calcio (Ca^2+),para proporcionar una caracterización funcional fisiológicamente relevante de los iPSC-CP human...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit	Invitrogen	A21428
B27 Supplement	Gibco	17504-044
B27(-) insulin Supplement	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI nuclear stain	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook	Celltreat	229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well	Corning	353046
Fluidic inline heater	Live Cell Instrument	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
hESC-qualified matrix	Corning	354277	Matrigel Matrix
hPSC media	Gibco	A33493-01	StemFlex Basal Medium
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody	Synaptic Systems	311011
Myocyte calcium and contractility system	Ionoptix	ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane	ThermoFisher	124-0045
PBS with Calcium and Magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium	Corning	21-031-CV
Premium Glass Cover Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex Supplement	Gibco	A33492-01
Thiazovivin	Tocris	3845
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Tyrode's solution	Boston Bioproducts	BSS-355w	Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride