カルシウム処理特性評価のための心室様HiPSC由来心筋細胞と高品質細胞製剤の生成

要約

ここでは、堅牢なヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞を一貫して生成し、その機能を特徴付ける方法を記述し、検証する。これらの技術は、シグナル伝達経路に対する機械的洞察を開発するのに役立ち、大規模な薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供し、心臓疾患を確実にモデル化する。

要約

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、カルシウム^(Ca2+)の取り扱いとシグナル伝達経路の基礎科学、ならびに高スループット薬物スクリーニングおよび毒性アッセイを研究するための貴重なヒト源を提供する。ここでは、異なる細胞株間で分子的および機能的特性を一貫して再現できる高品質なiPSC-CMを生成するために使用される方法論について詳しく説明する。さらに^、Ca2+処理特性の評価を通じて、その機能特性を確実に評価する方法について説明する。低酸素_(O2)条件、乳酸選択、培養時間の延長は、高純度で高品質な心室様心筋細胞を産生する。孤立した成人ラット心筋細胞(ARCM)と同様に、3ヶ月齢のiPSC-CMは、より高い^Ca2+振幅^、Ca2+再取り込み(減衰タウ)の速い速度、および30日目のiPSC-CMと比較してβアドレナリン刺激に対する陽性の潤滑反応を示す。この戦略は、技術的にシンプルで費用対効果が高く、再現可能です。それは心疾患をモデル化し、Ca²⁺処理タンパク質を標的とする大規模な薬物スクリーニングのための強いプラットホームを提供する。

概要

ヒト誘導性多能性幹細胞由来心筋細胞(iPSC-CM)は、インビトロ^{1、2、3、4、5、6、7、7、8}で多種多様な心疾患をモデル化する魅力的なヒトベースのプラットフォームである。さらに、iPSC-CMは、新規または既存の薬剤に対する患者応答の予測、ヒット化合物のスクリーニング、および新しいパーソナライズされた薬剤^9、10の開発に使用することができる。ただし、大幅な進歩にもかかわらず、iPSC-CM¹¹を使用する場合は、いくつかの制限と課題を考慮する必要があります。その結果、心臓分化プロトコルを改善し、iPSC-CMの効率および成熟を高め、および特定の心筋細胞サブタイプ(心室、心房、および節点)を生成する方法は、強く研究され、すでにこれらのハードル^を克服するための多数の培養戦略に^{つながっている。}

これらのプロトコルの堅牢性にもかかわらず、iPSC-CMの使用に関する主な懸念事項は、同じ性能と再現性を確保できる高品質の心筋細胞を得るための長くて複雑な手順の再現性です。再現性は、遺伝的背景の異なる細胞株を比較する場合だけでなく、同じ細胞株の細胞と分子比較を繰り返す場合にも重要です。iPSC密度の十分な違いのような細胞変動は、心臓分化に影響を与え、低収率および低品質の心筋細胞を生成する。これらの細胞は、CMの純粋な集団を必要としない実験を行うためにまだ使用することができ(例えば^、Ca2+過渡測定を行う場合)。確かに、電気生理学的解析を行う場合、非CMは自発的にも電気刺激下でも打たないので、分析から除外するのは簡単です。しかし、品質が悪いため、iPSC-CMは、遺伝的構成によるものではない変化した電気生理学的特性(例えば、不規則な^Ca2+過渡性、低^Ca2+振幅)を示すことができます。したがって、特にiPSC-CMを使用して心疾患をモデル化する場合、品質の悪いCMの結果と疾患表現型を混同しないことが重要です。電気生理学的研究に進む前に、慎重なスクリーニングと除外プロセスが必要です。

この方法には、高純度で高品質な心筋細胞を生成し、カルシウムおよび収縮性取得および分析システムを使用して^Ca2+過渡測定を行うことによってその機能を評価するための最適化されたプロトコルが含まれます。この技術は、高効率と低効率iPSC-CM製剤を区別し、ヒトiPSC-CMのより生理学的に関連する特性を提供する、シンプルでありながら強力な方法です。

プロトコル

本研究では、成人ラット心筋細胞を用いた実験は、シナイ山のイカーン医科大学の認可された動物ケア・利用委員会(IACUC)プロトコルを用いて行われた。成人ラット心筋細胞は、先に説明した^16.ランゲンドルフベースの方法によりスプレイグ・ドーリーラット心臓から単離された。

1. メディアの準備

1. hiPSC メディアを準備します。
   1. サプリメントと基礎培地を室温(RT)に平衡化する。サプリメントが完全に解凍されていることを確認します。.0.22μm真空駆動フィルターを使用して、基礎媒体の400mLとサプリメントとフィルターの100 mLを混合します。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
2. RPMI + B27 を準備します。
   1. B27 サプリメントと基底媒体 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメントの10 mLを混合し、0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルタを行います。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
3. RPMI + B27 (-) インスリンを準備します。
   1. B27 (-) インスリンサプリメントと基底培地 (RPMI 1640) を RT に平衡化します。基底媒体の490 mLと50xサプリメントの10 mLを混合し、0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルタを行います。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
4. 選択媒体(RPMI(-)グルコース+B27+乳酸塩を準備する)
   1. B27 サプリメントと基底媒体 (RPMI 1640 (-) グルコース) を RT に平衡化します。基底培地の490mLと50xサプリメントの10mLを混合し、滅菌水に含まれる4mM乳酸ナトリウムを加え、0.22μm真空駆動フィルターを用いて濾過する。4°Cで保管し、使用前にRTに平衡化してください。
5. RPMI 20を準備します。
   1. 基底培地(RPMI 1640)をRT.混合胎児ウシ血清(FBS)(20%最終濃度)とRPMIに平衡化する。0.22μm真空駆動フィルターを使用してフィルターをかけ、4°Cで保管してください。使用前に RT に平衡化します。
6. rho-関連するコイルコイルを含む、プロテインキナーゼ(ROCK)阻害剤(2μM最終濃度)をhiPSCメディアに添加して、パセシング媒体を準備します。
7. GSK-3阻害剤、CHIR 99021をRPMI+B27(-)インスリン媒体(10μM最終)に添加してD0媒体を調製する。
8. RPMI + B27 (-) インスリン媒体と IWR-1 (5 μM 最終) を混合して、D3 および D4 メディアを準備します。
   注:D1およびD5媒体はRPMI + B27(-)インスリンから構成される。D7媒体はRPMI+B27で構成される。
9. ブロッキングバッファー(2%ウシ血清アルブミン[BSA]、2%FBS、リン酸緩衝生理食塩水中0.05%NP-40)を準備する:50mL円錐管に、BSA1g、FBSの1mL、PBSの49 mL、およびNP-40の250 μLを加える。完全に溶解するまで混ぜる。

2. ヒト胚性幹細胞(hESC)認定マトリックスコーティングプレートおよびカバースリップの調製

メモ:殺菌された組織培養フードの下ですべての手順を実行します。

1. 4 °Cで氷の上で一晩hESC修飾マトリックスストック溶液を解凍します。在庫によって異なる場合があるため、製品仕様書を参照して適切なアリコート量を確認してください。これらのアリコートは、1.5 mLマイクロ遠心管に-20°Cで保管してください。
2. コーティングプレートまたはガラスカバースリップのマトリックスを使用するために、まずhESC修飾マトリックスのアリコートを4°Cで30分間解凍します。
3. 寒冷ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)のアリコート24 mL:50 mL円錐管に栄養混合F-12(DMEM/F:12)培地。
4. 冷たいDMEM/F:12メディアを2mLガラスピペットと混ぜて、ピペットの表面を冷やします。
5. 同じピペットを使用して、約500−700°Lの冷たいDMEM/F:12を取り出し、マイクロ遠心管自体のhESC修飾マトリックスアリコートと混合する。
6. 適切に混合したら、冷たいDMEM/F:12を含む50 mL円錐形チューブに溶液を移し、再度混合します。
7. 標準の6ウェルプレートの場合は、この混合物を各ウェルに1mL加えます。井戸が完全に覆われていることを確認します。プレートは、組織培養フードの下のRTに少なくとも30分間放置します。必要に応じて、めっき直後に4°Cで最大1週間保存し、使用前に30分間RTに平衡化してください。
8. プレートを使用するために、マトリックスを吸引し、適切な媒体と交換します。すぐに使用してください。
9. ガラスカバーリップを滅菌環境(例えば、滅菌組織培養フード内)に保管してください。
10. コーティングの前に、個々のカバースリップを70%エタノールで拭いてください。カバースリップが乾いたら、滅菌6ウェルプレートの井戸の中に入れます。
11. hESC認定マトリックス溶液の250-300°Lを取り、慎重にガラスカバースリップの中心に直接分配します。使用前に少なくとも30分間、組織培養フードの下のRTにカバーリップを残します。

3. 低分子の調製

注:特に明記されていない限り、DMSO内のすべての小分子およびWntモジュレーターを再構成します。

1. IWR-1およびCHIR 99021のそれぞれ25°Lの10 mMアリコートを調製し、-20°Cで保存します。
2. チアゾビビン(ROCK阻害剤)のそれぞれ50μLの10mMアリコートを再構成し、-20°Cで保存する。

4. iPSCのメンテナンスとパソエージング

メモ:滅菌組織培養フードの下で、以下のすべての手順を実行します。

1. iPSCを標準の6ウェルプレートに維持し、滅菌条件下ですべてのステップを実行します。ウェルごとに 2 mL の hiPSC メディアを使用してセルを維持します。1 日おきにメディアを変更します。細胞を37°C、6%O2、5%CO2に保ちます。それらが70-80%のコンフルエントの間にあるときに細胞を通過させます。
2. CA²⁺および Mg²⁺を使用せずに PBS を RT に平衡化します。
3. パセパジングプロセスを開始するには、通過する必要があるウェルにCa²⁺とMg²⁺を含まないPBSを1mL加えます。RTで7-10分間インキュベートします。
4. PBSを取り外し、1 mLの受撮メディアに交換します。セルリフターを使用して、井戸の表面から細胞をゆっくりと削り取り、持ち上げます。
5. 滅菌2mLガラスピペットを使用して細胞を機械的に解解禁する。顕微鏡で観察すると、細胞が小さなコロニーに均等に解剖されるまで繰り返します。
6. 細胞が十分に解解けたら、5 mLのパソジングメディアを加えた細胞を1:6に分割します。優先分割比に合わせて、追加する通過媒体の量を調整します。
7. hESC認定マトリックスコーティングプレートからhESC認定マトリックスを吸引し、ウェルあたり1 mLの通過媒体に交換します。ウェルごとに解解剖細胞を1mL加えます。

5. 心筋細胞分化

1. よく確立されたhiPSCライン(20以上の通路)を使用し、心臓分化を開始する前に均質な形態を示します。
2. iPSC が約 70~80% のコンフルエントであることを確認します。
3. Ca²⁺および Mg²⁺を使用せずに PBS で細胞を 1x 洗浄します。
4. ウェルごとに2mLのD0メディア(ステップ1.7)を追加し、細胞をインキュベーターに戻します。
5. 24 時間後、ウェルあたり 3 mL の D1 メディアを 48 時間交換します。
6. 3 日目に、メディアをウェルごとに 2 mL の D3 メディアに交換します。4 日目に D4 メディアを使用して繰り返します。
7. 5 日目に、メディアをウェルごとに 3 mL の D5 メディアに交換します。
8. 7日目に、メディアをウェルあたり3mLのD7メディアに交換し、37°、5%CO2、および通常の_O2濃度でインキュベーターに移します。D7 (RPMI + B27) メディアを 2 日ごとに交換します。

6. 選択手順とiPSC-CM解離

1. Ca²⁺過渡測定または機能解析を実行する 10 日前に、RPMI + B27 メディアをウェルあたり 3 mL の選択メディアに 48 時間交換してください。
2. メディアを3 mLの選択メディアに交換し、別の48時間交換してください。
3. メディアを 24 時間、ウェルごとに 2 mL の RPMI + B27 メディアに交換します。
4. コート標準6ウェルプレートは、セクション2で説明します。
5. EDTAで滅菌0.25%トリプシンをそれぞれウェルに1mL加えます。プレートを37°Cで5分間インキュベートします。
6. 1,000 μL ピペットを使用して、顕微鏡で観察したときに単一の細胞を見ることができるように、細胞を機械的に解解解します。
7. 細胞を滅菌15 mL円錐管に移し、1ウェルあたり2mLのRPMI 20媒体を加えます。800 x gで 5 分間遠心分離機 .
8. 上清を吸引し、RPMI+B27媒体中の細胞を再中断する。プレートからhESC修飾マトリックスを吸引し、RPMI + B27メディアの1 mLで交換します。
9. 1,000 mL ピペットチップを使用して、溶液が均質に見えるまでセルペレットを機械的に解解解除します。
10. 約 500,000 個のセルを各ウェルに転送します。24時間インキュベーターに移す。
11. 48 時間、ウェルごとに 3 mL の選択メディアでメディアを交換します。
12. メディアを 3 mL の RPMI + B27 ウェルに交換します。D7メディアで細胞を維持する(RPMI + B2は機能分析の準備ができるまで2日ごとにメディアを変化させる。

7. フローサイトメトリー用iPSC-CMの調製

1. 細胞が所望の年齢であり、代謝選択を受けたら(セクション6)、Ca2+および^Mg2+なしでPBSで細胞^を洗浄する。
2. トリプシン0.25%のウェルあたり1 mLを追加し、37°Cで5−7分間インキュベートします。
3. P1000チップを用いて混合物を5-10xピペットして細胞を単数し、RPMI 20の2mLを含む15 mLチューブに転写する。
4. 細胞を600 x gで5分間回転させます。
5. 100 μL の固定液 (4% PFA) をセルペレットに追加します。連続的で穏やかな渦で溶液をドロップワイズに追加し、15分間氷の上に設定します。
6. 1.5 mL の PBS を追加します。遠心分離によって細胞を収集し、上清を吸引します。
7. すべての実験について、固定/透過条件ごとに1つの未染色制御を含めます。
8. ブロッキング溶液の500°L(PBSでは2%FBS/2%BSA、0.1%NP-40)で細胞をRTで30分間再サスペンドします。
9. ブロッキング溶液を除去することなく、一次抗体MLC2V/MLC2A(5mg/mL)を添加し、RTで45分間インキュベートする。
10. ブロッキングバッファで洗浄します。遠心分離と吸引溶液によって細胞を収集します。
11. 二次抗体Alexa Fluor 555/488(1:750)をRTで45分間、または4°Cで一晩のブロッキングバッファーで希釈して添加します。
12. 1.5 mL の PBS を追加します。遠心分離と吸引溶液によって細胞を収集します。
13. 250-300°LのPBSで細胞を再サスペンドします。P1000ピペットを使用して細胞を分解します。
14. 35μmのナイロンメッシュセルストレーナーキャップで丸底チューブを準備します。50°LのPBSでセルストレーナーを事前に濡らし、チューブを氷の上にセットします。
15. 分解したセルを含む溶液を、セルストレーナーキャップで丸底管に移します。細胞溶液を自然に排出するか、必要に応じて平らな表面に対してチューブの底部をタップして、チューブへの細胞の完全な排水と収集を確保します。チューブはできるだけ早く氷の上に戻してください。
16. 250°LのPBSで細胞ストレーナーをすすいで、残留細胞を回収します。
17. 氷の上のチューブを維持し、フローサイトメトリー分析までアルミニウム箔で覆います。

8. ガラスカバースリップへの心臓筋細胞のめっき

メモ:滅菌環境ですべての手順を実行します。

1. 手順 2.10 および 2.11 の説明に従って、ガラスカバースリップを準備します。
2. iPSC-CM を選択し、希望の年齢になったら、手順 6.5-6.7 に従って iPSC-CM の関連付けを解除します。
3. 上清を吸引し、十分な量のRPMI 20媒体で細胞を再中断し、250μLあたり約30万個の細胞を有する。
4. 2 mLガラスピペットを使用して、溶液が均質に見えるまで細胞ペレットを機械的に解解する。
5. カバーリップからhESC修飾行列を吸引する。
6. 1000 μL ピペットを使用して、15 mL 円錐管から 250 μL の溶液を混合および引き出します。
7. 溶液の250°Lをガラスカバーリップにゆっくりと分配し、hESC認定マトリックスコーティングが存在する領域にのみ追加するように特別な注意を払います。
8. インキュベーターに慎重に転送し、カバースリップ上の細胞を振ったり広げたりしないように注意して、一晩放置します。翌朝、カバースリップを使用して、D7(RPMI + B27)メディアをそれぞれウェルに2mL追加します。24 時間後、その後 2 日ごとにメディアを変更します。

9. セルの固定

1. Ca²⁺および Mg²⁺を含む十分な量の PBS が 4 °C に平衡化されていることを確認します。
2. ^{Ca2+およびMg2+}でPBSで希釈した4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製し、4°Cに平衡化する。
3. iPSC-CMが適切な年齢になったら、代謝選択(セクション6)を受け、カバーリップ(セクション8)にめっきされ^、Ca2+およびMg²⁺ウェルあたり1mLの冷たいPBSで細胞3xを洗浄します。
4. 1 mL のコールド 4% PFA を追加し、フードの下の RT にセルを 15 分間残します。
5. 冷たいPBSで細胞を洗い、余分なPFAを除去します。
6. Ca²⁺と Mg²⁺で PBS を 2 mL 加え、4 °C で保存します。

10. 免疫蛍光染色

1. 固定セルからPBSを取り出し、ブロッキングバッファを1mL追加します。RTで1時間インキュベートします。
2. ブロッキングバッファーを取り除き、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体(5mg/mL)を加えます。4°Cで一晩インキュベートする。
3. CA²⁺と Mg²⁺を使用して PBS で 3x をそれぞれ 5 分間洗浄します。
4. ブロッキングバッファー1:1,000で希釈した二次抗体を添加する。
5. プレートをアルミホイルで覆い、光から保護し、RTで45分間インキュベートします。
6. Ca²⁺と Mg²⁺を使用して PBS で 3x を洗浄し、それぞれ 5 分ずつ洗浄します。
7. 十分な量のDAPI作業ソリューションを追加して細胞を完全に覆い、RTで10分間インキュベートします。
8. Ca²⁺および Mg²⁺を使用して PBS でサンプルを十分に洗浄し、余分な DAPI を除去します。
9. 新しいガラススライドを取り、中央に取り付けメディアのドロップを追加します。スポイトを使用して、取り付けメディアを均等に広げます。セルを下向きにしたカバースリップをスライドに置きます。
   注:光から保護されている場合、セルは30日間保存することができます。

11. 細胞内^Ca2+過渡の評価

1. iPSC-CMが少なくとも3ヶ月齢になったら、代謝選択(セクション6)を受け、カバーリップにめっきされ、2μLのフラ-2、AM(最終濃度:1μM)で処理し、37°Cで10分間インキュベートします。
   注:Fura-2は光に敏感です。暗闇の中ですべての読み込み手順と実験を実行します。
2. カルシウムおよび収縮性の獲得および分析システムを準備する。
   1. システムに電源を入れるので、アークランプが始発していることを確認します(図1B)。
   2. 図1Cに示すように、システム上にチャンバーを配置し、ポンプから適切な入口およびコンセントと電線を刺激器からチャンバーに接続します。
   3. 流体インラインヒーターを通る灌流管を37°前温タイローデ溶液で充填します。
   4. カメラとフレーミングの絞り寸法を調整して、背景領域を最小限に抑えます。
3. iPSC-CMを入れたガラスカバースリップをチャンバーに取り付け、固定します。
4. 500 μLのタイローデ溶液を、固定ガラスカバースリップの上に直接加え、タイローデの溶液でチャンバー(1.5 mL/分)を浸透させ始めます。
5. 電気刺激装置(10 V、4ミリ秒)を使用して、1 Hz場刺激を使用してiPSC-CMをペースします。
6. 細胞がフラ-2色素を洗浄し、環境に適応し、蛍光色素を洗い流すために、少なくとも3〜5分間刺激を受けてチャンバー内のiPSC-CMをインキュベートします。
7. ガラスカバースリップの左上の領域に表示ウィンドウを調整します。
8. 記録を開始します。
9. 5 ~10 の一貫したピークのストリームを収集したら、[一時停止]をクリックして録画を一時的に停止します。
10. 視野の焦点も寸法も変更されないようにし、顕微鏡のステージを隣接する領域に移動し、反対側の端に向かって移動し、記録を再開します。
11. 手順 11.9 と 11.10 を繰り返してカバースリップをスキャンし、最初は左に移動し、次にジグザグの方法で下方に移動してカバースリップ領域全体をカバーします。これはカバースリップあたり80-100の測定から成っている。
    メモ:二次因子がCa²⁺過渡の減少を引き起こすため、合計測定時間を10分に制限します。
12. Ca²⁺トランジェントを取得したら、製造元の指示に従って蛍光トレース分析ソフトウェアを使用してデータを分析します。

結果

図1に記載されたプロトコルは、培養中の時間とともに心室/成人様表現型を獲得する非常に純粋な心筋細胞を生成した。心房および心室ミオシン調節光鎖2アイソフォーム(MLC2AおよびMLC2Vそれぞれ)に対する免疫蛍光染色によって評価されたように、このプロトコルによって生成された細胞の大部分は、心臓分化の誘導後30日目にMLC2A陽性であったが、MLC2Vは同?...

ディスカッション

ヒトiPSC-CMを実験モデルとして使用するための重要なステップは:1)一貫した性能と再現性の高い結果を保証できる高品質の心筋細胞(CM)を生成する。2)細胞が少なくとも90日間培養中に成熟し、その表現型を十分に評価することを可能にする。3)電気生理学的研究を行い、例えばカルシウム^(Ca2+)過渡測定を行い、ヒトiPSC-CMの生理学的に関連する機能特性を提供する。高品質な心室状iPSC-CM?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody, Mouse monoclonal	Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 goat anti mouse	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 goat anti rabbit	Invitrogen	A21428
B27 Supplement	Gibco	17504-044
B27(-) insulin Supplement	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI nuclear stain	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L- Glutamine + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
Double Ended Cell lifter, Flat blade and J-Hook	Celltreat	229306
Falcon Multiwell Tissue Culture Plate, 6 well	Corning	353046
Fluidic inline heater	Live Cell Instrument	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
hESC-qualified matrix	Corning	354277	Matrigel Matrix
hPSC media	Gibco	A33493-01	StemFlex Basal Medium
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
Live cell imaging chamber	Live Cell Instrument	EC-B25
MLC-2A, Monoclonal Mouse Antibody	Synaptic Systems	311011
Myocyte calcium and contractility system	Ionoptix	ISW-400
Myosin Light Chain 2 Antibody, Rabbit Polyclonal (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Rapid Flow Sterile Disposable Filter units with PES Membrane	ThermoFisher	124-0045
PBS with Calcium and Magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without Calcium and Magensium	Corning	21-031-CV
Premium Glass Cover Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medium 1640 (-) D-glucose (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medium 1640 (1X)	Gibco	11875-093
Sodium L-lactate	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex Supplement	Gibco	A33492-01
Thiazovivin	Tocris	3845
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Tyrode's solution	Boston Bioproducts	BSS-355w	Adjust pH at 7.2. Add 1.2mM Calcium Chloride