JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы описываем синтез нагруженных наркотиками липосом и их микроинъекцию в личинок зебры с целью таргетинга доставки лекарств в клетки макрофаговой.

Аннотация

Зебрафиш (Danio rerio) личинки превратились в популярную модель для исследования принимающих патогенных взаимодействий и вклад врожденных иммунных клеток к воспалительным заболеваниям из-за их функционально сохраненной врожденной иммунной системы. Они также широко используются для изучения того, как врожденные иммунные клетки помогают направлять процессы развития. Воспользовавшись оптической прозрачностью и генетической усвоcargo личинок зебры, эти исследования часто сосредоточены на живых подходов к визуализации, чтобы функционально охарактеризовать флуоресцентно отмеченные макрофаги и нейтрофилы внутри нетронутых животных. Благодаря своей разнообразной функциональной неоднородности и постоянно расширяющейся роли в патогенезах болезней, макрофагу уделяется значительное внимание. В дополнение к генетическим манипуляциям, химические вмешательства в настоящее время регулярно используются для манипулирования и изучения поведения макрофагов у личинок зебры. Доставка этих препаратов, как правило, ограничивается пассивным таргетингом свободных лекарств путем прямого погружения или микроинъекции. Эти подходы опираются на предположение, что любые изменения в поведении макрофагов являются результатом прямого воздействия препарата на сами макрофаги, а не следствием прямого воздействия на другой тип клеток. Здесь мы представляем наши протоколы для ориентации наркотиков специально для личинки зебры макрофагов микроинъекционных наркотиков загруженных флуоресцентных липосом. Мы показываем, что полоксамер 188-модифицированные снижаемые синюю флуоресцентную липосомы легко подхвачены макрофагами, а не нейтрофиловами. Мы также предоставляем доказательства того, что лекарства, поставляемые таким образом, могут влиять на активность макрофагов в соответствии с механизмом действия препарата. Этот метод будет иметь значение для исследователей, желающих обеспечить ориентации наркотиков на макрофаги и когда наркотики слишком токсичны, чтобы быть доставлены традиционными методами, как погружение.

Введение

Моноядерная фагоцитовая система обеспечивает первую линию защиты от вторжения патогенов. Эта система состоит из моноцитов, моноцитов дендритных клеток и макрофагов, которые активно фагоцитируют чужеродные патогены, тем самым ограничивая распространение патогенов. В дополнение к этим функциям фагоцитарного и микробицидного эффектора, дендритные клетки и макрофаги также способны к производству цитокинов и антиген-презентации для активации адаптивной иммунной системы1. Из этих клеток макрофаги получили особое внимание благодаря своей разнообразной функциональной неоднородности и вовлеченности в множественные воспалительные заболевания, от аутоиммунных и инфекционных заболеваний до рака2,3,4,5,7. Пластичность макрофагов и их способность функционально адаптироваться к потребностям их тканей окружающей среды требует экспериментальных подходов непосредственно наблюдать и допрашивать эти клетки in vivo.

Larval зебрафиш являются идеальной моделью организма, с помощью которого для изучения функции и пластичности макрофагов in vivo8. Оптическая прозрачность личиночных зебры обеспечивает окно для непосредственного наблюдения за поведением макрофагов, особенно в сочетании с макрофагой маркировки трансгенных репортер линий. Использование живой потенциал изображения и экспериментальной уступчивости личинки зебры привело к много значительных понимание функции макрофага, которые имеют прямое отношение к болезни человека9,10,11,12,13,14,15. Многие из этих исследований также воспользовались высоким сохранением активности наркотиков у зебры (атрибут, который лежит в основе их использования в целом животных наркотиков открытие платформы16,17,18), используя химические вмешательства для фармакологически манипулировать макрофагов функции. На сегодняшний день эти фармакологические процедуры в основном доставляются либо через погружение, которое требует, чтобы препарат был водорастворимым, либо путем прямой микроинъекции свободного препарата(рисунок 1А). Ограничения этих стратегий пассивной доставки включают всебяи эффекты вне цели и общую токсичность, которые могут исключать оценку любого воздействия на функцию макрофагов. Кроме того, при исследовании воздействия препарата на макрофаги неизвестно, действуют ли препараты на сами макрофаги или через более косвенные механизмы. При выполнении аналогичных исследований химического вмешательства для изучения функции макрофагов, мы признали, что существует неудовлетворенная необходимость разработки недорогого и простого метода доставки для целевых препаратов специально для макрофагов.

Липосомы микроскопические, биосовместимые, липидные двухслойные пузырьки, которые могут инкапсулировать белки, нуклеотиды и лекарственныегрузы 19. Unilamellar или multilamellar липидный двухслойная структура липосом образует водный просвет, где водорастворимые препараты могут быть включены в то время как гидрофобные препараты могут быть интегрированы в липидные мембраны. Кроме того, физико-химические свойства липосом, включая размер, заряд и изменения поверхности, можно манипулировать, чтобы адаптировать их таргетинг к конкретным клеткам20,21. Эти особенности липосомы сделали их привлекательным средством для доставки лекарств и повышения точности текущих схем лечения20. Как липосомы, естественно, phagocytozed макрофагов (функция, используемая их регулярного использования в доставке клодроната специально для макрофагов для абляции экспериментов22), они представляют в качестве привлекательного варианта для макрофага конкретных доставки наркотиков (Рисунок 1B).

Этот протокол описывает формулировку препаратов в синие флуоресцентные липосомы, покрытые гидрофильных полимерных полоксамер 188, который образует защитный слой на поверхности липосомы и было показано, для повышения удержания наркотиков и имеют превосходную биосовместимость23. Poloxamer был выбран для покрытия поверхностного покрытия липосом, как наши предыдущие исследования показали, что, по сравнению с полиэтиленгликоль модифицированных липосом, полоксамер модифицированных липосом показал лучшую биосометность после подкожной инъекции крысиных лап и аналогичных фармакокинетических у кроликов после внутривенного вливания23. Протоколы также описаны для их микроинъекции в личиночных зебры и живой визуализации для оценки их макрофафаг-таргетирования способности и локализации внутриклеточных отсеков, необходимых для липосомного деградации и цитоплазматной доставки наркотиков. В качестве доказательства концепции мы ранее использовали этот метод для целевой два препарата макрофагов для подавления их активации в личинок зебры модель острого подагры воспаление24. Этот метод доставки наркотиков расширяет химический "инструментарий", доступный для исследователей зебры, желающих обеспечить макрофаг-таргетинга своих препаратов, представляющих интерес.

протокол

1. Подготовка наркотиков загружены Марина сине-маркированные липосомы

ПРИМЕЧАНИЕ: Липосомы, несущие синий флуоресцентный краситель, Марина Синий и препарат готовятся с помощью тонкой пленки гидратации метод с пост вставки полоксамера 188. Все процедуры выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Управление липосомы только нести Марина синий и PBS. Пример здесь описывает загрузку липосом с митохондрий-таргетинга антиоксидантный препарат25, который используется в репрезентативных результатов в качестве доказательства концепции.

  1. Для приготовления липосом растворить 16,4 мг (22,2 моль) фосфолипидов 1,2-дипалмитифо-сн-глицеро-3-фосфохолин (см. Таблица материалов),4 чем 3 мг (11,1 мкмоль) холестерина (см. Таблица Материалов)и 2,8 мг (3,7 мкм) 1,2-дисетероил-сн-глицеро-3-фосфохолин (см. Таблицу Материалов, в 3 мл хлороформа: метанол (3:1 v/v) в 25 мл круглого дна колбу.
  2. К вышеупомянутой смеси добавьте 31 нмоль Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (см. Таблица материалов)и 300 нмоль ингибирующего препарата mROS (см. Таблица Материалов)и кратко снотворно растворитесь. Для контроля липосомы, только добавить Марина Синий 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-фосфоэтаноламин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фотоотбеления светочувствительного флуоресцентного красителя Marina Blue, защитите все процедуры от света, где это возможно. Это также важно, если препарат, который будет загружен светочувствительным.
  3. Удалите растворитель медленно на роторный испаритель (см. Таблица материалов) над температурой контролируемой водяной ванны установить до 45 градусов по Цельсию, вращаясь при 75 об/мин под вакуумным давлением (200 мбар в течение 15 минут, то 0 мбар в течение 20 минут). Это образует сухую тонкую липидную пленку в стеклянных стенках колбы, которая далее высушивается в течение 45 мин под N2 для содействия полному удалению органического растворителя.
  4. После образования тонкой пленки установите вакуумное давление до 40 мбар в течение 15 минут, затем очищайте азотным газом в течение 30 минут, чтобы обеспечить удаление растворителя остатков.
  5. Гидрат тонкой пленки с помощью 1 мл фосфат-буферного солей (PBS, рН 7.4) и печать с парафильмом, прежде чем волновать колбу с помощью роторного испарителя более 60 градусов по Цельсию водяной ванны в течение 20 минут, чтобы сформировать пузырьки.
  6. Обутите гидратированную подвеску до 7 циклов замораживания и оттепели, замораживая в жидкости N2 в течение 3 мин с последующим погружением в водяную ванну 45 градусов по Цельсию в течение 7 мин.
  7. Экструдировать липосомы через мембрану с помощью мини-экструдера (см. Таблица Материалов)и 1,0 мкм трек травления поликарбонатных мембран (см. Таблица материалов) для того, чтобы получить большие униламеллярные пузырьки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения более благоприятного ориентации на макрофаги, манипулировать циклами экструзии, пока диаметр липосом составляет примерно 1 мкм26,27,28.
  8. Конденсировать свежие липосомы в гранулы при ультрацентрифугации при 186000 х г и инкубировать с 1 мл 1% полоксамер 188 (см. Таблица материалов) решение (10 мг/мл в PBS) при 45 c и 750 об/ ч на 30 мин с помощью термомикса с 2 мl микроцентровых материалов( см.
  9. Ultracentrifuge смесь на 186000 х г на 1 ч при 4 c и удалить супернатант для того, чтобы удалить любые несвязанные полимера или наркотиков. Храните гранулы липосомы при 4 градусах Цельсия, защищенные от света.

2. Характеристика липосомного размера и потенциала Зеты

  1. Разбавлять липосомную формулировку ультрачистой водой (1:100) и измерять размер частиц, индекс полидисперсности (PDI) и потенциал зеты липосом с помощью динамического светораспределителя-анализатора (см. Таблица Материалов),в тройном при 25 градусах По Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PDI является мерой распределения размера популяции наночастиц. Значения PDI злт; 0,05 указывают на более равномерное распределение, в то время как значения, приближенные к 1, указывают на большее распределение размера. Потенциал zeta — это общий поверхностный заряд.

3. Расчет эффективности захвата и загрузки наркотиков в липосомах

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения эффективности захвата препарата в липосомы, содержание препарата, содержащегося в супернатант и липосомы гранулы измеряются.

  1. Приостановите липосомомного пеллета в 1 мл PBS.
  2. Удалить супернатант, разбавить 10 х с ультрачистой водой и анализировать с помощью высокопроизводительной жидкой хроматографии (HPLC).
  3. Чтобы определить концентрацию препарата в липосомах, добавьте 100 л липосомного суспензии до 900 л раствора тритона-X100 (чтобы уничтожить липидную мембрану, выпустив заманиваемый препарат и предотвращая накопление липидов в колонне HPLC) и вихрь в течение 3 мин. перед анализом.
  4. Впрысните 20 qL образца в систему HPLC, состоящую из четырехкратного насоса, термостата авто-сэмплер и 3 мкм 250 х 4,6 мм колонки. Установите мобильную фазу (10 мМ PBS pH 2.5, ацетонитрил и метанол (30:40:30, v/v/v)) скорость потока до 0,9 мл/мин и получить спектральные профили с помощью детектора диодного массива, установленного на уровне 230 мМ.
  5. Рассчитайте эффективность захвата (EE) и загрузку лекарств (DL) с помощью следующих уравнений:
    EE (%)
    DL (%)
    Там, где я масса наркотиков инкапсулированы, Mt является общая масса наркотиков, используемых во время разработки и Mlip является общая масса липидов (в том числе холестерина) и инкапсулированных наркотиков.

4. Подготовка и инъекция липосомы

  1. Подготовка borosilicate микроинъекции иглы путем вставки тонкой стены боросиликат стеклянный капилляр (1 мм O.D. х 0,78 мм I.D. х 10 см длины) в micropipette выдвижной устройство (см. Таблица материалов) со следующими общими настройками выдвижной (тепло 680, тянуть 75, скорость 40, время 55 и давление 530) для производства микро-кондиции.
  2. Поместите иглы в чашку Петри на моделирование глины и организовать таким образом, что вытащил конец не касаясь нижней части блюда. Держите крышку чашки Петри закрытой, чтобы избежать загрязнения пыли до готовности к использованию.
  3. Разбавить свежеприготовленные липосомы 1:1 в стерильных PBS (pH 7.4) и кратко вихрь (2-3 s) для смешивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Защитите липосомы от света до тех пор, пока личинки не будут готовы к микроинъекциям.
  4. Настроили взрослых пар размножения зебры накануне вечером и собирать эмбрионы, как ранее описано Розен и др.29.
  5. Перенесите эмбрионы в чашку Петри (100 мм х 20 мм в стиле примерно 60 эмбрионов на блюдо), содержащую e3 средний (5 мМ NaCl, 0,17 мм KCl, 0,33 мм CaCl2, 0,33 мм MgSO4) дополнен0,1% метиленовой синей для сдерживания грибкового роста. Удалить все мертвые или неоплодотворенные эмбрионы и инкубировать ночь при 28,5 градуса цельсия.
  6. Для облегчения живой визуализации, добавить 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) в E3 средств массовой информации, когда эмбрионы достигают 24 ч развития для предотвращения образования пигмента (меланизации).
  7. Вручную dechorionate эмбрионов примерно на 30 ч после оплодотворения (hpf) с помощью тонкой наконечник щипцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте ферментативное лечение для дехорионат эмбрионов, поскольку это может привести к эпителиальному повреждению и локальному воспалению, тем самым влияя на иммунологические исследования
  8. Пусть эмбрионы развиваются при 28,5 градусах Цельсия до 2 дней после оплодотворения (dpf).
  9. Приготовьте пластину для инъекций, залив достаточное количество 3% метилцеллюлозы (в E3 media) в крышку небольшого 35-мм культурного блюда, чтобы сформировать тонкую пленку, покрывающую всю поверхность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При подготовке 3% метилцеллюлозы в E3 СМИ, это занимает несколько дней для метиловой целлюлозы, чтобы раствориться с нежным возбуждением на орбитальной шейкер.
  10. Анестезия личинок путем инкубации в E3 СМИ дополняется 200 мкг /мл трикаина.
  11. Соберите бассейн примерно 20-25 личинок с помощью пластиковой передачи пипетки и позволяют эмбрионам сосредоточиться на кончике пипетки под действием силы тяжести. Заботясь о переносе личинок с минимальной жидкостью, поместите их в середине 35-мм крышки блюда культуры.
  12. Используя микрокапиллярный погрузчик, расположите личинки следующим образом: передняя часть пластины для впрыска с содводной поверхностью, обращенной к игле микроинъекции, впрыскивает в желудочек заднего мозга(рисунок 2A-D); или, передняя к левой части пластины инъекции (при инъекциях справа) с брюшной поверхности лицом к микроинъекционной иглы, чтобы ввести в синус venosus (Рисунок 2I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При введении таким образом, задний желудочек-резидентов(Рисунок 2E) и хвостовой гематопойетической ткани (CHT)-резидентов (Рисунок 2J) макрофаги могут быть направлены, соответственно. Область CHT личинок зебры является гематопоиетическим местом, аналогичным печени плода млекопитающих. Обратите дополнительное внимание, чтобы не повредить эмбрионы при организации, поскольку это может вызвать локальное воспаление, тем самым влияя на иммунологические исследования.
  13. Возьмите свежеприготовленные липосомы (от шага 4.3) и обратно заполните инъекционную иглу примерно 5 злливой смеси инъекций с помощью микрокапиллярного погрузчика (см. Таблица Материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При оценке локализации липосом в фаголизомные отсеки макрофагов(рисунок 2H),дополнить эту смесь инъекций с 200 мкг/мл красного флуоресцентного маркера фагосомы (см. Таблица материалов)и 100 нм далекого красного флуоресцентного маркера лисосомы (см. Таблица материалов)для обозначения фагосомы30,31 и лисосомы32, соответственно.
  14. Смонтируйте иглу в микроманипулятор (см. Таблица Материалов),подключенный к магнитной подставке и инжектору давления (см. Таблица Материалов). Позиция под стереомикроскоп и установить инжектор на пульс продолжительностью около 50 мс и инъекционное давление около 40 пси.
  15. Вырезать кончик микроинъекционной иглы с чистой тонкой наконечникщицы для создания отверстия около 5 мкм в диаметре.
  16. Калибраем объем, который нужно вводить путем введения болуса в каплю минерального масла, расположенного над линиями сетки гемоцитометра. Отрегулируйте продолжительность пульса и/или давление впрыска до тех пор пока диаметр bolus не покрывает 2.5 из самых малых линий решетки (это соответствует к тому приблизительно 1 nL).
  17. Тщательно введите 1 nL липосоминъекции смесь в желудочек заднего мозга каждого личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При инъекциях в желудочек заднего мозга, позаботьтесь, чтобы не проникнуть слишком далеко вентилируемых (за задний мозг), так как это может нарушить основные сосуды, ведущие к кровоизлияниям. При инъекциях в синусовой венос, следует позаботиться о том, чтобы кончик иглы находится только в перикарде и не проникает в желток.
  18. После инъекции, немедленно передать вводили личинки обратно в E3 сми, добавив E3 средств массовой информации для инъекции пластины и осторожно агитации личинок из метиловой целлюлозы с помощью пластиковой передачи пипетки.
  19. Инкубировать личинки при 28,5 градусах Цельсия (защищены от света) до анализа живой конфокальной визуализации.

5. Конфокальные изображения и анализ изображений для подтверждения макрофаг ориентации липосомы

  1. Нагрейте водяную ванну до 50 градусов по Цельсию.
  2. Анестезия липосомы впрыскиваемых липосом личинок, передавая на новую тарелку Перти, содержащую E3 СМИ дополняется 0,003% PTU и 200 мкг /мл трикаин.
  3. Подготовка живой визуализации монтажа среды путем растворения 1% низкой точки плавления агарозы в E3 средств массовой информации, дополненный 0,003% PTU, в микроволновой печи. Поместите в водяную ванну и как только раствор остынет до 50 градусов по Цельсию, добавьте 200 мкг/мл трикаина.
  4. Держите монтаж нойивав в водяной бане 50 градусов, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию агарозы.
  5. Для изображения содводной поверхности заднего мозга на конфокальном микроскопе, оснащенном объективом погружения в воду(рисунок 2E),вставлять личинки следующим образом: Заполните 35-мм культурное блюдо монтажной средой (на глубину около 5 мм) и дайте ему полимеренизировать. Раскопки небольшой траншеи в агарозе, что имеет достаточный размер для размещения желтка мешок.
  6. Заполните пластиковую передачу пипетки расплавленной средой крепления, изгоняйте небольшое количество и используйте ее для сбора анестезированных личинок. Немедленно перенесите личинки в культурную тарелку и ориентируйте желтковые мешки, вентральные вниз, в выкопанные отверстия, используя микрокапиллярный погрузчик. Периодически поддерживать их в таком положении, пока агароза полимеризируется. Наложение с E3 сми дополнен20 мкг /мл трикаин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При передаче и позиционировании личинок, позаботьтесь о том, чтобы не вызвать эпителиального повреждения и местного воспаления, которое может повлиять на иммунологические исследования. Для позиционирования личинок жить изображение CHT области(рисунок 2J), горе, как описано выше, но положение личинок в раскопки отверстие боковой.
  7. При визуализации на перевернутом конфокальном микроскопе, вставлять личинки, без агарозной кровати, прямо на дне стеклянной нижней тарелки. Упорядочить их сонной поверхности вниз (или боковой) и после полимеризации, покрыть всю поверхность блюда с ровным слоем монтажа среды. После полимеризации добавьте тонкий слой E3-носителей, дополненный 200 мкг/мл трикаина.
  8. Для живого изображения желудочка заднего мозга на конфокальном микроскопе используйте следующие настройки: 512 x 512 пикселей; 40 х 3 мкм-стеки (простирается от наиболее поверхности заднего мозга;; 20x цель; 2.5x зум.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сравнении интенсивности сигнала между образцами (например, при визуализации поглощения Марина Синей этикетке липосомы вводят в репортер линий маркировки либо макрофагови Tg (mpeg1:EGFP)33или нейтрофиловTg (lyz:EGFP)34) важно, чтобы лазерные настройки сохраняются же (например, Диаметр пинхола, лазерное напряжение, смещение и увеличение), чтобы обеспечить любые различия не являются артефактом измененных настроек приобретения изображения.
  9. Используйте программное обеспечение для анализа 3D-изображений для количественной оценки макрофагов или нейтрофилов, связанных с липосомой Marina Blue. Чтобы количественно определить количество клеток, содержащих липосомы(рисунок 2F) в стеке, прокрутите отдельные разделы и подсчитайте количество отдельных клеток, содержащих липосомы Синяя маркировка Марина. Для количественной оценки интенсивности флуоресценции липосом в клетках(Рисунок 2G),нарисуйте область интереса вокруг каждой клетки (в измерениях X, Y и No) для количественной оценки общей или средней интенсивности флуоресценции внутриклеточной Marina Blue.

Результаты

Описанный здесь подход тонкой пленочной гидратации для подготовки флуоресцентных липосом, охватывающих препараты, является простым и экономически эффективным методом. С протоколом, используемым в этом исследовании, липосомы, как ожидается, будет unilamellar23,24...

Обсуждение

Здесь мы предоставили подробный протокол для формулирования нагруженных наркотиками липосом специально для макрофагов в личинок зебры. Этот метод может быть использован для вскрытия роли макрофагов в некоторых моделях заболеваний путем обеспечения прямой целенаправленной доставки...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что конкурирующих финансовых интересов не существует.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами, присужденными C.J.H. (Совет по исследованиям в области здравоохранения Новой Зеландии и Фондмарса, Королевское общество Новой Зеландии) и З.В. (Фонд развития исследований факультета Оклендского университета). Авторы благодарят Алхада Махагаонкара за экспертное управление объектом зебры, Отделом исследований биомедицинских изображений, Школой Медицинских Наук, Оклендским университетом за помощь в разработке конфокальной визуализации и Грэмом Лишешке за то, что он подарил линию репортеров Tg (mpeg1:EGFP).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Inc.850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)Avanti Polar Lipids, Inc.850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranesGE Healthcare Life Sciences110610
25 mL round-bottom flaskSigma-AldrichZ278262
35 mm culture dishThermo Scientific150460
AcetonitrileSigma-Aldrich34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array DetectorAgilent TechnologiesG4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary PumpAgilent TechnologiesG1311B
Agilent 1290 Infinity Series ThermostatAgilent TechnologiesG1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needlesWarner Instruments203-776-0664
CaCl2Sigma-AldrichC4901-100G
cholesterolSigma-AldrichC8667
Dumont No.5 fine tip forcepsFine Science Tools11251-10
Eppendorf Microloader pipette tipEppendorf5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vesselsEppendorf4053-6038
eyelash manipulatorTed Pella Inc.113
hemocytometerHawksleyBS.748
HEPESBDH Chemicals441474J
HPLC systemAgilent Technologies1260 series HPLC system
KClSigma-AldrichP9541-1KG
low melting point agaroseInvitrogen16520-100
LysoTracker Deep RedInvitrogenL124921 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep RedThermo ScientificL12492
magnetic standNarishigeGJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)InvitrogenM12652Keep at -20 °C and protect from light.
MethanolSigma-Aldrich34860
methyl celluloseSigma-AldrichM0387-500G
methylene blueAlfa Aesar42771
MgSO4Sigma-Aldrich230391-500G
micromanipulatorNarishigeM-152
mineral oilSigma-AldrichM-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide IndicatorThermo ScientificM36008
MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-10GTake care when handling, toxic.
NaClBDH Chemicals27810.295
PBS (pH 7.4)Gibco10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)Corning Inc.430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm columnPhenomenex00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateThermo ScientificP35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateInvitrogenP35361Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipetteMedi'RayRL200C
poloxamer 188BASF Corporation
pressure injectorApplied Scientific InstrumentsMPPI-2
rotary evaporatorBüchi, Flawil, SwitzerlandBüchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscopeOlympusOlympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ UltracentrifugeThermo Scientific75000090
stereomicroscopeLeicaMZ12
TricaineSigma-AldrichA5040-25GMake 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100Sigma-AldrichX100-100ML
Ultrasonic bathThermo ScientificFB-11205
Volocity Image Analysis SoftwarePerkinElmerversion 6.3
water bath
Zetasizer NanoMalvern Instruments LtdZetasizer Nano ZS ZEN 3600

Ссылки

  1. Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).
  2. Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
  3. Krenkel, O., Tacke, F. Liver macrophages in tissue homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 17 (5), 306-321 (2017).
  4. Alderton, G. K. Tumour immunology: turning macrophages on, off and on again. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 136-137 (2014).
  5. Moore, K. J., Sheedy, F. J., Fisher, E. A. Macrophages in atherosclerosis: a dynamic balance. Nature Reviews Immunology. 13 (10), 709-721 (2013).
  6. Lawrence, T., Natoli, G. Transcriptional regulation of macrophage polarization: enabling diversity with identity. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 750-761 (2011).
  7. Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 738-749 (2011).
  8. Renshaw, S. A., Trede, N. S. A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models and mechanisms. 5 (1), 38-47 (2012).
  9. Hall, C. J., et al. Immunoresponsive gene 1 augments bactericidal activity of macrophage-lineage cells by regulating beta-oxidation-dependent mitochondrial ROS production. Cell Metabolism. 18 (2), 265-278 (2013).
  10. Hall, C. J., et al. Blocking fatty acid-fueled mROS production within macrophages alleviates acute gouty inflammation. Journal of Clinical Investigation. 125 (5), 1752-1771 (2018).
  11. Cambier, C. J., et al. Mycobacteria manipulate macrophage recruitment through coordinated use of membrane lipids. Nature. 505 (7482), 218-222 (2014).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Madigan, C. A., et al. A Macrophage Response to Mycobacterium leprae Phenolic Glycolipid Initiates Nerve Damage in Leprosy. Cell. 170 (5), 973-985 (2017).
  14. Tobin, D. M., et al. The lta4h locus modulates susceptibility to mycobacterial infection in zebrafish and humans. Cell. 140 (5), 717-730 (2010).
  15. Volkman, H. E., et al. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327 (5964), 466-469 (2010).
  16. Bowman, T. V., Zon, L. I. Swimming into the future of drug discovery: in vivo chemical screens in zebrafish. ACS Chemical Biology. 5 (2), 159-161 (2010).
  17. Kaufman, C. K., White, R. M., Zon, L. Chemical genetic screening in the zebrafish embryo. Nature Protocols. 4 (10), 1422-1432 (2009).
  18. Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (1), 35-44 (2005).
  19. Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer. Trends in Pharmacological Sciences. 30 (11), 592-599 (2009).
  20. Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (2), 145-160 (2005).
  21. Immordino, M. L., Dosio, F., Cattel, L. Stealth liposomes: review of the basic science, rationale, and clinical applications, existing and potential. International Journal of Nanomedicine. 1 (3), 297-315 (2006).
  22. Astin, J. W., et al. Innate immune cells and bacterial infection in zebrafish. Methods in Cell Biology. 138, 31-60 (2017).
  23. Zhang, W., et al. Post-insertion of poloxamer 188 strengthened liposomal membrane and reduced drug irritancy and in vivo precipitation, superior to PEGylation. Journal of Controlled Release. 203, 161-169 (2015).
  24. Wu, Z., et al. Liposome-Mediated Drug Delivery in Larval Zebrafish to Manipulate Macrophage Function. Zebrafish. 16 (2), 171-181 (2019).
  25. Cader, M. Z., et al. C13orf31 (FAMIN) is a central regulator of immunometabolic function. Nature Immunology. 17 (9), 1046-1056 (2016).
  26. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Influence of particle size on drug delivery to rat alveolar macrophages following pulmonary administration of ciprofloxacin incorporated into liposomes. Journal of Drug Targeting. 14 (8), 557-566 (2006).
  27. Chono, S., Tanino, T., Seki, T., Morimoto, K. Uptake characteristics of liposomes by rat alveolar macrophages: influence of particle size and surface mannose modification. Journal of Pharmact and Pharmacology. 59 (1), 75-80 (2007).
  28. Chono, S., Tauchi, Y., Morimoto, K. Influence of particle size on the distributions of liposomes to atherosclerotic lesions in mice. Drug Development and Industrial Pharmacy. 32 (1), 125-135 (2006).
  29. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), (2009).
  30. Hall, C., Flores, M. V., Crosier, K., Crosier, P. Live cell imaging of zebrafish leukocytes. Methods in Molecular Biology. 546, 255-271 (2009).
  31. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage phagocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  32. Shen, K., Sidik, H., Talbot, W. S. The Rag-Ragulator Complex Regulates Lysosome Function and Phagocytic Flux in Microglia. Cell Reports. 14 (3), 547-559 (2016).
  33. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), 49-56 (2011).
  34. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  35. Ahsan, F., Rivas, I. P., Khan, M. A., Torres Suarez, A. I. Targeting to macrophages: role of physicochemical properties of particulate carriers--liposomes and microspheres--on the phagocytosis by macrophages. Journal of Controlled Release. 79 (1-3), 29-40 (2002).
  36. Martin, W. J., Walton, M., Harper, J. Resident macrophages initiating and driving inflammation in a monosodium urate monohydrate crystal-induced murine peritoneal model of acute gout. Arthritis and Rheumatology. 60 (1), 281-289 (2009).
  37. Faires, J. S., McCarty, D. J. Acute arthritis in man and dog after intrasynovial injection of sodium urate crystals. Lancet. 280, 682-685 (1962).
  38. Martin, W. J., Harper, J. L. Innate inflammation and resolution in acute gout. Immunology and Cell Biology. 88 (1), 15-19 (2010).
  39. Fenaroli, F., et al. Nanoparticles as drug delivery system against tuberculosis in zebrafish embryos: direct visualization and treatment. ACS Nano. 8 (7), 7014-7026 (2014).
  40. Robertson, J. D., Ward, J. R., Avila-Olias, M., Battaglia, G., Renshaw, S. A. Targeting Neutrophilic Inflammation Using Polymersome-Mediated Cellular Delivery. Journal of Immunology. 198 (9), 3596-3604 (2017).
  41. Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). International Journal of Developmental Biology. 48 (2-3), 217-231 (2004).
  42. Kelly, C., Jefferies, C., Cryan, S. A. Targeted liposomal drug delivery to monocytes and macrophages. Journal of Drug Delivery. 2011, 727241 (2011).
  43. Fidler, I. J., et al. Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages. Cancer Research. 40 (12), 4460-4466 (1980).
  44. Ng, A. N., et al. Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis. Developmenal Biology. 286 (1), 114-135 (2005).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены