استهداف المخدرات إلى اليرقات حمار وحشي الضامة عن طريق حقن Liposomes المحملة بالمخدرات

Summary

هنا ، نصف تركيب الليبوزومات المحملة بالأدوية وحقنها المجهري في سمك حمار وحشي اليرقات لغرض استهداف إيصال الدواء إلى خلايا النسب الضامة.

Abstract

وقد تطورت اليرقات حمار وحشي(Danio rerio)إلى نموذج شعبي للتحقيق في تفاعلات الممرض المضيف ومساهمة الخلايا المناعية الفطرية في الأمراض الالتهابية بسبب نظام المناعة الفطري المحفوظة وظيفيا. كما أنها تستخدم على نطاق واسع لدراسة كيفية تساعد الخلايا المناعية الفطرية في توجيه عمليات النمو. من خلال الاستفادة من الشفافية البصرية وقابلية الوراثة لسمك اليرقان، تركز هذه الدراسات في كثير من الأحيان على أساليب التصوير الحي لتوصيف الكلمة والالعدلات الموسومة بشكل وظيفي داخل الحيوانات السليمة. ونظراً لتغايريتها الوظيفية المتنوعة وأدوارها المتزايدة باستمرار في الإمراض المرضي، فقد حظيت الضامة باهتمام كبير. بالإضافة إلى التلاعب الجيني، تستخدم التدخلات الكيميائية الآن بشكل روتيني للتلاعب ودراسة سلوك الضامة في سمك الحمار الوحشي اليرقات. يقتصر تسليم هذه الأدوية عادة على الاستهداف السلبي للدواء المجاني من خلال الغمر المباشر أو الحقن المجهري. تعتمد هذه الأساليب على افتراض أن أي تغييرات في سلوك الضامة هي نتيجة لتأثير مباشر للدواء على الضامة نفسها ، وليس نتيجة المصب للتأثير المباشر على نوع خلية أخرى. هنا ، نقدم بروتوكولاتنا لاستهداف الأدوية على وجه التحديد لالضهاض حمار وحشي اليرقات عن طريق حقن المواد الفلورية المحملة بالأدوية. نكشف أن poloxamer 188 معدلة المخدرات محملة الدهون الزرقاء الفلورسنت يتم تناولها بسهولة من قبل الضامة، وليس من قبل العدلات. كما نقدم أدلة على أن الأدوية التي يتم تسليمها بهذه الطريقة يمكن أن تؤثر على نشاط الضامة بطريقة تتسق مع آلية عمل الدواء. وستكون هذه التقنية ذات قيمة للباحثين الراغبين في ضمان استهداف الأدوية للضامة وعندما تكون الأدوية سامة للغاية بحيث لا يمكن تسليمها بالطرق التقليدية مثل الغمر.

Introduction

يوفر نظام البلعوم أحادي النواة خط دفاع أول ضد مسببات الأمراض الغازية. يتكون هذا النظام من الخلايا الأحادية والخلايا التشجرات المشتقة من الأحادية والضامة ، والتي تقوم بنشاط ببلع مسببات الأمراض الأجنبية ، وبالتالي الحد من انتشار مسببات الأمراض. بالإضافة إلى هذه وظائف المنفطي ة وmicrobicidal effector ، والخلايا التشجرة والضامة هي أيضا قادرة على إنتاج السيتوكين ومستضد العرض لتنشيط نظام المناعة التكيفي^1. من هذه الخلايا ، تلقت الضامة اهتمامًا خاصًا نظرًا لتغايريتها الوظيفية المتنوعة ومشاركتها في أمراض التهابية متعددة ، من المناعة الذاتية والأمراض المعدية إلى السرطان^2،3،^4،5،6. إن لدونة الضامة وقدرتها على التكيف وظيفياً مع الاحتياجات إلى بيئة الأنسجة الخاصة بها تتطلب اتباع نهج تجريبية لمراقبة هذه الخلايا واستجوابها مباشرة في الجسم الحي.

حمار وحشي اليرقات هي كائن مثالي نموذجي لدراسة وظيفة واللدونة من الضامة في الجسم الحي^8. توفر الشفافية البصرية لسمك الحمار الوحشي اليرقاني نافذة لمراقبة سلوك الضامة مباشرة ، خاصة عندما تقترن بخطوط المراسل المعدلة وراثياً التي تميز الضامة. وقد أدى استغلال إمكانات التصوير الحي وtractability التجريبية من حمار وحشي اليرقات إلى العديد من الأفكار الهامة في وظيفة الضامة التي لها صلة مباشرة بمرض الإنسان^{9،10،11،12،13،14،15.} وقد استفادت العديد من هذه الدراسات أيضا من الحفاظ على ارتفاع نشاط المخدرات في حمار وحشي (السمة التي تدعم استخدامها كمنصة اكتشاف المخدرات الحيوانية كله^16،17،18)، من خلال استخدام التدخلات الكيميائية للتلاعب الدوائي وظيفة الضامة. حتى الآن ، تم تسليم هذه العلاجات الدوائية في الغالب إما عن طريق الغمر ، مما يتطلب أن يكون الدواء قابلًا للذوبان في الماء ، أو عن طريق الحقن المجهري المباشر للدواء المجاني(الشكل 1A). وتشمل القيود المفروضة على استراتيجيات التسليم السلبية هذه الآثار غير المستهدفة والسمية العامة التي قد تحول دون تقييم أي تأثير على وظيفة الضامة. بالإضافة إلى ذلك ، عند التحقيق في آثار المخدرات على الضامة ، من غير المعروف ما إذا كانت الأدوية تعمل على الضامة نفسها أو من خلال آليات غير مباشرة. عند إجراء دراسات تدخل كيميائي مماثلة للتحقيق في وظيفة الضامة، أدركنا أن هناك حاجة غير ملباة لتطوير طريقة إيصال غير مكلفة ومباشرة لاستهداف الأدوية على وجه التحديد إلى الضامة.

الليبوزومات هي مجهرية، متوافقة بيولوجيا، الحويصلات ثنائية الطبقات الدهون التي يمكن أن تغلف البروتينات والنيوكليوتيدات والبضائع المخدرات¹⁹. يشكل هيكل أحادي اللاميلار أو متعدد اللاميلار من الدهون ثنائية الطبقة من الليبوزومات تجويفًا داخليًا مائيًا حيث يمكن دمج الأدوية القابلة للذوبان في الماء بينما يمكن دمج الأدوية الكارهة للماء في أغشية الدهون. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن التلاعب بالخصائص الفيزيائية الكيميائية للدهون ، بما في ذلك الحجم والشحن والتعديلات السطحية لتفصيل استهدافها لخلايا محددة^20،21. وقد جعلت هذه الميزات من الليبوزومات لهم وسيلة جذابة لتقديم الأدوية وتعزيز دقة نظم العلاج الحالية^20. كما هي phagocytozed الليبوزومات بطبيعة الحال من قبل الضامة (ميزة استغلالها من قبل استخدامها الروتيني في تقديم كلودروناتي خصيصا لmacrophages لتجارب الاستئصال^22),أنها تقدم كخيار جذاب لتسليم المخدرات الضامة محددة(الشكل 1B).

يصف هذا البروتوكول صياغة الأدوية إلى الليبوزومات الفلورية الزرقاء المغلفة بالبوليمر المائي poloxamer 188 ، التي تشكل طبقة واقية على سطح liposome وقد ثبت أنها تعزز الاحتفاظ بالأدوية ولها توافق حيوي فائق^23. تم اختيار Poloxamer لطلاء سطح الليبوزومات كما أظهرت أبحاثنا السابقة أنه ، بالمقارنة مع الليبوزومات المعدلة من البولي إيثيلين ، أظهرت الليبوزومات المعدلة بولوكعامين توافقًا حيويًا أفضل بعد حقن الكفوف تحت الجلد من الكفوف الفئران والعقاقير المماثلة في الأرانب بعد التسريب الوريدي²³. كما يتم وصف البروتوكولات للحقن المجهري في حمار وحشي اليرقات والتصوير الحي لتقييم قدرتها على استهداف الضامة وتوطينها إلى المقصورات داخل الخلايا اللازمة لتدهور الدهون وإيصال الأدوية السيتوبلازمية. كدليل على مفهوم استخدمنا سابقا هذه التقنية لاستهداف اثنين من الأدوية إلى الضامة لقمع تفعيلها في نموذج حمار وحشي اليرقات من التهاب النقرس الحاد²⁴. هذه التقنية تسليم المخدرات يوسع "مجموعة الأدوات" الكيميائية المتاحة للباحثين حمار وحشي الراغبين في ضمان الضامة المستهدفة من الأدوية ذات الأهمية.

Protocol

1. إعداد المخدرات المحملة مارينا الأزرق المسمى Liposomes

ملاحظة: يتم إعداد الليبوزومات التي تحمل صبغة الفلورسنت الزرقاء، مارينا بلو والمخدرات باستخدام طريقة ترطيب فيلم رقيقة مع إدخال آخر من poloxamer 188. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم ينص على خلاف ذلك. مراقبة الليبوزومات تحمل فقط مارينا الأزرق وبرنامج تلفزيوني. يصف المثال هنا تحميل الليبوزومات بدواء مضاد للأكسدة يستهدف الميتوكوندريا²⁵ يستخدم في النتائج التمثيلية كدليل على المفهوم.

1. لإعداد الليبوزومات، حل 16.4 ملغ (22.2 ميكرومول) من الفوسفوليبيدات 1،2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (انظر جدول المواد)،4.3 ملغ (11.1 ميكرومول) الكوليسترول (انظر جدول المواد)و 2.8 ملغ (3.7 ميكرومول) 1,2-ديسيتريول-sn-glycero-3-phosphocholine (انظر جدول المواد, في 3 مل من الكلوروفورم: الميثانول (3:1 v/v) في قارورة 25 مل في القاع.
2. إلى الخليط أعلاه، إضافة 31 نانومول من مارينا الأزرق 1،2-dihexadecanoyl-sn-glycero-فوسفوإيثانولامين (انظر جدول المواد)و 300 nmol من المخدرات تثبيط mROS (انظر جدول المواد)وسونيكات لفترة وجيزة لتذوب تماما. للسيطرة على الدهون، فقط إضافة مارينا الأزرق 1،2-dihexadecanoyl-sn-غليسيرو-فوسفوإيثانولامين.
   ملاحظة: لتجنب التبييض الضوئي لصبغة الفلورسنت مارينا بلو الحساسة للضوء، قم بحماية جميع الإجراءات من الضوء، حيثما أمكن. وهذا مهم أيضا إذا كان الدواء الذي سيتم تحميله حساسة للضوء.
3. إزالة المذيبات ببطء على المبخر الدوارة (انظر جدول المواد)على حمام الماء درجة الحرارة التي تسيطر عليها تعيين إلى 45 درجة مئوية عن طريق الدوران في 75 دورة في الدقيقة تحت ضغط فراغ (200 مبار لمدة 15 دقيقة ثم 0 مبار لمدة 20 دقيقة). هذا يشكل طبقة الدهون رقيقة جافة داخل الجدران الزجاجية للقارورة التي يتم تجفيفها لمدة 45 دقيقة تحت N₂ لتسهيل الإزالة الكاملة للمذيبات العضوية.
4. بعد تشكيل رقيقة، تعيين الضغط فراغ إلى 40 مبار لمدة 15 دقيقة، ثم تطهير مع غاز النيتروجين لمدة 30 دقيقة لضمان إزالة بقايا المذيبات.
5. هيدرات رقيقة باستخدام 1 مل من الفوسفات العازلة المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) وختم مع البارافيلم قبل تحريك قارورة باستخدام المبخر الدوارة على حمام الماء 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة من أجل تشكيل الحويصلات.
6. تخضع تعليق رطب إلى 7 دورات من التجميد وذوبان عن طريق التجميد في السائل N₂ لمدة 3 دقيقة تليها الغمر في حمام الماء 45 درجة مئوية لمدة 7 دقيقة.
7. تقذف الدهون من خلال غشاء باستخدام الطارد مصغرة (انظر جدول المواد)و 1.0 ميكرومتر المسار المحفور ة أغشية البولي كربونات (انظر جدول المواد)لدورات 2-6 من أجل الحصول على الحويصلات unilamellar كبيرة.
   ملاحظة: من أجل تحقيق استهداف أكثر ملاءمة نحو الضامة ، تلاعب بدورات البثق حتى يبلغ قطر الليبوزومات حوالي 1 ميكرومتر^26،27،28.
8. تكثيف الليبوزومات الطازجة في بيليه عن طريق التضاريس في 186،000 ز واحتضان مع 1 مل من 1٪ poloxamer 188 (انظر جدول المواد)حل (10 ملغ / مل في PBS) في 45 درجة مئوية و 750 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة باستخدام thermomixer مع 2 مل مرفق أنبوب الطرد المركزي الدقيقة (انظر جدول المواد).
9. Ultracentrifuge الخليط في 186،000 ز لمدة 1 ساعة في 4 درجة مئوية وإزالة supernatant من أجل إزالة أي بوليمر غير منضم أو المخدرات. تخزين الكريات الليبوزوبة في 4 درجة مئوية، محمية من الضوء.

2. توصيف حجم Liposome وZeta المحتملة

1. تمييع تركيبة الدهون مع الماء فائق النقاء (1:100) وقياس حجم الجسيمات ومؤشر تعدد التشتت (PDI) وإمكانات زيتا للدهون باستخدام محلل تشتت الضوء الديناميكي (انظر جدول المواد)، في ثلاثية عند 25 درجة مئوية.
   ملاحظة: PDI هو مقياس لتوزيع حجم مجموعة الجسيمات النانوية. تشير قيم PDI < 0.05 إلى توزيع أكثر توحيدًا بينما تشير القيم الأقرب إلى 1 إلى توزيع حجم أكبر. زيتا المحتملة هو الشحنة السطحية الشاملة.

3. حساب كفاءة الفخ وتحميل المخدرات في الليبوزومات

ملاحظة: لتحديد كفاءة الفخ للدواء في الليبوزومات ، يتم قياس محتوى الدواء الموجود في الكريات الخارقة والدهنية.

1. إعادة تعليق بيليه الدهنية في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
2. قم بإزالة الـ supernatant، وتمييع 10 x بالماء فائق النقاء وتحليلها بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC).
3. لتحديد تركيز الدواء داخل الليبوزومات، أضف 100 ميكرولتر من التعليق الدهني إلى 900 ميكرولتر من محلول 10٪ تريتون-X100 (لتدمير غشاء الدهون، وإطلاق الدواء المحاصر ومنع تراكم الدهون داخل عمود HPLC) والدوامة لمدة 3 دقيقة قبل التحليل.
4. حقن 20 ميكرولتر من العينة في نظام HPLC يتكون من مضخة رباعية، وتقويم للنتائج التلقائية وعمود 3 ميكرومتر 250 × 4.6 ملم. تعيين المرحلة المتنقلة (10 mM PBS pH 2.5، الأسيتونتريل والميثانول (30:40:30، v/v/v)) معدل التدفق إلى 0.9 مل/دقيقة والحصول على التشكيلات الطيفية باستخدام كاشف صفيف ثنائي تعيين في 230 mM.
5. حساب كفاءة الفخ (EE) وتحميل الدواء (DL) باستخدام المعادلات التالية:
   EE (٪ = [لي / جبل] × 100
   DL (٪ = [لي / مليب] × 100
   حيث لي هو كتلة من المخدرات مغلفة، جبل هو الكتلة الإجمالية للدواء المستخدمة أثناء صياغة ومليب هو الكتلة الإجمالية للدهون (بما في ذلك الكوليسترول) والدواء مغلفة.

4. إعداد وحقن الليبوزومات

1. إعداد إبر الحقن المجهري borosilicate عن طريق إدراج جدار رقيقة borosilicate الزجاج الشعري (1 ملم O.D. × 0.78 ملم هوي ّة × 10 سم طول) في جهاز السُلّح المجهري (انظر جدول المواد)مع إعدادات السُلّب العام التالي (حرارة 680، سحب 75، سرعة 40، وقت 55 وضغط 530) لإنتاج إبرة حقن مجهرية مدببة.
2. وضع الإبر في طبق بيتري على الطين النمذجة وترتيب بطريقة أن نهاية سحبت لا تلمس الجزء السفلي من الطبق. حافظ على غطاء طبق بيتري مغلقًا لتجنب تلوث الغبار حتى يصبح جاهزًا للاستخدام.
3. تمييع تركيبات الدهون الطازجة 1:1 في PBS المعقم (درجة الحموضة 7.4) والدوامة لفترة وجيزة (2-3 s) لخلط.
   ملاحظة: حماية الليبوزومات من الضوء حتى تصبح اليرقات جاهزة للحقن المجهري.
4. إعداد أزواج تربية حمار وحشي الكبار في الليلة السابقة وجمع الأجنة كما وصفها سابقا روزين وآخرون²⁹.
5. نقل الأجنة إلى طبق بيتري (100 مم × 20 ملم نمط مع ما يقرب من 60 أجنة لكل طبق) تحتوي على E3 المتوسطة (5 MM NaCl، 0.17 mM KCl، 0.33 mM CaCl_2،0.33 mM MgSO₄₎تستكمل مع 0.1٪ الميثيلين الأزرق لمنع النمو الفطري. إزالة جميع الأجنة الميتة أو غير المخصبة واحتضان بين عشية وضحاها في 28.5 درجة مئوية.
6. لتسهيل التصوير الحي، أضف 0.003% N-Phenylthiourea (PTU) إلى وسائط E3 عندما تصل الأجنة إلى 24 ساعة من التطور لمنع تكوين الصباغ (الميلانات).
7. dechorionate يدويا الأجنة في ما يقرب من 30 ساعة بعد الإخصاب (hpf) باستخدام ملقط تلميح غرامة.
   ملاحظة: لا تستخدم العلاج الأنزيمي للأجنة dechorionate لأن هذا يمكن أن يسبب الضرر الظهارية والالتهاب المحلي وبالتالي التأثير على الدراسات المناعية
8. دع الأجنة تتطور عند 28.5 درجة مئوية حتى يومين بعد الإخصاب (dpf).
9. إعداد لوحة حقن عن طريق صب ما يكفي 3٪ السليلوز الميثيل (في وسائل الإعلام E3) في غطاء طبق ثقافة صغيرة 35 ملم لتشكيل فيلم رقيقة تغطي السطح بأكمله.
   ملاحظة: عند إعداد 3٪ من السليلوز الميثيل في وسائل الإعلام E3، فإنه يأخذ عدة أيام لالسليلوز الميثيل لتذوب مع الانفعالات لطيف على شاكر المداري.
10. تهوّن اليرقات عن طريق احتضانها في وسائط E3 المكملة بـ 200 ميكروغرام/مل من التريكين.
11. جمع مجموعة من ما يقرب من 20-25 يرقة باستخدام ماصة نقل البلاستيك والسماح للأجنة للتركيز في غيض من ماصة عن طريق الجاذبية. مع الحرص على نقل اليرقات مع الحد الأدنى من السائل ، ووضعها في منتصف غطاء طبق الثقافة 35 ملم.
12. باستخدام محمل microcapillary ، ترتيب اليرقات بالطرق التالية: الأمامي نحو الجزء العلوي من لوحة الحقن مع السطح الظهري التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري ، لحقن في البطين الخلفي(الشكل 2A -D)؛ أو، الأمامي نحو يسار لوحة الحقن (عند الحقن من اليمين) مع السطح البطني التي تواجه نحو إبرة الحقن المجهري لحقن في الوريد الجيوب الأنفية(الشكل 2I).
    ملاحظة: عند حقن هاتريك بوبهذه الطريقة، يمكن استهداف الضامة في الدماغ الخلفي المقيم(الشكل 2E)والأنسجة الهيماتوبوية (CHT) المقيمة(الشكل 2J)الضامة، على التوالي. منطقة CHT من حمار وحشي اليرقات هي موقع الهيماتوبوية مماثلة للكبد الجنينالثدييات. إيلاء اهتمام إضافي لعدم إتلاف الأجنة أثناء الترتيب لأن هذا قد يسبب التهابموضعي وبالتالي التأثير على الدراسات المناعية.
13. تناول الليبوزومات الطازجة (من الخطوة 4.3) وإعادة ملء إبرة حقن بحوالي 5 ميكرولتر من مزيج الحقن الدهني باستخدام محمل ميكروالخمسيني (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: عند تقييم توطين الليبوزومات إلى مقصورات phagolysosomal من الضامة(الشكل 2H)،وتكملة هذا المزيج حقن مع 200 ميكروغرام/ مل من علامة الفلورسنت الحمراء من phagosomes (انظر جدول المواد)و 100 نانومتر من علامة الفلورسنت الحمراء البعيدة من الليسوسوسوم (انظر جدول المواد)لوضع علامة phagosomes^30،31 وlysosomes³²على التوالي.
14. قم بتركيب الإبرة في متلاعبين (انظر جدول المواد)متصلة بحامل مغناطيسي ومحاقن ضغط (انظر جدول المواد). وضع تحت المجهر الستيريوسكوب وتعيين حاقن إلى مدة نبض ما يقرب من 50 مللي ثانية وضغط حقن من حوالي 40 psi.
15. قطع غيض من إبرة الحقن المجهري مع ملقط تلميح غرامة نظيفة لتوليد فتحة من حوالي 5 ميكرومتر في القطر.
16. معايرة حجم ليتم حقنها عن طريق حقن بولس في قطرة من النفط المعدني المتمركزة على خطوط الشبكة من مقياس الهيوكتومتر. ضبط مدة النبض و / أو ضغط الحقن حتى قطر البولس يغطي 2.5 من أصغر خطوط الشبكة (وهذا يتوافق مع حجم ما يقرب من 1 nL).
17. حقن بعناية 1 nL من مزيج حقن الليبوسوم في البطين الخلفي لكل اليرقات.
    ملاحظة: عند الحقن في البطين الخلفي، والحرص على عدم اختراق البطين بعيدا جدا (وراء الدماغ الخلفي) لأن هذا يمكن أن تعطل الأوعية الدموية الكامنة مما يؤدي إلى نزيف. عند الحقن في الوريد الجيوب الأنفية ، يجب توخي الحذر لضمان أن يكون طرف الإبرة داخل التامور فقط وليس اختراق الصفار.
18. بعد الحقن ، قم على الفور بنقل اليرقات المحقونة مرة أخرى إلى وسائط E3 عن طريق إضافة وسائط E3 إلى لوحة الحقن وتحريك اليرقات بلطف من السليلوز الميثيل باستخدام ماصة نقل البلاستيك.
19. احتضان اليرقات عند 28.5 درجة مئوية (محمية من الضوء) حتى التحليل عن طريق التصوير الملتحم ة الحي.

5. التصوير التكوّر وتحليل الصور لتأكيد استهداف الضامة من الليبوزومات

1. سخني حمامًا مائيًا إلى 50 درجة مئوية.
2. تحقن اليرقات المحقونة بالشحم عن طريق نقلها إلى طبق Perti جديد يحتوي على وسائط E3 مكمّلة بنسبة 0.003% PTU و200 ميكروغرام/مل Tricaine.
3. إعداد التصوير الحي تصاعد المتوسطة عن طريق إذابة 1٪ أغروس نقطة انصهار منخفضة في وسائل الإعلام E3، تستكمل مع PTU 0.003٪، في الميكروويف. ضع في حمام الماء وبمجرد أن يبرد المحلول إلى 50 درجة مئوية ، أضف 200 ميكروغرام / مل من Tricaine.
4. الحفاظ على الوسط المتصاعد في حمام الماء 50 درجة مئوية لمنع البلمرة المبكرة من أغاروز.
5. لتصوير السطح الظهري للدماغ الخلفي على مجهر بؤري مجهز بعدسة غمر مائية(الشكل 2E)، قم بتضمين اليرقات على النحو التالي: ملء طبق ثقافة 35 مم مع الوسط المتصاعد (إلى عمق 5 مم تقريبًا) والسماح له بالبلمرة. حفر خندق صغير في أغاروز التي هي من حجم كاف لاستيعاب كيس صفار.
6. ملء ماصة نقل البلاستيك مع وسط تصاعد المنصهر ، وطرد كمية صغيرة ، واستخدامها لجمع اليرقات المنهوبة. نقل اليرقات على الفور إلى طبق الثقافة وتوجيه الكيس اتصفار، الجانب البطني إلى أسفل، في الثقوب المحفورة، وذلك باستخدام محمل microcapillary. الحفاظ عليها دوريا في هذا الموقف حتى يبلمر agarose. تراكب مع وسائل الإعلام E3 تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل Tricaine.
   ملاحظة: عند نقل اليرقات وتحديد موضعها ، يجب الحرص على عدم التسبب في تلف ظهاري والتهاب موضعي يمكن أن يؤثر على الدراسات المناعية. لتحديد المواقع من اليرقات ليعيش صورة منطقة CHT(الشكل 2J)،جبل كما هو موضح أعلاه، ولكن وضع اليرقات داخل حفرة محفورة بشكل لاحق.
7. عند التصوير على مجهر مقلوب ، قم بتضمين اليرقات ، دون سرير agarose ، مباشرة على الجزء السفلي من طبق قاع زجاجي. ترتيبها سطح الظهرية إلى أسفل (أو بشكل طولي) وبعد البلمرة، وتغطية سطح الطبق بأكمله مع طبقة متساوية من وسط تصاعد. مرة واحدة ببلمرة، إضافة طبقة رقيقة من وسائل الإعلام E3 تستكمل مع 200 ميكروغرام / مل من Tricaine.
8. ليعيش صورة البطين الخلفي على المجهر البؤري، استخدم الإعدادات التالية: 512 × 512 بكسل؛ 40 × 3 ميكرومتر ز مداخن (تمتد من الجزء الخلفي من الظهر من الدماغ الخلفي)؛ هدف 20x؛ 2.5x التكبير.
   ملاحظة: عند مقارنة كثافة الإشارة بين العينات (على سبيل المثال عند تصوير تناول الليبوزومات المسماة بالأزرق مارينا حقنها داخل خطوط المراسل ة التي تشير إما إلى الضامة[Tg1:EGFP)^33]أو العدلات [Tg (lyz:EGFP)^34])،من الضروري أن يتم الاحتفاظ بإعدادات الليزر كما هي (على سبيل المثال، قطر الثقب، والجهد الليزر، والإزاحة وكسب) للمساعدة في ضمان أي اختلافات ليست قطعة أثرية من إعدادات اقتناء الصورة المتغيرة.
9. استخدم برنامج تحليل الصور ثلاثي الأبعاد لقياس الكلمة أو تناول العدلات للدهون المسماة بـ Marina Blue. لتحديد عدد الخلايا التي تحتوي على الليبوزومات(الشكل 2F)داخل كومة Z، قم بالتمرير عبر الأقسام Z الفردية وعد عدد الخلايا الفردية التي تحتوي على الليبوزومات المسماة بـ Marina Blue. لتحديد كثافة الفلورسس من الليبوزومات داخل الخلايا(الشكل 2G)،رسم منطقة اهتمام حول كل خلية (في الأبعاد X و Y و Z) لتحديد إجمالي أو متوسط كثافة الفلورية من داخل الخلايا مارينا الأزرق.

النتائج

نهج الترطيب رقيقة فيلم وصفها هنا لإعداد الليبوزومات الفلورية التي أرفقت المخدرات هو وسيلة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة. مع البروتوكول المستخدم في هذه الدراسة، ومن المتوقع أن تكون الليبوزومات unilamellar^23،24. ويلخص الجدول 1حجم وإمكانية زيتا وتحميل المخد?...

Discussion

هنا، قدمنا بروتوكول مفصل لصياغة الليبوزومات المحملة بالمخدرات لاستهداف الضامة على وجه التحديد في سمك اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتشريح دور الضامة في نماذج معينة من الأمراض عن طريق ضمان التسليم المباشر المستهدف للأدوية على وجه التحديد إلى الضامة. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه عن?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes	GE Healthcare Life Sciences	110610
25 mL round-bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
35 mm culture dish	Thermo Scientific	150460
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector	Agilent Technologies	G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump	Agilent Technologies	G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat	Agilent Technologies	G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles	Warner Instruments	203-776-0664
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Dumont No.5 fine tip forceps	Fine Science Tools	11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip	Eppendorf	5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels	Eppendorf	4053-6038
eyelash manipulator	Ted Pella Inc.	113
hemocytometer	Hawksley	BS.748
HEPES	BDH Chemicals	441474J
HPLC system	Agilent Technologies	1260 series HPLC system
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
low melting point agarose	Invitrogen	16520-100
LysoTracker Deep Red	Invitrogen	L12492	1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red	Thermo Scientific	L12492
magnetic stand	Narishige	GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)	Invitrogen	M12652	Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387-500G
methylene blue	Alfa Aesar	42771
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-500G
micromanipulator	Narishige	M-152
mineral oil	Sigma-Aldrich	M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator	Thermo Scientific	M36008
MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737	Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-10G	Take care when handling, toxic.
NaCl	BDH Chemicals	27810.295
PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)	Corning Inc.	430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column	Phenomenex	00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Thermo Scientific	P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Invitrogen	P35361	Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette	Medi'Ray	RL200C
poloxamer 188	BASF Corporation
pressure injector	Applied Scientific Instruments	MPPI-2
rotary evaporator	Büchi, Flawil, Switzerland	Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope	Olympus	Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	75000090
stereomicroscope	Leica	MZ12
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040-25G	Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Ultrasonic bath	Thermo Scientific	FB-11205
Volocity Image Analysis Software	PerkinElmer	version 6.3
water bath
Zetasizer Nano	Malvern Instruments Ltd	Zetasizer Nano ZS ZEN 3600