הכוונת תרופות לזחל מקרופאגים על ידי הזרקת סמים טעונים ליפוזומים

Summary

כאן, אנו מתארים את הסינתזה של ליפוזומים בסמים שנטענו וההזרקה שלהם לזחל הדגים מטרה למטרה לכוון מסירת סמים לתאי השושלת מקרופאג.

Abstract

Zebrafish (danio rerio) הזחלים התפתחו למודל פופולרי לחקור אינטראקציות מארח הפתוגן והתרומה של תאים חיסוניים מולדים למחלות דלקתיות בשל המערכת החיסונית שלהם שימור פונקציונלית מולדים. הם גם משמשים רבות כדי לבחון כיצד תאים חיסוניים מולדים לסייע להדריך תהליכים התפתחותיים. על-ידי ניצול השקיפות האופטית ואת השיטות הגנטיות של זחל צברפיש, מחקרים אלה מתמקדים לעתים קרובות על גישות הדמיה חיה לאפיין פונקציונלי מסומנים פלואורוסקופים ונויטרופילים בתוך בעלי חיים שלמים. בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם והרחבת תפקידים בפתוגנזה המחלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב משמעותית. בנוסף למניפולציות גנטיות, התערבויות כימיות משמשות כעת באופן שגרתי כדי לתמרן ולבחון התנהגות מקרופאג בזחל מדגים. מסירת תרופות אלה מוגבלת בדרך כלל למיקוד פסיבי של תרופה חופשית באמצעות טבילה ישירה או מיקרוהזרקה. גישות אלה מסתמכות על ההנחה כי כל שינוי התנהגות מקרופאג הם תוצאה של השפעה ישירה של הסם על מקרופאגים עצמם, ולא תוצאה במורד הזרם של השפעה ישירה על סוג תא אחר. כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים שלנו במטרה לכוון תרופות במיוחד לזחל מקרופאגים באמצעות מיקרוהזרקת סמים שנטענו ליפוזומים. אנו חושפים כי poloxamer 188-שונה ליפוזומים לתרופות פלורסנט כחול הם נלקח בקלות על ידי מקרופאגים, ולא על ידי נויטרופילים. כמו כן, אנו מספקים ראיות לכך שסמים הנמסרים בדרך זו יכולים להשפיע על מקרופאג פעילות באופן עקבי עם מנגנון פעולת התרופה. טכניקה זו יהיה ערך לחוקרים המבקשים להבטיח המיקוד של תרופות מקרופאגים וכאשר הסמים רעילים מדי כדי להיגאל על ידי שיטות מסורתיות כמו טבילה.

Introduction

מערכת פגוציט מספק קו ההגנה הראשון נגד הפולשים פתוגנים. מערכת זו מורכבת מונוציטים, תאים דנדריטים מונוציט נגזר ו מקרופאגים, אשר באופן פעיל phagocytoze פתוגנים זרים, ובכך להגביל את התפשטות הפתוגן. בנוסף לפונקציות אלה phagocytic ו microbicidal התאים הדנדריטים מקרופאגים הם גם מסוגלים ייצור cy, אנטיגן-מצגת כדי להפעיל את המערכת החיסונית אדפטיבית¹. של תאים אלה, מקרופאגים קיבלו תשומת לב מיוחדת בשל טרוגניות תפקודית מגוונת שלהם ומעורבות מחלות דלקתיות מרובות, מ חסינות אוטומטית מחלות זיהומיות לסרטן^2,3,4,5,6,7. הפלסטיות של מקרופאגים ויכולתם להסתגל מבחינה פונקציונלית לצרכים בסביבת הרקמה שלהם מחייבת גישות נסיוניות להתבונן ישירות ולחקור תאים אלה בvivo.

זחל זהפיש הם אורגניזם מודל אידיאלי שדרכו ללמוד את הפונקציה ואת הפלסטיות של מקרופאגים ב vivo⁸. השקיפות האופטית של זחל דג זברה מספק חלון כדי להתבונן ישירות התנהגות של מקרופאגים, במיוחד כאשר ביחד עם קווי הכתב הטרנסגניים מקרופאג. ניצול פוטנציאל ההדמיה החי ואת היכולת הניסיונית של זחל הדגים הובילו לתובנות משמעותיות רבות לפונקציה מקרופאג שיש להן רלוונטיות ישירה למחלה האנושית^{9,10,11,12,13,14,15}. רבים ממחקרים אלה ניצלו גם את היתרון של שימור גבוה של פעילות הסמים ב-דג זברה (תכונה המסופינים השימוש שלהם בתור בעלי חיים לגילוי התרופה שלמה^16,17,18), על ידי ניצול התערבויות כימיות כדי פרמקולוגית לטפל מקרופאג פונקציה. עד כה, טיפולים תרופתי אלה נמסרו בעיקר באמצעות טבילה, אשר דורש את הסם להיות מסיסים במים, או על ידי מיקרוהזרקה ישירה של תרופה חופשית (איור 1א). מגבלות אלה אסטרטגיות מסירה פסיבית כוללים אפקטים מחוץ ליעד ורעילות כללית העלולה למנוע הערכה כל השפעה על מקרופאג function. בנוסף, כאשר חקירת תופעות התרופה על מקרופאגים זה לא ידוע אם הסמים פועלים על מקרופאגים עצמם או באמצעות מנגנונים עקיפים יותר. בעת ביצוע התערבות כימית דומה במחקרים לחקור פונקציה מקרופאג, הכרנו היה צורך לא מוכר לפתח שיטת משלוח זולה וישירה כדי למקד את התרופות במיוחד מקרופאגים.

ליפוזומים הינם מיקרוסקופיים, ביולוגיים, בעלי שומנים מיקרוסקופים, שיכולים לכמס חלבונים, נוקלאוטידים ומטענים של סמים¹⁹. מבנה השומנים הunilamellar או רב-לאמצ'יני במבנה של ליפוזומים מהווה לומן פנימי מימית שבו ניתן לשלב תרופות מסיסים במים בעוד תרופות הידרופובי ניתן לשלב בקרומים השומנים. בנוסף, המאפיינים הפיזיקליים של ליפוזומים, כולל גודל, חיוב ושינויי פני שטח ניתן לתמרן כדי להתאים את המיקוד שלהם לתאים ספציפיים^20,21. תכונות אלה של ליפוזומים עשו להם רכב אטרקטיבי לספק סמים ולשפר את הדיוק של הטיפול הנוכחי משטרי²⁰. כמו ליפוזומים הם באופן טבעי phagocytozed על ידי מקרופאגים (תכונה מנוצלת על ידי שימוש שגרתי שלהם באספקת clodronate במיוחד מקרופאגים עבור ניסויים אבלציה²²), הם מציגים כאופציה אטרקטיבית עבור משלוח סמים ספציפי מקרופאג (איור 1B).

פרוטוקול זה מתאר את הניסוח של תרופות ליפוזומים כחול פלורסנט מצופה עם הידרופילי פולימר poloxamer 188, כי צורות שכבת הגנה על ליפוכמה משטח והוכח כדי לשפר את שמירת הסמים יש ביולוגי מעולה²³. Poloxamer נבחרה לציפוי פני השטח של ליפוזומים כמו המחקר הקודם שלנו הראו כי, כאשר לעומת פוליאתילן גליקול שונה ליפוזומים, poloxamer שונה ליפוזומים הראה תאימות ביולוגית טובה יותר בעקבות הזרקה תת עורית של כפות הראש ואת פרמקוקינטיקה דומה בארנבים בעקבות עירוי אינפוזיה²³. הפרוטוקולים מתוארים גם עבור המיקרו ההזרקה שלהם לתוך זחל הדמיה חיה להעריך את היכולת המקרופאג שלהם ולוקליזציה לתאים תאיים הנחוצים ליפוכמה השפלה ומשלוח תרופות cytoplasmic. כהוכחה-of-קונספט בעבר השתמשנו בטכניקה זו כדי למקד שתי תרופות מקרופאגים כדי לדכא את ההפעלה שלהם במודל זחל דג זברה של דלקת gouty חריפה²⁴. טכניקה זו מסירת סמים מרחיבה את "ערכת הכלים" הכימית הזמינה לחוקרי דג זברה המבקשים להבטיח מקרופאג-פילוח של תרופות הריבית שלהם.

Protocol

1. הכנת ליפוזומים בסמים שנטענו על ידי מרינה בלו

הערה: ליפוזומים הנושאים את צבע הפלורסנט הכחול, מרינה כחול וסמים מוכנים באמצעות שיטת השחות הסרט דק עם החדרת ההודעה של poloxamer 188. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. ליפוזומים בקרה מעבירים. רק את מרינה בלו ו-PBS הדוגמה כאן מתארת את טעינת ליפוזומים^{עם תרופה נגד} נוגדי חמצון המיטו, המשמשת בתוצאות הנציגים כהוכחה למושג.

1. כדי להכין ליפוזומים, לפזר 16.4 mg (22.2 μpa) של פוספוליפידים 1, 2-dipalmitoyl-sn-גליקו-3- פוספולולין (ראה טבלת חומרים), 4.3 mg (11.1 μov) כולסטרול (ראה טבלת חומרים) ו-2.8 מ"ג (3.7 μמול) 1, 2-מחלת-sn-סופרנובה-3-פוספולינולינה (ראה טבלת חומרים, ב 3 מ ל של כלורופורם: מתנול (3:1 v/v) ב 25 מ"ל בקבוקון עגול.
2. לתערובת לעיל, להוסיף 31 nmol של מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-פוספוליקו-פוחואטיאנמין (ראה טבלת חומרים) ו 300 nmol של תרופה מעכב mros (ראה טבלת חומרים) ו sonicate לזמן קצר כדי להמיס במלואו. עבור ליפוזומים בקרה, רק להוסיף מרינה כחול 1, 2-dihexadecanoyl-sn-גליליקו-פוספהואטיאנאמין.
   הערה: כדי למנוע הלבנה של צבע פלורסנט מרינה כחול רגיש לאור, להגן על כל ההליכים מפני אור, היכן שניתן. דבר זה חשוב גם אם התרופה לטעינה היא תלויית-אור.
3. הסר את הממס לאט על מאייד רוטרי (ראה טבלת חומרים) על מקלחת טמפרטורה מבוקרת מים להגדיר 45 ° צ' על ידי סיבוב ב 75 סל ד תחת לחץ ואקום (200 mbar עבור 15 דקות ולאחר מכן 0 mbar עבור 20 דקות). זה יוצר סרט יבש השומנים דק בתוך קירות זכוכית של הבקבוקון כי הוא מיובש נוסף עבור 45 דקות תחת N₂ כדי להקל על ההסרה המלאה של הממס האורגני.
4. לאחר היווצרות של הסרט הדק, להגדיר את הלחץ ואקום כדי 40 mbar עבור 15 דקות, ואז לטהר עם גז חנקן עבור 30 דקות כדי להבטיח הסרה של שאריות הממס.
5. מימה את הסרט הדק באמצעות 1 מ ל של מלוחים פוספט באגירה (PBS, pH 7.4) ו חותם עם parafilm לפני הלטרוף את הבקבוקון באמצעות מאייד רוטרי מעל 60 מעלות באמבט מים במשך 20 דקות כדי ליצור שלפוחיות.
6. נושא ההשעיה להתייבש 7 מחזורים של הקפאה והפשרה על ידי הקפאת N נוזלי₂ עבור 3 דקות ואחריו טבילה באמבט מים 45 ° c עבור 7 דקות.
7. הבלטת ליפוזומים באמצעות קרום באמצעות הבלטת ממד (ראו טבלת חומרים) ו-1.0 יקרומטר ממברנות פוליקרבונט מעקב (ראה טבלת חומרים) עבור 2-6 מחזורים כדי להשיג unilamellar שלפוחיות גדולות.
   הערה: כדי להשיג התמקדות חיובית יותר כלפי מקרופאגים, לטפל מחזורים ההבלטה עד קוטר של ליפוזומים הוא כ 1 יקרומטר^26,27,28.
8. לדחוס את ליפוזומים טריים לתוך כדור על ידי מיקוד ב 186,000 x g ו-מארג עם 1 מ ל של 1% poloxamer 188 (ראה טבלת חומרים) פתרון (10 מ"ג/mL ב-PBS) ב 45 ° צ' ו 750 rpm עבור 30 דקות באמצעות thermomixer עם מצורף 2 מ"ל שפופרת מיקרוצנטריפוגה (ראה לוח חומרים).
9. Ultracentrifuge את התערובת ב 186,000 x g עבור 1 h ב 4 ° c ולהסיר את supernatant כדי להסיר פולימר או תרופה לא מאוגד. לאחסן את כדורי ליפוזומים ב -4 ° c, מוגן מפני אור.

2. אפיון ליפופי גודל ופוטנציאל זטה

1. לדלל ליפודי ניסוח עם מים באולטרסאונד (1:100) ולמדוד את גודל החלקיקים, המדד הפולידיפיטיות (PDI) ו זטה פוטנציאל של ליפוזומים באמצעות מנתח פיזור אור דינמי (ראה טבלת חומרים), בטריליפיאט ב -25 ° c.
   הערה: ה-PDI הוא מדד לפיזור הגודל של האוכלוסיה הננו-חלקיק. ערכי PDI < 0.05 מציין התפלגות אחידה יותר בעוד שהערכים הקרובים ל-1 מצביעים על התפלגות גודל גדולה יותר. פוטנציאל הזטה הוא. המטען הכולל של השטח

3. חישוב יעילות מלכודת והעמסה של סמים בליזומים

הערה: כדי לקבוע את יעילות המלכוד של התרופה ליפוזומים, תכולת התרופה הכלולה בסופרנטאנט וליפוכי הגלולה נמדדת.

1. להשעות את הגלולה בתוך 1 מ ל של PBS.
2. מסירים את הסופרנטאנט, מדלל 10 x עם מים באולטרטהורים ומנתחים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים.
3. כדי לקבוע את ריכוז התרופה בתוך ליפוזומים, להוסיף 100 μL של ליפוכי ההשעיה כדי 900 μL של 10% טריטון-X100 פתרון (כדי להרוס את קרום השומנים, שחרור התרופה לכוד ומניעת השומנים לבנות בתוך העמודה ולאחר מכן) ומערבולת עבור 3 דקות לפני הניתוח.
4. הכנס 20 μl של מדגם לתוך מערכת המערכת המורכבת של משאבת הרביעון, התרמוסטט אוטומטי-דוגם ו 3 יקרומטר 250 x 4.6 mm עמודה. הגדר את השלב הנייד (10 mM PBS pH 2.5, acetonitrile ו מתנול (30:40:30, v/v/v)) שיעור הזרימה 0.9 mL/min ולהשיג פרופילים ספקטרליים באמצעות גלאי מערך דיודה להגדיר ב 230 mM.
5. לחשב את יעילות מלכודת (הנדסת חשמל) והעמסת סמים (DL) באמצעות המשוואות הבאות:
   EE (100%)
   DL (100%)
   כאשר אני המסה של התרופה המאסיבית, Mt הוא מסה כוללת של התרופה המשמשת במהלך ניסוח ו-Mlip הוא מסה כוללת של השומנים (כולל כולסטרול) ותרופות שעברו אנקפסולציה.

4. הכנה והזרקה של ליפוזומים

1. הכנת בורוסיליקט מחטים מיקרו הזרקה על ידי החדרת הקיר דק בורוסיליקט זכוכית נימי (1 מ"מ מנת יתר x 0.78 מ"מ זיהוי x 10 ס מ אורך) לתוך מכשיר פולר מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים) עם הגדרות הפולר הגנרית הבאים (חום 680, משוך 75, מהירות 40, זמן 55 ולחץ 530)
2. מניחים את המחטים לתוך צלחת פטרי על חימר הדוגמנות ולסדר בדרך כי הסיום הוא לא נוגע בתחתית המנה. שמרו על מכסה הצלחת פטרי סגור כדי למנוע זיהום אבק עד שהוא מוכן לשימוש.
3. לדלל טרי-מוכן ליפוכמה ניסוחים 1:1 ב-PBS סטרילי (pH 7.4) ובקצרה מערבולת (2-3 s) כדי לערבב.
   הערה: הגנו על ליפוזומים מהאור עד שהזחלים יהיו מוכנים להזרקה.
4. כוונן זוגות מבוגרים של הרבייה דגים בלילה לפני ולאסוף את העוברים כפי שתוארו בעבר על ידי רוזן ואח '²⁹.
5. להעביר את העוברים לתוך צלחת פטרי (100 מ"מ x 20 מ"מ בסגנון עם כ 60 עוברים לכל מנה) המכיל E3 בינוני (5 מ"מ הנאגל, 0.17 מ"מ KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 Mm MgSO₄) שיושלם עם 0.1% מתילן כחול לעכב צמיחה פטרייתיים. הסירו את כל העוברים המתים או הבלתי מופרות במשך הלילה ב-28.5 ° c.
6. כדי להקל על הדמיה חיה, להוסיף 0.003% N-פניylourea (ptu) לתוך E3 מדיה כאשר העוברים להגיע 24 h של פיתוח כדי למנוע היווצרות פיגמנט (מלאניזציה).
7. באופן ידני לביטול העוברים ב כ 30 h הפריה הפוסט (hpf) באמצעות מלקחיים טיפ עדין.
   הערה: אין להשתמש בטיפול אנזימטי לעוברי הדאוורגון, העלולים לגרום נזק לאפיתל ולדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.
8. תנו לעוברים להתפתח ב-28.5 ° צ' עד 2 ימים לאחר ההפריה (dpf).
9. להכין צלחת זריקה על ידי שפיכת 3% מתיל תאית (ב E3 מדיה) לתוך המכסה של מאכל קטן 35 mm התרבות כדי ליצור סרט דק המכסה את המשטח כולו.
   הערה: בעת הכנת 3% מתיל תאית ב E3 מדיה, זה לוקח כמה ימים עבור מתיל תאית להתמוסס עם עצבנות עדינה על שייקר מסלולית.
10. הרדים הזחלים על ידי דגירה ב E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.
11. לאסוף בריכה של כ 20-25 הזחלים באמצעות פיפטה העברה פלסטיק ולאפשר לעוברים להתרכז בקצה של הפיפטה על ידי כוח הכבידה. מטפל להעביר את הזחלים עם נוזל מינימלי, למקם אותם באמצע המכסה של מכסה התרבות 35 מ"מ.
12. באמצעות מטעין מיקרונימי, לסדר את הזחלים בדרכים הבאות: קדמית לקראת החלק העליון של צלחת ההזרקה עם המשטח הקדמי פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה, כדי להזריק לתוך החדר הקדמי המוח (איור 2a-D); או, הקדמי לכיוון שמאל של לוחית ההזרקה (בעת הזרקת מימין) עם המשטח הגחוני פונה לכיוון המחט מיקרוהזרקה כדי להזריק לתוך venosus הסינוס (איור 2I).
    הערה: כאשר מוזרק בדרך זו, המוח השחדר לחדר-תושב (איור 2E) ו הרקמה המטודתית (CHT)-תושב (איור 2J) מקרופאגים ניתן לפלח, בהתאמה. אזור הCHT של הזחל הוא אתר המטפטי הדומה לכבד העוברי של היונקים. לשים לב בנוסף לא לפגוע העוברים תוך הסדרת כי זה עלול לגרום לדלקת מקומית ובכך להשפיע על לימודים אימונולוגיים.
13. לקחת ליפוזומים טרי (משלב 4.3) ובחזרה למלא מחט הזריקה עם כ 5 μL של ליפוכמה לערבב הזרקה באמצעות מטעין מיקרונימי (ראה טבלת חומרים).
    הערה: בעת הערכת הלוקליזציה של ליפוזומים לתאי phagolysoזומאים של מקרופאגים (איור 2H), תוספת זו לערבב הזרקה עם 200 μg/mL של סמן פלורסנט אדום של phagoזומים (ראה טבלה של חומרים) ו 100 nM של סמן פלורסנט אדום רחוק של lysosomes (ראה טבלת חומרים) כדי לסמן phagoזומים^30,31 ו lysosomes³², בהתאמה.
14. טעינת המחט לתוך מיקרומניפולציה (ראו טבלת חומרים) המחוברת למעמד מגנטי ומזרק ללחץ (ראו לוח חומרים). מיקום תחת stereomicroscope ולהגדיר את מזרק על משך הדופק של כ 50 ms ו לחץ הזרקה של כ 40 psi.
15. חותכים את הקצה של המחט מיקרוהזרקה עם מלקחיים משובחים בסדר תשר כדי ליצור פתיחה של כ 5 יקרומטר קוטר.
16. כיול את עוצמת הקול המוזרקת על-ידי הזרקת מנת ההזנה לתוך טיפה של שמן מינרלי הממוקם מעל קווי הרשת של הומוציטוטומטר. כוונן את משך הפעימה ו/או לחץ ההזרקה עד שקוטרו של ההזנה מכסה 2.5 של קווי הרשת הקטנים ביותר (זה מתאים לנפח של כ-1 nL).
17. בזהירות להזריק 1 nL של ליפוכמה לערבב הזרקה לתוך החדר המוח השמאלי של כל הזחלים.
    הערה: כאשר מזריקים לחדר האחורי של המוח האחורי, יש לדאוג לא לחדור מרחוק מדי (מעבר לראש המוח), שכן הדבר עלול לשבש את היסוד המוביל לדימום. כאשר מזריקים לתוך venosus הסינוס, יש לנקוט כדי להבטיח את קצה המחט הוא רק בתוך קרום הלב ולא חודר את החלמון.
18. לאחר ההזרקה, העבר מיד את הזחלים המוזרקים חזרה לתוך E3 מדיה על ידי הוספת E3 מדיה לצלחת ההזרקה בעדינות להפוך את הזחלים מתוך התאית מתיל באמצעות פיפטה העברה פלסטיק.
19. מודגנת את הזחלים ב 28.5 ° צ' (מוגן מפני אור) עד לניתוח על ידי הדמיה מיקוד חי.

5. הדמיה confocal וקד וניתוח תמונה כדי לאשר מקרופאג פילוח של ליפוזומים

1. מחממים אמבט מים עד 50 ° c.
2. הרדים ליפופי מוזרק הזחלים על ידי העברת תבשיל Perti חדש המכיל E3 מדיה בתוספת 0.003% PTU ו 200 μg/mL Tricaine.
3. להכין הדמיה חיה הרכבה בינונית על ידי המסת 1% התכה נמוכה agarose ב E3 מדיה, שיושלם עם 0.003% PTU, במיקרוגל. מקום באמבט מים ופעם הפתרון מקורר 50 ° c, להוסיף 200 μg/mL של Tricaine.
4. שמרו על מדיום ההרכבה באמבט המים 50 ° c כדי למנוע פילמור מוקדם של הצמח.
5. כדי לדמות את המשטח החלק הפנימי של המוח השטרם על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד מצויד בעדשה טבילה מים (איור 2E), להטביע את הזחלים כדלקמן: למלא את הגידול 35 mm עם בינוני הרכבה (לעומק של כ 5 מ"מ) ולתת לו לפולימו. חפירת תעלה קטנה ב-agarose, כי הוא בגודל מספיק כדי להכיל את שק החלמון.
6. מילוי פיפטה להעברת פלסטיק עם מדיום הרכבה מותכת, לגרש כמות קטנה, ולהשתמש בו כדי לאסוף את הזחלים רדימים. העבירו מיד את הזחלים לתוך קערת התרבות, והפכו את שקי החלמון למטה, לתוך החורים שנחפרו, בעזרת מטעין מיקרונימי. מדי פעם שומרים אותם בתנוחה הזאת עד שהוא התעורר. כיסוי עם E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL Tricaine.
   הערה: בעת העברת ומיקום הזחלים, לדאוג לא לגרום נזק אפיתל ודלקת מקומית אשר יכול להשפיע על לימודים אימונולוגיים. לצורך מיקום הזחלים לחיות תמונה באזור CHT (איור 2J), הר כפי שמתואר לעיל, אלא למקם את הזחלים בתוך החור שנחפר בחפירות.
7. כאשר הדמיה על המיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, להטביע את הזחלים, ללא מיטה agarose, ישירות על החלק התחתון של הצלחת התחתונה זכוכית. מסדרים אותם למטה (או מתחת למים) ובעקבות הפלמור, כסו את משטח הכלים כולו עם שכבה אפילו של מדיום. לאחר הפילמור, להוסיף שכבה דקה של E3 מדיה בתוספת עם 200 μg/mL של Tricaine.
8. כדי לחיות את התמונה החדר השמאלי המוח על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד, להשתמש בהגדרות הבאות: 512 x 512 פיקסלים; 40 x 3 יקרומטר Z-ערימות (הארכת מן המשטח הפנימי ביותר של המוח המוחלק); המטרה 20x; 2.5 x זום.
   הערה: בעת השוואת עוצמות האות בין דגימות (לדוגמה, בעת הדמיה של קליטת ליפוזומים מרינה כחול המוזרקים בתוך קווי הכתב לסמן את מקרופאגים [Tg (mpeg1: egfp)³³] או נויטרופילים [Tg (lyz: egfp)³⁴]), חיוני כי הגדרות לייזר נשמרות זהה (למשל, בקוטר חריר, מתח לייזר, היסט ולהרוויח) כדי לסייע להבטיח כל הבדלים אינם פריט של הגדרות רכישת תמונה משתנה.
9. השתמש 3D ניתוח תמונה התוכנה כדי לכמת מקרופאג או הספיגה נויטרופילים של מרינה כחול התווית ליפוזומים. כדי לכמת את מספר התאים המכילים ליפוזומים (איור 2F) בתוך z-מחסנית, לגלול בסעיפים z בודדים ולספור את מספר התאים הבודדים המכילים ליפוזומים מרינה כחול התווית. כדי לכמת את העוצמה הפלואורסצנטית של ליפוזומים בתוך תאים (איור 2G), לצייר אזור של עניין סביב כל תא (ב X, Y ו-Z ממדים) כדי לכמת את העוצמה הכוללת או מתכוון הזריחה של מרינה כחול תאיים.

תוצאות

הגישה של הסרט הדק המתואר כאן להכנת ליפוזומים פלורסנט התרופה התוחמת היא שיטה פשוטה וחסכונית. עם הפרוטוקול המשמש במחקר זה, היפוזומים צפויים להיות unilamellar^23,24. הגודל, פוטנציאל זטה, העמסה של סמים ויעילות מלכודת של ליפוזומים המיוצרים מסוכמים בטבלה 1. גודל ...

Discussion

כאן, סיפקנו פרוטוקול מפורט כדי לנסח ליפוזומים בסמים שנטענו למטרה במיוחד מקרופאגים בזחל החוצה. שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח את התפקיד של מקרופאגים במודלים של מחלות מסוימות על ידי הבטחת מסירת ממוקדות ישירה של תרופות במיוחד מקרופאגים. כמו-כן, ניתן להשתמש בה כאשר רעילות כללית של סמים מגבילה את ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850355P
1,2-diseteroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPE)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850367P
1.0 µm Whatman Nuclepore Track-Etched polycarbonate membranes	GE Healthcare Life Sciences	110610
25 mL round-bottom flask	Sigma-Aldrich	Z278262
35 mm culture dish	Thermo Scientific	150460
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	34998
Agilent 1260 Infinity Diode Array Detector	Agilent Technologies	G4212B
Agilent 1260 Infinity Quaternary Pump	Agilent Technologies	G1311B
Agilent 1290 Infinity Series Thermostat	Agilent Technologies	G1330B
Avanti mini-extruder Avanti Polar Lipids Inc.	Avanti Polar Lipids Inc.
borosilicate microinjection needles	Warner Instruments	203-776-0664
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901-100G
cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Dumont No.5 fine tip forceps	Fine Science Tools	11251-10
Eppendorf Microloader pipette tip	Eppendorf	5242956003
Eppendorf SmartBlock 1.5 mL, thermoblock for 24 reaction vessels	Eppendorf	4053-6038
eyelash manipulator	Ted Pella Inc.	113
hemocytometer	Hawksley	BS.748
HEPES	BDH Chemicals	441474J
HPLC system	Agilent Technologies	1260 series HPLC system
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1KG
low melting point agarose	Invitrogen	16520-100
LysoTracker Deep Red	Invitrogen	L12492	1 mM stock solution in DMSO, keep at -20 °C and protect from light.
LysoTracker Deep Red	Thermo Scientific	L12492
magnetic stand	Narishige	GJ-1
Marina Blue 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-phosphoethanolamine (Marina Blue DHPE)	Invitrogen	M12652	Keep at -20 °C and protect from light.
Methanol	Sigma-Aldrich	34860
methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M0387-500G
methylene blue	Alfa Aesar	42771
MgSO4	Sigma-Aldrich	230391-500G
micromanipulator	Narishige	M-152
mineral oil	Sigma-Aldrich	M-3516
Mitochondria-targeting antioxidant MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737
MitoSOX Red Mitochondrial Superoxide Indicator	Thermo Scientific	M36008
MitoTEMPO	Sigma-Aldrich	SML0737	Keep at -20 °C and protect from light.
N-Phenylthiourea (PTU)	Sigma-Aldrich	P7629-10G	Take care when handling, toxic.
NaCl	BDH Chemicals	27810.295
PBS (pH 7.4)	Gibco	10010-023
Petri dish (100 mm x 20 mm)	Corning Inc.	430167
Phenomenex C18 Gemini-NZ 3 mm 250 mm x 4.6 mm column	Phenomenex	00G-4439-E0
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Thermo Scientific	P35361
pHrodo Red Escherichia coli BioParticles Conjugate	Invitrogen	P35361	Keep at -20 °C and protect from light. Make 1 mg/mL stock solution by dissolving 2 mg lyophilized product in 2 mL of PBS supplemented with 20 mM HEPES, pH 7.4.
plastic transfer pipette	Medi'Ray	RL200C
poloxamer 188	BASF Corporation
pressure injector	Applied Scientific Instruments	MPPI-2
rotary evaporator	Büchi, Flawil, Switzerland	Büchi R-215 Rotavapor
Scanning confocal microscope	Olympus	Olympus FV1000 FluoView
Sorvall WX+ Ultracentrifuge	Thermo Scientific	75000090
stereomicroscope	Leica	MZ12
Tricaine	Sigma-Aldrich	A5040-25G	Make 4 mg/mL stock solution (in deionzed H2O) and keep at -20 °C.
triton-X100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Ultrasonic bath	Thermo Scientific	FB-11205
Volocity Image Analysis Software	PerkinElmer	version 6.3
water bath
Zetasizer Nano	Malvern Instruments Ltd	Zetasizer Nano ZS ZEN 3600