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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Synthese von medikamentenbelasteten Liposomen und deren Mikroinjektion in Larvenzebrafische zum Zweck der gezielten Medikamentenabgabe an Makrophagen-Linienzellen.

Zusammenfassung

Zebrafische (Danio rerio) Larven haben sich zu einem beliebten Modell entwickelt, um Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen und den Beitrag angeborener Immunzellen zu entzündlichen Erkrankungen aufgrund ihres funktionell konservierten angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Sie sind auch weit verbreitet, um zu untersuchen, wie angeborene Immunzellen helfen, Entwicklungsprozesse zu leiten. Durch die Nutzung der optischen Transparenz und genetischen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen konzentrieren sich diese Studien häufig auf live-bildgebende Ansätze zur funktionellen Charakterisierung fluoreszierend markierter Makrophagen und Neutrophilen innerhalb intakter Tiere. Aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und der ständig wachsenden Rolle bei der Pathogenese von Krankheiten haben Makrophagen erhebliche Aufmerksamkeit erhalten. Neben genetischen Manipulationen werden chemische Eingriffe nun routinemäßig eingesetzt, um das Makrophagenverhalten bei Larvenzebrafischen zu manipulieren und zu untersuchen. Die Lieferung dieser Medikamente ist in der Regel auf passive Simtung von kostenlosen Medikamenten durch direktes Eintauchen oder Mikroinjektion beschränkt. Diese Ansätze beruhen auf der Annahme, dass jede Änderung des Makrophagenverhaltens das Ergebnis einer direkten Wirkung des Arzneimittels auf die Makrophagen selbst ist und keine nachgelagerte Folge einer direkten Auswirkung auf einen anderen Zelltyp. Hier stellen wir unsere Protokolle zur Gezielten Ausrichtung auf Larvenzebrafische Makrophagen durch Mikroinjizieren von medikamentösen fluoreszierenden Liposomen vor. Wir zeigen, dass Poloxamer 188-modifizierte medikamentöse blaue fluoreszierende Liposomen leicht von Makrophagen und nicht von Neutrophilen aufgenommen werden. Wir liefern auch Beweise dafür, dass Auf diese Weise gelieferte Medikamente die Makrophagenaktivität in einer Weise beeinflussen können, die mit dem Wirkmechanismus des Medikaments im Einklang steht. Diese Technik wird für Forscher von Nutzen sein, die sicherstellen wollen, dass Medikamente auf Makrophagen ausgerichtet werden und wenn Medikamente zu toxisch sind, um mit traditionellen Methoden wie Demonsion geliefert zu werden.

Einleitung

Das mononukleare Phagozytensystem bietet eine erste Verteidigungslinie gegen eindringende Krankheitserreger. Dieses System besteht aus Monozyten, monozytenabgeleiteten dendritischen Zellen und Makrophagen, die aktiv fremde Krankheitserreger phagozytieren und so die Ausbreitung von Krankheitserregern begrenzen. Zusätzlich zu diesen phagozytischen und mikrobiziden Effektorfunktionen sind dendritische Zellen und Makrophagen auch in der Lage, Zytokin zu production und Antigen-Präsentation, um das adaptive Immunsystem zu aktivieren1. Von diesen Zellen haben Makrophagen aufgrund ihrer vielfältigen funktionellen Heterogenität und Beteiligung an multiplen entzündlichen Erkrankungen, von Autoimmunität und Infektionskrankheiten bis hin zu Krebs2,3,4,5,6,7,besondere Aufmerksamkeit erhalten. Die Plastizität von Makrophagen und ihre Fähigkeit, sich funktionell an die Bedürfnisse ihrer Gewebeumgebung anzupassen, erfordern experimentelle Ansätze, um diese Zellen in vivo direkt zu beobachten und zu befragen.

Larval Zebrafische sind ein idealer Modellorganismus, um die Funktion und Plastizität von Makrophagen in vivo8zu untersuchen. Die optische Transparenz von Larvenzebrafischen bietet ein Fenster, um das Verhalten von Makrophagen direkt zu beobachten, insbesondere in Verbindung mit transgenen Reporterlinien, die makrophagen markieren. Die Nutzung des Live-Bildgebungspotenzials und der experimentellen Traktionsfähigkeit von Larvenzebrafischen hat zu vielen bedeutenden Erkenntnissen über die Makrophagenfunktion geführt, die direkte Relevanz für die menschliche Krankheit haben9,10,11,12,13,14,15. Viele dieser Studien haben auch die hohe Erhaltung der Drogenaktivität bei Zebrafischen genutzt (ein Attribut, das ihre Verwendung als ganzes Tier Arzneimittel Entdeckungplattform16,17,18) durch die Verwendung chemischer Interventionen, um pharmakologisch zu manipulieren Makrophagen Funktion. Bis heute wurden diese pharmakologischen Behandlungen meist entweder durch Eintauchen, das wasserlöslich es erfordert, oder durch direkte Mikroinjektion von freiem Medikament geliefert (Abbildung 1A). Zu den Einschränkungen dieser passiven Lieferstrategien gehören Off-Target-Effekte und allgemeine Toxizität, die eine Bewertung der Auswirkungen auf die Makrophagenfunktion ausschließen können. Darüber hinaus ist bei der Untersuchung von Arzneimittelwirkungen auf Makrophagen nicht bekannt, ob die Medikamente auf die Makrophagen selbst oder durch indirekteMechanismen wirken. Bei der Durchführung ähnlicher chemischer Interventionsstudien zur Untersuchung der Makrophagenfunktion erkannten wir, dass es eine unerfüllte Notwendigkeit gab, eine kostengünstige und unkomplizierte Verabreichungsmethode zu entwickeln, um Medikamente speziell auf Makrophagen auszurichten.

Liposomen sind mikroskopische, biokompatible, lipidbilayerierte Vesikel, die Proteine, Nukleotide und Drogenfracht verkapseln können19. Die unilamellare oder multilamellare Lipid-Doppelschichtstruktur von Liposomen bildet ein wässriges inneres Lumen, in dem wasserlösliche Medikamente eingearbeitet werden können, während hydrophobe Medikamente in die Lipidmembranen integriert werden können. Darüber hinaus können die physikalisch-chemischen Eigenschaften von Liposomen, einschließlich Größe, Ladung und Oberflächenmodifikationen, manipuliert werden, um ihre Ausrichtung auf bestimmte Zellen20,21zuzuschneiden. Diese Eigenschaften von Liposomen haben sie zu einem attraktiven Vehikel gemacht, um Medikamente zu liefern und die Präzision der aktuellen Behandlungsschemata zu verbessern20. Da Liposomen natürlich durch Makrophagen phagozytoisiert werden (ein Merkmal, das durch ihre routinemäßige Verwendung bei der Bereitstellung von Clodronat speziell für Makrophagen für Ablationsexperimente genutzt wird22), stellen sie als attraktive Option für die makrophagenspezifische Arzneimittelabgabe dar (Abbildung 1B).

Dieses Protokoll beschreibt die Formulierung von Medikamenten in blaue fluoreszierende Liposomen, die mit dem hydrophilen Polymer Poloxamer 188 beschichtet sind, das eine Schutzschicht auf der Liposomenoberfläche bildet und nachweislich die Arzneimittelretention verbessert und eine überlegene Biokompatibilitäthat 23. Poloxamer wurde für die Oberflächenbeschichtung von Liposomen ausgewählt, da unsere bisherigen Forschungen gezeigt hatten, dass Poloxamer modifizierte Liposomen im Vergleich zu Polyethylenglykolmodifizierten Liposomen eine bessere Biokompatibilität nach subkutaner Injektion von Rattenpfoten und ähnlicher Pharmakokinetik bei Kaninchen nach intravenöser Infusionzeigten 23. Protokolle werden auch für ihre Mikroinjektion in Larvenzebrafische und Live-Bildgebung beschrieben, um ihre Makrophagen-Targeting-Fähigkeit und Lokalisierung in intrazelluläre Kompartimente zu bewerten, die für den Liposomenabbau und die zytoplasmatische Arzneimittelabgabe notwendig sind. Als Proof-of-Concept haben wir diese Technik bereits verwendet, um zwei Medikamente auf Makrophagen zu zielen, um ihre Aktivierung in einem Larven-Zebrafischmodell der akuten Gichtentzündung zu unterdrücken24. Diese Medikamentenabgabetechnik erweitert das chemische "Toolkit", das Zebrafischforschern zur Verfügung steht, die eine Makrophagen-Targeting ihrer Medikamente von Interesse sicherstellen wollen.

Protokoll

1. Zubereitung von drogenbeladenen Marina Blue-labeled Liposomen

HINWEIS: Liposomen, die den blauen Fluoreszenzfarbstoff, Marina Blue und das Medikament tragen, werden mit einer Dünnschichthydratationsmethode mit Post-Insertion von Poloxamer 188 hergestellt. Alle Eingriffe werden bei Raumtemperatur durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Kontrollliposomen tragen nur Marina blue und PBS. Das Beispiel hier beschreibt das Laden von Liposomen mit einem Mitochondrien-targeting-Antioxidans-Medikament25, das in den repräsentativen Ergebnissen als Proof-of-Concept verwendet wird.

  1. Zur Herstellung von Liposomen 16,4 mg (22,2 mol) der Phospholipide 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin aufzulösen (siehe Materialtabelle), 4.3 mg (11,1 mol) Cholesterin (siehe Materialtabelle)und 2,8 mg (3,7 mol) 1,2-Diseteroyl-sn-Glycero-3-Phosphocholin (siehe Tabelle der in 3 ml Chloroform:Methanol (3:1 v/v) in einem 25 ml Rundbodenkolben.
  2. Zu der oben genannten Mischung 31 nmol Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin (siehe Tabelle der Materialien) und 300 nmol eines mROS hemmenden Medikaments (siehe Tabelle der Materialien)und kurz beschallen, um sich vollständig aufzulösen. Zur Kontrolle von Liposomen nur Marina Blue 1,2-Dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamin hinzufügen.
    HINWEIS: Um Photobleichungen des lichtempfindlichen Marina Blue Fluoreszenzfarbstoffs zu vermeiden, schützen Sie alle Verfahren nach Möglichkeit vor Licht. Dies ist auch wichtig, wenn das zu ladende Medikament lichtempfindlich ist.
  3. Entfernen Sie das Lösungsmittel langsam auf einem Rotationsverdampfer (siehe Materialtabelle) über einem temperaturgeregelten Wasserbad, das auf 45 °C eingestellt ist, indem Sie sich bei 75 U/min unter Vakuumdruck drehen (200 mbar für 15 min und dann 0 mbar für 20 min). Dies bildet einen trockenen dünnen Lipidfilm in den Glaswänden des Kolbens, der unter N2 45 min weiter getrocknet wird, um eine vollständige Entfernung des organischen Lösungsmittels zu ermöglichen.
  4. Nach der Bildung des dünnen Films den Vakuumdruck für 15 min auf 40 mbar einstellen und dann 30 min mit Stickstoffgas reinigen, um die Entfernung von Rückstandslösungsmittel zu gewährleisten.
  5. Den dünnschichtigen Film mit 1 ml phosphatgepufferter Salzsäure (PBS, pH 7,4) hydratisieren und mit Parafilm abdichten, bevor der Kolben mit einem Rotationsverdampfer über einem 60 °C Wasserbad 20 min lang geworben wird, um Vesikel zu bilden.
  6. Die hydratisierte Suspension 7 Zyklen Gefrier- und Tauwetter durch Einfrieren in Flüssigkeit N2 für 3 min, gefolgt von einem Eintauchen in ein 45 °C Wasserbad für 7 min.
  7. Extrudieren Sie Liposomen durch eine Membran mit einem Miniextruder (siehe Materialtabelle)und 1,0 m spurgeätzten Polycarbonatmembranen (siehe Materialtabelle) für 2-6 Zyklen, um große unilamellare Vesikel zu erhalten.
    ANMERKUNG: Um eine günstigere Ausrichtung auf Makrophagen zu erreichen, manipulieren Sie Extrusionszyklen, bis der Durchmesser der Liposomen etwa 1 m26,27,28beträgt.
  8. Kondensieren Sie die frischen Liposomen durch Ultrazentrifugation bei 186.000 x g zu einem Pellet und brüten Sie mit 1 ml 1% Poloxamer 188 (siehe Materialtabelle) Lösung (10 mg/ml in PBS) bei 45 °C und 750 U/min für 30 min mit einem Thermomixer mit einer 2 ml Mikrozentrifugenrohr-Aufsatz (siehe Tabelle).
  9. Ultrazentrifugieren Sie die Mischung bei 186.000 x g für 1 h bei 4 °C und entfernen Sie den Überstand, um ungebundene Polymere oder Medikamente zu entfernen. Bewahren Sie die Liposomenpellets bei 4 °C auf, geschützt vor Licht.

2. Charakterisierung von Liposomengröße und Zeta-Potenzial

  1. Liposomenformulierung mit Reinstwasser (1:100) verdünnen und Partikelgröße, Polydispersitätsindex (PDI) und Zetapotenzial der Liposomen mit einem dynamischen Lichtstreuanalysator (siehe Materialtabelle)in dreifacher Auslage bei 25 °C messen.
    HINWEIS: Die PDI ist ein Maß für die Größenverteilung der Nanopartikelpopulation. PDI-Werte < 0,05 gibt eine gleichmäßigere Verteilung an, während Werte näher an 1 eine größere Größenverteilung anzeigen. Das Zeta-Potenzial ist die gesamte Oberflächenladung.

3. Berechnung der Entrapment Efficiency und Drug Loading in Liposomen

HINWEIS: Um die Einschlusseffizienz des Arzneimittels in Liposomen zu bestimmen, wird der im Überstand und Liposomenenthalten enthaltene Wirkstoffgehalt gemessen.

  1. Setzen Sie das Liposomenpellet in 1 ml PBS wieder auf.
  2. Entfernen Sie den Überstand, verdünnen Sie 10 x mit Reinstwasser und analysieren Sie durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC).
  3. Um die Wirkstoffkonzentration innerhalb der Liposomen zu bestimmen, fügen Sie 100 L Liposomensuspension zu 900 L der 10% Triton-X100-Lösung hinzu (um die Lipidmembran zu zerstören, das umflätige Medikament freizusetzen und Lipidbildung in der HPLC-Säule zu verhindern) und Wirbel für 3 min vor der Analyse.
  4. In ein HPLC-System, das aus einer Quaternärpumpe, einem Thermostat-Auto-Sampler und einer Säule mit 3 x 250 x 4,6 mm besteht, werden 20 l Proben einspritzen. Stellen Sie den mobilen Durchfluss (10 mM PBS pH 2,5, Acetonitril und Methanol (30:40:30, v/v/v)) durch die Durchflussrate auf 0,9 mL/min ein und erhalten Sie Spektralprofile mit einem Dioden-Array-Detektor, der auf 230 mM eingestellt ist.
  5. Berechnen Sie die Einschlusseffizienz (EE) und die Ladung von Medikamenten (DL) mit den folgenden Gleichungen:
    EE (%) = [Ich / Mt] x 100
    DL (%) = [Ich / Mlip] x 100
    Wo Ich die Masse der Droge verkapselt ist, Mt ist die Gesamtmasse des Medikaments während der Formulierung verwendet und Mlip ist die Gesamtmasse der Lipide (einschließlich Cholesterin) und verkapselte Droge.

4. Herstellung und Injektion von Liposomen

  1. Bereiten Sie Borosilikat-Mikroinjektionsnadeln vor, indem Sie eine dünne Wandborosilikatglaskapillare (1 mm O.D. x 0,78 mm I.D. x 10 cm Länge) in eine Mikropipette-Ziehvorrichtung (siehe Tabelle der Materialien)mit den folgenden generischen Abziehereinstellungen (Heat 680, Pull 75, Velocity 40, Zeit 55 und Druck 530) einsetzen, um eine verjüngte Mikroinjektionsnadel herzustellen.
  2. Legen Sie die Nadeln in eine Petrischale auf den Modellierton und ordnen Sie so an, dass das gezogene Ende den Boden der Schale nicht berührt. Halten Sie den Deckel der Petrischale geschlossen, um Staubkontaminationen zu vermeiden, bis sie einsatzbereit sind.
  3. Frisch zubereitete Liposomenformulierungen 1:1 in sterilem PBS (pH 7.4) verdünnen und kurz (2-3 s) mischen.
    HINWEIS: Schützen Sie Liposomen vor Licht, bis Larven zur Mikroinjektion bereit sind.
  4. Richten Sie in der Nacht zuvor erwachsene Zebrafischzuchtpaare ein und sammeln Sie Embryonen, wie zuvor von Rosen et al.29beschrieben.
  5. Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale (100 mm x 20 mm Stil mit ca. 60 Embryonen pro Schale), die E3-Medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4) enthält, ergänzt mit 0,1% Methylenblau, um das Pilzwachstum zu hemmen. Entfernen Sie alle toten oder unbefruchteten Embryonen und brüten Sie über Nacht bei 28,5 °C.
  6. Um die Live-Bildgebung zu erleichtern, fügen Sie 0,003% N-Phenylthiourea (PTU) in die E3-Medien ein, wenn die Embryonen 24 h Entwicklungszeit erreichen, um pigmentbildung (Melanisierung) zu verhindern.
  7. Die Embryonen mit feiner Spitzenzange (hpf) bei ca. 30 h nach der Befruchtung (hpf) manuell dechorisieren.
    HINWEIS: Verwenden Sie keine enzymatische Behandlung, um Embryonen zu dechorisieren, da dies Epithelschäden und lokale Entzündungen verursachen kann und dadurch immunologische Studien beeinflusst
  8. Lassen Sie die Embryonen bei 28,5 °C bis 2 Tage nach der Befruchtung entwickeln( dpf).
  9. Bereiten Sie eine Injektionsplatte vor, indem Sie genügend 3% Methylcellulose (in E3-Medien) in den Deckel einer kleinen 35 mm Kulturschale gießen, um einen dünnen Film zu bilden, der die gesamte Oberfläche bedeckt.
    HINWEIS: Bei der Zubereitung von 3% Methylcellulose in E3-Medien dauert es mehrere Tage, bis sich die Methylcellulose mit sanftem Rühren auf einem Orbitalshaker auflöst.
  10. Anästhesisieren Sie die Larven durch Inkubation in E3-Medien, ergänzt mit 200 g/ml Tricain.
  11. Sammeln Sie einen Pool von ca. 20-25 Larven mit einer Kunststoff-Transferpipette und lassen Sie die Embryonen an der Spitze der Pipette durch Schwerkraft konzentrieren. Achten Sie darauf, die Larven mit minimaler Flüssigkeit zu übertragen, legen Sie sie in die Mitte des 35 mm Kulturschalendeckels.
  12. Mit einem Mikrokapillarlader die Larven wie folgt anordnen: vordernach zur Oberseite der Injektionsplatte mit der dorsalen Oberfläche zur Mikroinjektionsnadel zeigend, in den Hinterhirnventrikel zu injizieren (Abbildung 2A-D); oder, anterior nach links von der Injektionsplatte (bei Injektion von rechts) mit der ventralen Oberfläche in Richtung der Mikroinjektionsnadel, um in den Sinus venosus zu injizieren (Abbildung 2I).
    HINWEIS: Auf diese Weise können Hinterhirn-Ventrikel-Resident (Abbildung 2E) und kaudales hämatopoetisches Gewebe (CHT)-Resident (Abbildung 2J) makrophagen gezielt werden. Die CHT-Region von Larvenzebrafischen ist eine hämatopoetische Stelle analog zur fetalen Leber des Säugetiers. Achten Sie besonders darauf, die Embryonen nicht zu schädigen, während Sie sich arrangieren, da dies lokale Entzündungen verursachen kann, wodurch immunologische Studien beeinflusst werden.
  13. Nehmen Sie frisch zubereitete Liposomen (ab Schritt 4.3) und füllen Sie eine Injektionsnadel mit ca. 5 l der Liposomen-Injektionsmischung mit einem Mikrokapillarlader (siehe Tabelle der Materialien).
    ANMERKUNG: Bei der Beurteilung der Lokalisation von Liposomen in die phagolysosomalen Kompartimente von Makrophagen (Abbildung 2H) ergänzen Sie diesen Injektionsmix mit 200 g/ml eines roten fluoreszierenden Markers von Phagosomen (siehe Materialtabelle)und 100 nM eines weit roten fluoreszierendenMarkersvon Lysosomen (siehe Tabelle der Materialien), um Phagosomen30,31 bzw. Lysosome zu markieren.
  14. Montieren Sie die Nadel in einen Mikromanipulator (siehe Materialtabelle), der mit einem magnetischen Ständer und einem Druckinjektor verbunden ist (siehe Tabelle der Materialien). Positionieren Sie sich unter einem Stereomikroskop und stellen Sie den Injektor auf eine Pulsdauer von ca. 50 ms und einen Injektionsdruck von ca. 40 psi ein.
  15. Schneiden Sie die Spitze der Mikroinjektionsnadel mit sauberen feinen Spitzenzangen, um eine Öffnung von ca. 5 m Durchmesser zu erzeugen.
  16. Kalibrieren Sie das zu injizierende Volumen, indem Sie einen Bolus in einen Tropfen Mineralöl injizieren, der über den Gitterlinien eines Hämozytometers positioniert ist. Passen Sie die Impulsdauer und/oder den Einspritzdruck so lange an, bis der Durchmesser des Bolus 2,5 der kleinsten Rasterlinien abdeckt (dies entspricht einem Volumen von ca. 1 nL).
  17. 1 nL der Liposomeninjektion sinjizieren Sie vorsichtig in die Hinterhirn-Herzkammer jeder Larve.
    HINWEIS: Achten Sie bei der Injektion in die Hinterhirnkammer darauf, nicht zu weit ventral (jenseits des Hinterhirns) einzudringen, da dies die zugrunde liegende Vaskulatur stören kann, die zu Blutungen führt. Bei der Injektion in den Sinus venosus sollte darauf geachtet werden, dass die Spitze der Nadel nur innerhalb des Perikards liegt und nicht in das Eigelb eindringt.
  18. Nach der Injektion die injizierten Larven sofort wieder in E3-Medien übertragen, indem Sie E3-Medien in die Injektionsplatte eintragen und die Larven mit einer Kunststoff-Transferpipette sanft aus der Methylcellulose ausheben.
  19. Inkubieren Sie die Larven bei 28,5 °C (lichtgeschützt) bis zur Analyse durch live konfokale Bildgebung.

5. Konfokale Bildgebung und Bildanalyse zur Bestätigung des Makrophagen-Targetings von Liposomen

  1. Ein Wasserbad auf 50 °C erhitzen.
  2. Anästhetisieren Sie liposomeinte Larven durch Übertragung auf eine neue Perti-Schale, die E3-Medien enthält, die mit 0,003% PTU und 200 g/ml Tricain ergänzt werden.
  3. Bereiten Sie Live-Bildgebungs-Montagemedium durch Auflösen von 1% niedriger Schmelzpunkt-Agarose in E3-Medien, ergänzt mit 0,003% PTU, in einer Mikrowelle. In das Wasserbad geben und nach der Abkühlung der Lösung auf 50 °C 200 g/ml Tricain hinzufügen.
  4. Bewahren Sie das Montagemedium im 50 °C-Wasserbad auf, um eine vorzeitige Polymerisation der Agarose zu verhindern.
  5. Um die dorsale Oberfläche des Hinterhirns auf einem konfokalen Mikroskop mit einer Wassertauchlinse(Abbildung 2E)abzubilden, betten Sie die Larven wie folgt ein: Füllen Sie eine 35 mm Kulturschale mit dem Montagemedium (bis zu einer Tiefe von ca. 5 mm) und lassen Sie sie polymerisieren. Graben sie einen kleinen Graben in der Agarose, die von ausreichender Größe ist, um den Dottersack unterzubringen.
  6. Füllen Sie eine Kunststoff-Transferpipette mit geschmolzenem Montagemedium, vertreiben Sie eine kleine Menge und verwenden Sie sie, um die anästhesierten Larven zu sammeln. Die Larven sofort in die Kulturschale übertragen und die Dottersäcke, die ventrale Seite nach unten, mit einem Mikrokapillarlader in die ausgehobenen Löcher ausrichten. Halten Sie sie regelmäßig in dieser Position, bis die Agarose polymerisiert. Overlay mit E3-Medien, ergänzt durch 200 g/ml Tricain.
    HINWEIS: Achten Sie bei der Übertragung und Positionierung von Larven darauf, keine Epithelschäden und lokale Entzündungen zu verursachen, die immunologische Studien beeinflussen können. Zur Positionierung von Larven zum Leben bilden die CHT-Region (Abbildung 2J), montieren Sie wie oben beschrieben, aber positionieren Sie die Larven innerhalb des ausgegrabenen Lochs seitlich.
  7. Bei der Bildgebung auf einem invertierten konfokalen Mikroskop, betten Sie die Larven, ohne das Agarosebett, direkt auf dem Boden einer Glasbodenschale ein. Ordnen Sie sie dorsale Oberfläche nach unten (oder seitlich) und nach der Polymerisation, decken Sie die gesamte Telleroberfläche mit einer gleichmäßigen Schicht von Montagemedium. Nach der Polymerisation fügen Sie eine dünne Schicht E3-Medien hinzu, die mit 200 g/ml Tricain ergänzt werden.
  8. Um die Hinterhirnkammer auf einem konfokalen Mikroskop zu leben, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 512 x 512 Pixel; 40 x 3 m Z-Stacks (von der dorsal-meisten Oberfläche des Hinterhirns); 20x Objektiv; 2.5x Zoom.
    ANMERKUNG: Beim Vergleich der Signalintensitäten zwischen Proben (z. B. bei der Abbildung der Aufnahme von Marina Blue-markierten Liposomen, die in Reporterlinien injiziert werden und entweder Makrophagen [Tg(mpeg1:EGFP)33] oder Neutrophilen [Tg(lyz:EGFP)34] markieren, ist es wichtig, dass die Lasereinstellungen Lochdurchmesser, Laserspannung, Offset und Verstärkung), um sicherzustellen, dass Unterschiede kein Artefakt veränderter Bildaufnahmeeinstellungen sind.
  9. Verwenden Sie 3D-Bildanalyse-Software, um Makrophagen oder neutrophile Aufnahme von Marina Blue-markierten Liposomen zu quantifizieren. Um die Anzahl der Zellen zu quantifizieren, die Liposomen enthalten (Abbildung 2F) innerhalb eines Z-Stacks, scrollen Sie durch die einzelnen Z-Abschnitte und zählen Sie die Anzahl der einzelnen Zellen, die Marina Blue-markierte Liposomen enthalten. Um die Fluoreszenzintensität von Liposomen in Zellen zu quantifizieren (Abbildung 2G), zeichnen Sie einen Bereich von Interesse um jede Zelle (in den X-, Y- und Z-Dimensionen), um die Gesamt- oder mittlere Fluoreszenzintensität der intrazellulären Marina Blue zu quantifizieren.

Ergebnisse

Der hier beschriebene Ansatz zur Dünnschichthydratation zur Herstellung fluoreszierender Liposomen, die Arzneimittel einschließen, ist eine einfache und kostengünstige Methode. Mit dem in dieser Studie verwendeten Protokoll werden die Liposomen voraussichtlich unilamellar23,24sein. Die Größe, das Zeta-Potenzial, die Lade- und Einschließungseffizienz der hergestellten Liposomen sind in Tabelle 1zusammengefasst. Die Partikelgröße der Liposo...

Diskussion

Hier haben wir ein detailliertes Protokoll zur Formulierung von medikamentenbelasteten Liposomen zur Verfügung gestellt, um gezielt Makrophagen in Larvenzebrafischen zu zielen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle von Makrophagen in bestimmten Krankheitsmodellen zu sezieren, indem eine direkte gezielte Abgabe von Medikamenten speziell auf Makrophagen sichergestellt wird. Darüber hinaus kann es verwendet werden, wenn die allgemeine Toxizität von Medikamenten ihre Verwendung begrenzt, wenn sie auf konventio...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Stipendien unterstützt, die c.J.H. (Health research Council of New Zealand and Marsden Fund, Royal Society of New Zealand) und Z.W. (Faculty Research Development Fund von der University of Auckland) verliehen wurden. Die Autoren danken Alhad Mahagaonkar für das fachkundige Management der Zebrafischanlage, der Biomedical Imaging Research Unit, School of Medical Sciences, University of Auckland für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Graham Lieschke für die Begabung der Tg(mpeg1:EGFP) Reporterlinie.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar Lipids, Inc.850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)Avanti Polar Lipids, Inc.850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranesGE Healthcare Life Sciences110610
25 mL round-bottom flaskSigma-AldrichZ278262
35 mm culture dishThermo Scientific150460
AcetonitrileSigma-Aldrich34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array DetectorAgilent TechnologiesG4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary PumpAgilent TechnologiesG1311B
Agilent 1290 Infinity Series ThermostatAgilent TechnologiesG1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needlesWarner Instruments203-776-0664
CaCl2Sigma-AldrichC4901-100G
cholesterolSigma-AldrichC8667
Dumont No.5 fine tip forcepsFine Science Tools11251-10
Eppendorf Microloader pipette tipEppendorf5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vesselsEppendorf4053-6038
eyelash manipulatorTed Pella Inc.113
hemocytometerHawksleyBS.748
HEPESBDH Chemicals441474J
HPLC systemAgilent Technologies1260 series HPLC system
KClSigma-AldrichP9541-1KG
low melting point agaroseInvitrogen16520-100
LysoTracker Deep RedInvitrogenL124921 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep RedThermo ScientificL12492
magnetic standNarishigeGJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)InvitrogenM12652Keep at -20 °C and protect from light.
MethanolSigma-Aldrich34860
methyl celluloseSigma-AldrichM0387-500G
methylene blueAlfa Aesar42771
MgSO4Sigma-Aldrich230391-500G
micromanipulatorNarishigeM-152
mineral oilSigma-AldrichM-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide IndicatorThermo ScientificM36008
MitoTEMPOSigma-AldrichSML0737Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)Sigma-AldrichP7629-10GTake care when handling, toxic.
NaClBDH Chemicals27810.295
PBS (pH 7.4)Gibco10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)Corning Inc.430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm columnPhenomenex00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateThermo ScientificP35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles ConjugateInvitrogenP35361Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipetteMedi'RayRL200C
poloxamer 188BASF Corporation
pressure injectorApplied Scientific InstrumentsMPPI-2
rotary evaporatorBüchi, Flawil, SwitzerlandBüchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscopeOlympusOlympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ UltracentrifugeThermo Scientific75000090
stereomicroscopeLeicaMZ12
TricaineSigma-AldrichA5040-25GMake 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100Sigma-AldrichX100-100ML
Ultrasonic bathThermo ScientificFB-11205
Volocity Image Analysis SoftwarePerkinElmerversion 6.3
water bath
Zetasizer NanoMalvern Instruments LtdZetasizer Nano ZS ZEN 3600

Referenzen

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