JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتصور ثلاثي الابعاد للهياكل النسيجية المجهرية باستخدام طريقه تلطيخ محدده للاشعه السينية مصممه للتصوير المقطعي المحوسب بالاشعه السينية.

Abstract

ونحن نظهر طريقه المختبر القائم علي الجمع بين ميكروكت الاشعه السينية و nanoCT مع محدده الاشعه السينية وصمه عار, التي تستهدف سيتوتوبلاسما الخلية. البروتوكول الموصوف سهل التطبيق ، سريع ومناسب لعينات الانسجه الرخوة الأكبر. وتتيح المنهجية المعروضة توصيف الهياكل الحيوية للانسجه في ثلاثه ابعاد وتظهر في كليه الفئران بأكملها. يسمح المقاربة [مولتيسكل] ان صوره الكاملة فاره كليه ويساند الانتقاء من حجوم بعيده فائده, اي يكون اكتسبت مع قرارات [هيغر] يتراوح داخل ال [نمتر] مدي. التالي ، فان شكل الانسجه الرخوة مع مستوي مماثل من التفصيل كما يتم استنساخ الصور المجهرية الضوء النسيجي المقابلة. يتم تحقيق رؤى أعمق في التكوين 3D من هياكل الانسجه دون عرقله المزيد من التحقيقات من خلال أساليب النسيجية.

Introduction

التوصيف الكامل لعينات الانسجه الرخوة يتطلب معلومات حول البنية المجهرية للانسجه ثلاثية الابعاد. المعيار الذهبي الحالي للتحليلات عينه الانسجه الرخوة هو التشريح. يتم استكشاف الانسجه والمورفولوجية الخلوية للعينه في 2D داخل مناطق مختاره من الفائدة (ROIs) باستخدام المجهر الضوئي1. هذا الأسلوب ، ومع ذلك ، لديه العديد من العيوب. اعداد العينة مضيعه للوقت ومعقده ومدمره وعرضه للتحف. تقدم الشرائح المجهرية المنتجة فقط معلومات ثنائيه الابعاد موازيه للطائرة التي يتم التزويد بها. غالبا ما يكون عدد الأقسام النسيجية ، التي يتم التحقيق فيها ، مقيدا بسبب ضيق الوقت2،3.

في السنوات الاخيره ، وقد تطورت في مجال الانسجه 3D. هنا ، يمكن الوصول إلى شرائح الانسجه الظاهرية من اي طائره المكانية المطلوبة. وهذا يسمح لتتبع الهياكل في جميع انحاء العينة ، مما يؤدي إلى فهم أعمق للهندسة النسيج 3D والتغييرات الهيكلية المرتبطة بالامراض المختلفة. وقد تم تطوير أساليب مختلفه لتحقيق توليد البيانات حجم 3D. وهي تتراوح من النهج التسلسلي القائم علي القسم ، والتي تستخدم اما الضوء أو المجهر الكترون4،5،6،7،8، إلى طرق التصوير كتله الوجه ، مثل ابيسكوبيك 3d التصوير أو كتله الوجه مسح الكترون المجهر7،8،9. ومع ذلك ، فان جميع الأساليب المذكورة تنطوي اما علي التماس العينة أو تدميرها تماما ، مما لا يسمح باجراء مزيد من التحقيقات. القرار الذي تم الحصول عليه يعتمد بشكل كبير علي عمليه التقسيم كونها عرضه للتحف كما هو موضح في الانسجه التقليدية. هذه الأساليب تعاني أيضا من التحف المحاذاة.

وتطمح تقنيات التصوير بالاشعه السينية ثلاثية الابعاد مثل الصور المقطعية المجهرية والنانوسكوبيكه (microCT و nanoCT) إلى توليد بيانات ثلاثية الابعاد عاليه الدقة دون تدمير عينه الانسجه. وحتى الآن ، فان التباين الضعيف في التوهين بالاشعه السينية للانسجه الرخوة ومحدوديه الوصول إلى القرارات العالية في بيئة مختبريه قد أعاق استخدامها لتصور ثلاثي الابعاد لهياكل الانسجه المجهرية. والتقدم الذي أحرز مؤخرا في التصوير المقطعي المحوسب للاشعه السينية المستند إلى المختبرات يسمح باتخاذ قرارات اقل بكثير من 1 μm10و11و12و13.

ويعوض عدم وجود تباين في الانسجه الرخوة في التصوير بالاشعه السينية التقليدية التي تستند إلى التوهين بعوامل تلطيخ ، مما يعزز تباين التوهين بالاشعه السينية. وغالبا ما تستخدم عوامل تلطيخ المعروفة من تقنيات التصوير الأخرى مثل الاوزميوم أكسيد (اوسو4) ، يوديد اليود البوتاسيوم (IKI) أو حمض فوسففوتونجوتيك (PTA)14،15،16،17، 18،19،20،21،22،23،24،25. عوامل تلطيخ التي تسمح ل ' 1 ' الاستهداف البيولوجي المحدد ، ' 2 ' التلطيخ المتجانس والكامل ، ' 3 ' سهوله المناولة ، ' 4 ' التغلغل السريع للانسجه دون إنشاء قطع أثريه مثل حلقات النشر ، ' 5 ' تلطيخ الانسجه الكبيرة والكثيفة ، و ' 6 ' التوافق الكامل مع علم الأورام مطلوب لإنشاء CT الاشعه السينية كاداه لتصور 3D من هياكل الانسجه المجهرية. في هذا العمل ، ونحن نظهر كيف يتم اعداد عينات الانسجه الرخوة للتصوير بالاشعه السينية التصوير المقطعي المحوسب مع وصمه السينية الخاصة بالاشعه السينية علي أساس يوزين التي تفي بالمتطلبات المذكورة أعلاه26.

ويضمن نهج التصوير المتعدد المقاييس تقييم جوده التلطيخ من خلال القياس العام للقياس المجهري واختيار احجام الفائدة (VOIs) لاجراء مزيد من التحقيقات العالية الدقة. يتم تحليل نوعيه تلطيخ التركيز علي المعلمات تلطيخ مثل (ط) اكتمال ، ' 2 ' ظهور حلقات الانتشار ، ' 3 ' تعزيز التباين ، ' 4 ' ظهور القطع الاثريه CT مثل الشرائط و (5) التجانس. الاعداد nanoct المستندة إلى المختبر, الذي يستخدم التكبير هندسية للوصول إلى القرارات وصولا إلى 100 nm, تصور المورفولوجية الانسجه الرخوة علي (sub)-مستوي الخلوية10,27. التحليل المقارن لشرائح nanoCT مع الصور المجهرية المجهر الضوئي المقابلة يؤكد استنساخ الهندسة المعمارية الانسجه مع التفاصيل مماثله علي المستوي المجهري في 2D ، وتمكين توصيف الانسجه النسيجية عينه. ويهدف هذا البروتوكول الفيديو مفصله لرفع مستوي الوعي وتسليط الضوء علي إمكانات هذه المنهجية كاداه غير مدمره 3D التصوير الانسجه الرخوة التي تهم المجتمع العلمي واسعه مثل علماء الاحياء وعلماء الاحياء والصحة المهنيين.

Protocol

تحذير: يرجى مراجعه جميع أوراق بيانات سلامه المواد ذات الصلة (مسدس) قبل الاستخدام. العديد من المواد الكيميائية المستخدمة في البروتوكول هي سميه حاده ومسرطنه. يرجى استخدام جميع ممارسات السلامة المناسبة عند تنفيذ بروتوكول تلطيخ بما في ذلك استخدام الضوابط الهندسية (غطاء الدخان ، glovebox) ومعدات الحماية الشخصية (نظارات السلامة ، والقفازات ، ومعطف المختبر ، والسراويل طول كامل ، والاحذيه المغلقة اصبع القدم).

الحيوانية المستخدمة:
وأجريت المساكن الحيوانية في مستشفي rechts der Isar ، الجامعة التقنية في ميونيخ وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي 2010/63. وتمت الموافقة علي أزاله الأعضاء من لجنه داخلية لحماية الماشية في كلينوم ريتشتس دير ايسار ، ميونيخ ، ألمانيا (الرقم المرجعي الداخلي 4-005-09). وكانت جميع الإجراءات متفقه مع المبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. ويتم تفتيش جميع المختبرات وفقا لمبادئ المنظمة المتعلقة بالممارسات المختبرية الجيدة.

1. eosin تلطيخ البروتوكول

  1. إلى يحملق عينات الانسجه الرخوة ، وملء أنبوب الطرد المركزي 50 ml مع حل يحملق التي تحتوي علي 9.5 ml من 4 ٪ (v/v) حل الفورمالديهايد (FA) و 0.5 ml من حمض الخليك الجليدية (AA).
    ملاحظه: اعداد حل FA طازجه من 37 ٪ حمض الحل FA الحرة استقرت مع تقريبي 10 ٪ الميثانول. تمييع الحل FA أكثر مع الفوسفات دولبيكو المحلول الملحي المخزنة (DPBS). اختر DPBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم. الحفاظ علي حل FA المخفف لم يعد من شهر واحد. خلال تحمض الأس الهيدروجيني للحل المثبت هو تغيير من محايد إلى ما يقرب من 3.
    تحذير: لان FA هو الجهاز الحاد السامة والمسببة للتاكل والمسرطنة ، واستخدام غطاء الدخان إلزامي ويجب استخدام المعدات الشخصية الواقية المناسبة.
    1. أضافه الطازجة أزاله عينه من الانسجه الرخوة إلى أنبوب الطرد المركزي 50-mL وتبريد أنبوب الطرد المركزي 50-mL ل 24-72h.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
    2. اغسل عينه الانسجه الرخوة بمحلول DPBS لمده 1 ساعة.
  2. لتلطيخ عينه الانسجه الرخوة المثبتة (علي سبيل المثال ، كليه ماوس كامله) ، ضع الانسجه الرخوة في 2 مل من محلول ايوسين Y-تلطيخ واحتضان العينة ل 24 ساعة. إبقاء العينة علي لوحه اهتزاز أفقي لهزاز علي نحو سلس (60 دوره في الدقيقة) اثناء الحضانة عمليه.
    ملاحظه: الحل يوزين Y-تلطيخ لديه تركيز 30 ٪ (ث/ف) في الماء المقطر. اختيار حجم الحل تلطيخ في مثل هذه الطريقة التي يتم تغطيتها تماما العينة من قبل حل تلطيخ والسماح للعينه للتحرك بحريه داخل حاويه العينة. وقد يختلف وقت الحضانة بالنسبة للعينات الأخرى ويجب تعديله وفقا لذلك.
  3. بعد تلطيخ ، وأزاله عينه من الانسجه الرخوة بعناية من حاويه العينة.
    1. أزاله الزائدة بعناية من عامل تلطيخ مع ورقه الانسجه السليلوز.
    2. ضع عينه الانسجه الرخوة في حاويه عينه مخروطيه فوق مرحله بخار الايثانول للتخزين والاستخدام الإضافي.
      ملاحظه: حاويه عينه مخروطيه يجب ان تحتوي دائما علي بضع قطرات من 70 ٪ (v/v) الايثانول في الجزء السفلي من الأنبوب للحفاظ علي الانسجه الرخوة عينه رطبه ومنع التحف.

2. الاشعه السينية ميكروكت التصوير

ملاحظه: أجريت قياسات ميكروكت الاشعه السينية مع ماسح مجهري ، والذي يقدم القياسات المقطعية العامة (القدرة علي تصوير العينة بأكملها في مجال الرؤية) وأداء قياسات الاشعه المقطعية عاليه الاستبانة (القدرة علي التركيز في علي واحده الحجم المطلوب من الفائدة (VOI) من عينه نفسها) وصولا إلى 1 μm.

  1. تركيب عينه الانسجه الرخوة علي حامل عينه مناسب. ضمان نوبة ضيقه من العينة علي حامل العينة لمنع العينة من التحرك اثناء قياسات الاشعه السينية CT.
    1. في حاله الكلي الماوس الملون: اعداد حامل عينه مع اثنين من أنابيب الطرد المركزي ، حيث يتم قطع الجزء السفلي من أنبوب واحد قباله. الغراء اثنين من أنابيب الطرد المركزي معا باستخدام اثنين من مكون لاصق. ضمان محاذاة مستقيمة من أنابيب الطرد المركزي حول محور الدوران. انتظر حتى تتصلب اللاصقة.
    2. مره واحده حامل العينة جاهزه للاستخدام ، ونقل الكلي الماوس في أنبوب الطرد المركزي سليمه ، والذي يحمل بضع قطرات من 70 ٪ (v/v) الايثانول في الجزء السفلي من الأنبوب.
      ملاحظه: استقرار العينة أمر حاسم. يستغرق وقتا طويلا لاعداد العينة لقياسات الاشعه السينية CT. يتم الحفاظ علي عينه من الانسجه الرخوة علي مرحله بخار الايثانول للحفاظ علي عينه رطبه خلال قياسات الاشعه السينية CT ومنع عينه من الانسجه الرخوة من انكماش وغيرها من التحف. وينبغي الا تكون عينه الانسجه الرخوة علي اتصال بالمذيب لتفادي تراكم المذيب حول العينة اثناء قياس الاشعه المقطعية السينية ، مما قد يؤدي إلى حركه عينه اثناء القياس أو قد يسبب مشاكل اثناء أعاده البناء. إذا كان صاحب العينة لا يسمح لعقد المذيبات في الجزء السفلي ، ورقه السليلوز مبلل مع 70 ٪ (v/v) الايثانول يمكن وضعها في حامل العينة. وتجدر الاشاره إلى انه لم يلاحظ انكماش القطع الاثريه بسبب الايثانول المذيب.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. بعد المحاذاة الدقيقة للعينه ، اختر معلمات الاستحواذ للحصول علي أفضل جوده للصورة. في حاله البيانات microCT المقدمة ، والحصول علي المسح الضوئي في ذروه الجهد من 50 kV ، وهو تيار من 3.5 W باستخدام التوقعات 1601 موزعه علي قدم المساواة علي 360 °.
    ملاحظه: تم اختيار معلمات الاستحواذ للمسح المقطعي العام للحصول علي أفضل جوده للصورة. علي هذا النحو تم اختيار الهدف الكاميرا 0.39 x لتغطيه العينة بأكملها داخل مجال الرؤية (فوف). وقد ادي ذلك إلى حجم البكسل الفعال بمقدار 12 ميكرومتر. الوقت التعرض لل 2 s لكل إسقاط قدم اشاره جيده إلى نسبه الضوضاء. تم تحديد عائد الاستثمار للمسح المقطعي المحوسب عالي الاستبانة باستخدام بيانات microCT من فحص النظرة العامة. غالبا ما تتضمن ماسحات MicroCT أداه برمجيه متكاملة ، والتي تسمح بالاختيار الدقيق لعائد الاستثمار المحدد. للبيانات المقطعية عاليه الدقة ، تم اختيار هدف الكاميرا 4x مما ادي إلى حجم البكسل الفعال 3.3 μm. وفي هذا الصدد ، كانت هناك حاجه إلى فتره تعرض تبلغ 15 ثانيه لكل إسقاط.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  3. بعد الحصول علي بيانات الاشعه السينية ، ومعالجه الإسقاطات وفقا لذلك لأعاده بناء حجم 3D. في حاله البيانات microCT المقدمة: أعاده بناء بيانات الاشعه السينية المقطعية مع البرمجيات المتكاملة.
    ملاحظه: تم إنشاء الأداءات الحجمية لبيانات microCT المبينة في الشكل 1 والشكل 2 باستخدام برنامج تصوري.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

3. الاشعه السينية nanoCT التصوير

ملاحظه: تم تطوير الماسح الضوئي nanoCT الاشعه السينية في الخزينة. وقد تم تجهيز اله العدسة الحرة مع مصدر الاشعه السينية nanofocus وكاشف العد الفوتون واحد. ويمكن إنشاء البيانات 3D مع قرارات وصولا إلى 100 nm10. بشكل عام ، أنظمه nanoCT بما في ذلك تلك مع البصريات الاشعه السينية متاحه تجاريا ولا تقتصر علي الماسح الضوئي nanoCT وصفها.

  1. NanoCT اعداد عينه
    1. اعداد VOIs من عينه الانسجه الرخوة. قطع الانسجه الرخوة إلى قطع صغيره جدا من حوالي 0.5 mm طول الحافة باستخدام مشرط ومجسم فراغي. في حاله الكلي الماوس: قطع الكلية الماوس إلى نصفين علي طول أطول محور. تاخذ نصف الكلي الماوس واعداد المناطق التشريحية المختلفة مثل القشرة الكلوية والنخاع الكلوي.
      ملاحظه: تم نقل النصف الآخر من الكلي الماوس إلى هيستواثولوجي ، حيث تم تضمين العينة في البارافين ومعالجتها وفقا لذلك لإنتاج المقاطع النسيجية نموذجيه كما راينا في الشكل 3ج والشكل 3د .
    2. نقل القطع الصغيرة قبل أول خطوه الجفاف إلى طبق بيتري جديد ، حيث انها تبقي لجميع الخطوات اللاحقة.
    3. ديهيدرات العينات باستخدام تركيزات (جميع v/v) في ٪: 50 ، 60 ، 70 ، 80 ، 90 ، 96 و 100 الايثانول متوازنة مع الماء المقطر. تنفيذ كل خطوه الجفاف لمده 1 ساعة لكل منهما.
      ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. الحفاظ علي قطع الانسجه الصغيرة في 100 ٪ الايثانول بين عشيه وضحيها.
    4. نقطه حرجه جافه ([ب]) الصغيرة نسيج قطعات.
      ملاحظه: تطبيق وثيقة البرنامج القطري تمكن من الجفاف الكامل للعينه الانسجه عن طريق تبادل المذيبات (هنا الايثانول) مع وكيل التجفيف (هنا CO2). وقد كان هذا ضروريا لضمان ان العينة يمكن تركيبها علي أصحاب العينة من nanoCT ، لا تتحرك اثناء القياس ويمكن وضعها قريبه جدا من مصدر الاشعه السينية للسماح للتكبير أفضل هندسية. يعتمد اعداد nanoCT علي مجرد التكبير الهندسي ، حيث يتم تعريف عامل التكبير علي انه المسافة بين المصدر والكاشف علي مسافة المصدر إلى العينة. قدمت تقنيه التجفيف لأول مره من قبل أندرسون للحفاظ علي هيكل 3D من العينات البيولوجية لمجهر الكترون28. يتم توفير نظره عامه علي هذه التقنية من قبل براي29.
      1. قبل ملء غرفه فراغ مع 100 ٪ الايثانول. انقل قطع الانسجه الصغيرة إلى كبسوله صغيره مساميه ووضعها في غرفه الفراغ في وثيقة الخدمة القطرية. اغلق النظام.
        ملاحظه: بما ان الضغط العالي يشارك في عمليه الوثيقة القطرية ، فان ضمان سلامه جميع أجزاء وثيقة العمل القطرية ، ولا سيما التجهيزات ، وإغلاق النظام بشكل سليم.
      2. تبرد الغرفة إلى 6-8 درجه مئوية وتملا مع السائل CO2.
      3. اثناء التحريك ، انتظر 3 دقائق للسماح بالمزج المناسب للمكونين. استنزاف الغرفة بعناية. تاكد من ان حامل العينة لا يزال مغطي بالمذيبات. كرر هذه الخطوة عشر مرات للسماح بالاستبدال الكامل للايثانول مع CO2 داخل العينة.
      4. بعد الملء النهائي للغرفة مع CO2، تسخين الجهاز إلى نقطه حرجه من co2 (31 درجه مئوية و 73.8 bar) تليها الإفراج بطيئه جدا من co2 الغازية علي مدي فتره 30 دقيقه.
        ملاحظه: يجب القيام بالإفراج عن الغاز ببطء شديد والا يمكن ان تتشكل المياه الكثيفة علي العينة. تاكد من ان درجه الحرارة لا تنخفض تحت نقطه حرجه من CO2. فقط فتح جهاز الوثيقة القطرية عندما تم الإفراج عن جميع الضغط من النظام.
      5. أزاله قطع الانسجه الوثيقة القطرية بسرعة من الجهاز والاحتفاظ بها في طبق بيتري الجديدة المخزنة في المجفف قبل المزيد من الاستخدام.
        ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  2. تركيب قطع الانسجه الخاصة بالوثيقة القطرية علي حامل عينه مناسب. ضمان نوبة ضيقه من العينة علي حامل العينة لمنع العينة من التحرك اثناء القياسات المقطعية. في حاله الأجزاء الانسجه الكلي الماوس الكلية: الغراء قطع الانسجه مع الغراء إلى حامل العينة.
    ملاحظه: اي حركه غير مرغوب فيها من العينة خلال القياسات المقطعية يمكن ان يسبب مشاكل اثناء أعاده البناء حجم-خاصه عند الحصول علي مجموعه بيانات مع حجم فوكسيل نانومتر.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  3. بعد المحاذاة الدقيقة للعينه ، اختر معلمات الاستحواذ للحصول علي أفضل جوده للصورة. في حاله من البيانات nanoct المقدمة: الحصول علي إسقاطات في ذروه الجهد من 60 kV مع 1599 التوقعات موزعه علي قدم المساواة علي 360 ° وحجم فوكسل من حوالي 400 نانومتر.
    ملاحظه: قياس واحد المحوسبة المكتسبة في 400 nm حجم فوكسل لديه فوف من 75 μm في اتجاه محور الدوران (الراسي) وحوالي 560 μm في اتجاه عمودي علي محور الدوران (أفقي). للتحقيق في كميات أكبر ، يمكن تحقيق امتداد لل فوف علي طول محور الدوران عن طريق الجمع بين العديد من المسح الضوئي في مواضع راسيه مختلفه. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن اجراء مسح التصوير المقطعي المحلي لقياس العينات بقطر عينه أكبر عمودي علي محور الدوران مما يعطيه فوف للمسح المقطعي المحوسب العالمي. تم الحصول علي بيانات nanoCT مع وقت التعرض من 4 s لكل إسقاط. وعلي هذا النحو بلغ مجموع وقت الاكتساب لكل مجموعه بيانات حوالي 3.5 ساعة.
    ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
  4. بعد الحصول علي البيانات المحوسبة ، ومعالجه الإسقاطات وفقا لذلك لأعاده بناء حجم 3D.
    1. في حاله البيانات nanoCT المقدمة ، تطبيع التوقعات المكتسبة مع الصور flatfield. تعزيز حده الإسقاطات باستخدام خوارزميه ريتشاردسون-لوسي تفكيك30,31. استخدم وظيفة غوسيه متماثلة بشكل دوار مع انحراف معياري بمقدار بكسل واحد كنواه تفكيك.
    2. تطبيق خوارزميه المرحلة الاسترداد Paganin للصور شحذ لزيادة التباين الانسجه الرخوة. تعيين المعلمات الخوارزميه لتحسين جوده الصورة32. أعاده بناء التوقعات المجهزة مسبقا باستخدام خوارزميه الإسقاط الخلفي المصفاة المتطورة.
      ملاحظه: الشكل 3 يقيم البيانات nanoct التي تم الحصول عليها مع المقاطع النسيجية المقابلة ، والتي كانت تقريبا 7 ميكرون سميكه. ولذلك ، تم إنشاء شرائح الإسقاط كثافة الحد الأدنى من 18 شرائح nanoCT المتاخمة مع سمك الظاهري من حوالي 7 μm عن طريق حساب الحد الأدنى للقيمة لكل بكسل في الشرائح ذات الصلة. تم استخدام برنامج التصور لتقديم حجم البيانات nanoCT ، التي يتم عرضها في الشكل 4.

النتائج

يظهر الشكل 1 الشرائح المقطعية وعرض الحجم لبيانات microct ذات الدقة المنخفضة التي تسلط الضوء علي تعزيز التباين بعد التلطيخ. يظهر الشكل 2 الشرائح المقطعية وعرض الحجم لبيانات microct عاليه الدقة المستمدة من التصوير المقطعي المحلي لكليه الفئران بأكملها. يظهر الشكل 3 شرائح CT من بيانات nanoct بالمقارنة مع المقاطع النسيجية المناظرة. الشكل 4 يظهر شريحة CT وعرض حجم البيانات nanoct تسليط الضوء علي التفاصيل الهيكلية علي المستوي الخلوي. ويتيح قياس microCT المنخفض الاستبانة نظره عامه علي الجهاز بأكمله ويساعد علي تحديد كميات الفائدة (VOIs) لقياس الميكروكت العالي الاستبانة. من خلال هذا النهج متعدد المقياس ، يتم تحديد VOI ل nanoCT. يتيح nanoCT عرضا مفصلا جدا لعينه الانسجه الرخوة علي المستوي الخلوي. الدراسة المقارنة مع القسم النسيجي المقابلة يسلط الضوء علي التوافق التام مع علم الامراض الكريهة. وفي هذا الصدد ، يؤكد نهج التصوير المتعدد الوسائط النتائج التي تم الحصول عليها بكل من الطريقتين.

figure-results-1091
الشكل 1 CT شرائح وحجم تقديم بيانات microCT منخفضه الاستبانة. (ا ، ب) صور عامه لنفس الكلية الماوس قبل وبعد تلطيخ ، علي التوالي ، وتسليط الضوء علي تعزيز التباين التي تم الحصول عليها بعد تطبيق بروتوكول تلطيخ القائمة علي eosin. وقد تم الحصول علي كل من مجموعات بيانات microCT باستخدام بارامترات اقتناء متطابقة. حجم فوكسل في مجموعات البيانات هو 12 μm. ويمكن تعزيز التباين الذي تحقق في (ب) من تحديد المناطق الهيكلية التشريحية التالية: اللحاء (I) ، النخاع الخارجي (II) مع مزيد من التمييز في المشارب الخارجية من النخاع الخارجي والخطوط الداخلية للميولا الخارجية (iib) ، النخاع الداخلي (III) ، حليم (IV) والحوض الكلوي (V). (ج) عرض الحجم لبيانات microct التي تظهر مقطع السهمي افتراضي من خلال كليه الماوس بأكملها. وقد تم تعديل هذا الرقم من بوس وموللر وآخرون26الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2214
الشكل 2 CT شريحة وحجم تقديم البيانات microCT عاليه الدقة المستمدة من نفس الكلية الماوس بعد تطبيق بروتوكول تلطيخ القائمة علي eosin المتقدمة. (ا) يظهر الركن الأيسر صوره النظرة العامة microct التي تسلط الضوء علي عائد الاستثمار (المربع الأزرق) للصورة المعروضة عاليه الدقة. المناطق الهيكلية التشريحية التالية يمكن التعرف عليها: اللحاء (I) ، النخاع الخارجي (II) مع مزيد من التمييز في المشارب الخارجية من النخاع الخارجي والمشارب الداخلية من النخاع الخارجي (IIb) ، النخاع الداخلي (III) ، الكاس الصغرى (IV) والسفن (V و VI). (ب) حجم عرض الفوائد لبيانات microct عاليه الاستبانة التي تم الحصول عليها بحجم 3.3 ميكرون. وتظهر منطقه النخاع والقسم الافتراضي من خلال سفينة مستمده من التصوير المقطعي المحلي للكلية بأكملها. وقد عدل هذا الرقم من بوس وموللر وآخرون26. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3319
الشكل 3 CT شرائح من البيانات nanoCT (ا ، ب) بالمقارنة مع الأقسام النسيجية (ج ، د) المستمدة من نفس الكلية الماوس بعد تطبيق بروتوكول تلطيخ القائم علي القائمة علي ايوسين. (ا) صوره nanoct لنفس عينه الكلي الفار بعد تلطيخ ، تشريح ووثيقة البرامج القطرية يظهر هياكل مفصله من المنطقة (iib) ينظر في الشكل 1 والشكل 2. وتعرف هذه الأطراف الصاعدة سميكه من حلقه Henle. (ب) شريحة إسقاط الكثافة الدنيا المشتقة من مجموعه بيانات nanoct نفسها المبينة في (ا) بسماكة شريحة افتراضيه تبلغ حوالي 7 ميكرومتر ، مما يسمح بتصور واضح لنوى الخلية. (ج) القسم النسيجي التمثيلي عرض الأطراف الصاعدة سميكه من حلقه henle مع التصور واضحة من نوى الخلية وفرشاه الحدود. القسم النسيجي يحتوي علي سماكه تقريبيه من 7 μm وتم الحصول عليها من نفس عينه الكلي الماوس بعد تلطيخ القائم علي تطبيق eosin والتضمين في كتله البارافين. (د) القسم النسيجي التمثيلي مع تطبيق المضادة للبقع وصمه عار تسليط الضوء علي نوى الخلية في الأرجواني. اعداد القسم النسيجي بالقرب من القسم الظاهر في (c) بسماكة تقريبيه تبلغ 7 ميكرومتر. وقد تم تعديل هذا الرقم من بوس وموللر وآخرون26الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4812
الشكل 4 CT شريحة وحجم تقديم بيانات nanoCT. (ا) صوره nanoct لنفس عينه الكلي الفار تظهر الهياكل المعروفة باسم الأطراف الصاعدة سميكه من حلقه henle. هذا هو عرض مفصل للمنطقة (iib) ينظر في الشكل 1 والشكل 2 المكتسبة من قطعه صغيره من الكلي مع حجم فوكسل من حوالي 400 نانومتر. وشمل اعداد العينة تلطيخ وتشريح ووثيقة النظام القطري. (ب) حجم العرض من البيانات nanoct تصور بنيه 3d من الأطراف الصاعدة سميكه من حلقات henle. وقد تم تعديل هذا الرقم من بوس وموللر وآخرون26الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

حاليا ، يتم استخدام يوزين كبروتوكول النسيجية القياسية لتسميه سيتوتوبلاسما الخلية. يتم تطبيق عامل تلطيخ كما 0.1 ٪ (ث/الخامس) محلول مائي لشرائح المجهرية من الانسجه الرخوة (قطع عموما مع سمك 2-10 μm)33. تطبيق هذا البروتوكول النسيجي الموحد إلى عينات الانسجه ثلاثية الابعاد مثل كليه الماوس كله لا يؤدي إلى زيادة التباين التوهين صوره CT. فمن ناحية ، يمكن ان يعزي ذلك إلى انخفاض خصائص التوهين المتاصل في الانسجه الرخوة بالنسبة لطاقات الاشعه السينية المستخدمة عاده في أنظمه microCT المستندة إلى المختبرات. عاده ، يتكون النسيج الرخو من الكربون بشكل رئيسي ، والهيدروجين ، والأكسجين والنيتروجين34، التالي ، لا يؤدي إلى تعزيز التباين. من ناحية أخرى ، كان التركيز المنخفض من يوزين المستخدمة لتلطيخ العامل المقيد. وعلي الرغم من ان جزيء ايوسين واحد يحمل أربع ذرات بروميد (البروم عنصر الرقم الذري عاليه مع Z = 3534) ، لم يتم استيفاء مستويات الحساسية المطلوبة للتصوير بالاشعه السينية التصوير المقطعي المحوسب.

وللتغلب علي هذا التحدي المتمثل في تباين التوهين المنخفض ، تم التحقيق في عده تركيزات من الايوسين. الحد هنا هو الحد الأقصى للذوبان في الماء ، وهو 30% (w/v) في محلول مائي. ولوحظ أفضل تعزيز التباين التوهين داخل الانسجه الرخوة مع تركيز ايوسين اعلي ، والذي كان متوقعا وفقا لقانون لامبرت البيره. ولذلك ، تم تنفيذ بروتوكول تلطيخ النهائي مع اعلي تركيز.

تم الرد علي السؤال كيفيه اعداد الانسجه الرخوة علي الأمثل علي المستوي الجزيئي لاجراء تلطيخ لزيادة تحسين التباين تعزيز التعديل pH. هنا ، تم العثور علي تحمض من عينه الانسجه الرخوة اثناء التثبيت أو قبل تلطيخ لتكون حاسمه. وقد اظهر ذلك أيضا هونغ وآخرون35. وقد تحقق تراكم اعلي من عامل تلطيخ داخل الخلايا الخلوية بالحمض من خلال التفاعلات الايونيه المحسنة ، والتي كانت نتيجة لل protonation من الأحماض الامينيه سلاسل الجانب من البروتينات الببتيدات الموجودة داخل سيتوتوبلاسما الخلية. ويرد في الشكل 1(ا) (ب) نتيجة تمثيليه تسلط الضوء علي تعزيز التباين بالمقارنة مع عينه من الانسجه الرخوة غير الملونة. هنا ، تم تحقيق نظره عامه هيكليه لكليه الفئران بأكملها تصور المناطق التشريحية الحاسمة مثل القشرة ، النخاع ، الحليمة والحوض الكلوي.

بروتوكول تلطيخ المقدمة هو بسيط لتطبيق ويحتوي علي ثلاث خطوات فقط. الكواشف المطلوبة يمكن الوصول اليها بسهوله. الوقت تلطيخ عموما من 24 ساعة سريعة لتلطيخ الجهاز كله ، والتي تمكن التصور 3d من عينات الانسجه الرخوة (الشكل 1ج، الشكل 2ب والشكل 4ب) في بيئة مختبريه في مقاييس متعددة وصولا إلى المستوي الخلوي. وتجدر الاشاره إلى ان الوقت تلطيخ عموما وحجم الحل تلطيخ اللازمة قد تطلب بعض التعديلات تبعا لطبيعة العينة. ومع ذلك ، فان بروتوكول تلطيخ علي أساس eosin هو مناسبه لتلطيخ الجهاز كله ، والتي تمكن بعد ذلك عاليه الدقة التصوير microCT من الأعضاء بأكملها. ولم يلاحظ انكماش التحف بسبب الايثانول المذيب ، الذي كان يستخدم للحفاظ علي عينه رطبه خلال قياسات microCT. مطلوب خطوات اعداد اضافيه للتصوير nanoCT ، والذي يسمح للتحقيق في قطع الانسجه الصغيرة المستخرجة من العينة الاصليه. وفيما يتعلق بالتطبيقات المستقبلية المرضية ، فان فحص النظرة العامة سيوفر رؤى قيمه في المناطق والهياكل التشريحية المتغيرة ، مما يسمح بتحديد المعدلات البديلة كما هو موضح في الشكل 2ا. ويمكن دراستها في 3D بواسطة microCT (الشكل 1ج والشكل 2ب) أو nanoct (الشكل 4ب) وتقييمها في 2d مع الانسجه (الشكل 3).

وينظر إلى قوه أخرى من البروتوكول في التوافق الكامل مع علم التشريح فيما يتعلق باجراء تلطيخ H & E. تطبيق اجراء تلطيخ علي أساس يوزين لعينات السائبة لا يعوق المزيد من التحقيقات النسيجية (الشكل 3) ، علي الرغم من ان تركيز يوزين التطبيقية هو اعلي بكثير مقارنه مع حل تلطيخ النسيجية. شريحة nanoct مع سمك الظاهري من حوالي 400 نانومتر (الشكل 3ا) يقارن بالفعل بشكل جيد جدا مع القسم النسيجي (الشكل 3ج) ، الذي استمد من عينه الانسجه الرخوة المقابلة. بالنظر إلى السماكة التقريبية للقسم النسيجي مع 7-10 μm ، وتوليد شرائح الإسقاط شده الحد الأدنى من البيانات nanoCT (الشكل 3ب) ، والتي تتوافق مع سمك الظاهري من حوالي 7 μm ، ويسمح مقارنه أفضل مع القسم النسيجي (الشكل 3ج). هنا ، يتم الكشف عن نوى الخلية بوضوح كمنطقه غير التوهين كما يوزين البقع علي وجه التحديد البروتينات والببتيدات في الخلية سيتوتوبلاسما33.

تطبيق المزيد من تلطيخ العداد مع الأساليب النسيجية القياسية هو ممكن ، علي الرغم من ان يتم عكس ترتيب تلطيخ مقارنه بالاجراء تلطيخ النسيجية القياسية. بدءا من البداية مع بروتوكول تلطيخ القائم علي eosin المتقدمة لل CT ، تليها تلطيخ العداد من تلك الأقسام النسيجية القائمة علي eosin مع الهيلوكسيلين ، ويسمح للتوافق الكامل والنتائج في تلطيخ عاليه الجودة عرض النموذج المتوقع من المظهر. تم تطبيق تلطيخ نواه الخلية الخاصة مع هيتوكيللين ماير في القسم النسيجي تسليط الضوء علي نوى الخلية في الأرجواني (الشكل 3د). تطبيق تلطيخ مكافحه النسيجية يقتصر حاليا علي H-وصمه عار. القياسية الأخرى النسيجية مكافحه المطاط مثل الدوري الحمضية قاعده شيف ، الاشرطه المطاطية فان Gieson أو Gomori الفضة يجب ان يتم تقييمها ، فضلا عن التوافق مع تقنيات ايمونوهيستولوجيكال يحتاج إلى اختبار.

يسمح بروتوكول تلطيخ المستندة إلى eosin ل ' 1 ' الخلايا الخلوية-استهداف محدده ، ' 2 ' تلطيخ متجانسة وكامله ، ' 3 ' سهوله التنفيذ ، ' 4 ' اختراق سريع للانسجه دون خلق التحف مثل حلقات النشر ، (v) تلطيخ عينات الانسجه الرخوة الكبيرة والكثيفة ، و (6) التوافق الكامل مع علم الامراض الحميدة فيما يتعلق وصمه عار & E. هذه المتطلبات الهامه للسماح عاليه الدقة التصوير المقطعي المحوسب الاشعه السينية من الانسجه الرخوة وصولا إلى المستوي الخلوي. بالاشتراك مع أجهزه nanoct المطورة حديثا12،36،37، الجيل غير التدميري من الشرائح النسيجية الظاهرية التي يمكن مقارنتها في التباين والدقة بالبيانات النسيجية التقليدية أصبح ممكنا. سيمكن هذا النهج المشترك من إنشاء الاشعه السينية المقطعية كاداه قيمه لتصور ثلاثي الابعاد للهياكل النسيجية المجهرية.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر الدكتور انكين دركول علي المناقشات النسيجية والفريق المتعاون للغاية في Excillum AB ، السويد. ونحن نعترف بالدعم المالي من خلال مجموعه DFG للتميز مركز ميونيخ للضوئيات المتقدمة (MAP) وبرنامج DFG غوتفريد فيلهلم لايبنتز. وعلاوة علي ذلك ، تلقي هذا المشروع البحثي تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكارات ال2020ه في اطار مبادرة ماري سكوودوسكا-كوري للمنح رقم مبادرة أفق 2020-MSCA-IF-2015-703745-كونسول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
50-ml centrifuge tube by FalconVWR734-0453
Formaldehyde solution, 37%Carl RothCP10.2acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acidAlfa Aesar36289.AP
Eosin Y disodium saltSigma-AldrichE4382certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS)MerckL1825Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by NalgeneCarl RothATK5.1
Rocking Shaker ST5CAT60281-0000
Cellulose tissue paperVWR115-0600
Forceps, by USBECK LaborgeräteVWR232-0096
Microcentrifuge tubes by EppendorfVWR211-2120safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker AnalyzedVWR80252500
Disposable safety scalpel by AesculapVWR AESCBA210
Petri dish by SterilinVWR391-2019
Plastic pasteur pipetteCarl RothEA68.1graduated, 1 ml
Desiccator by DuranVWRSCOT247826954
Silicone grease by BayerSigma-Aldrich85404high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipeLinde370011310 kg, short
micro-porous treatment capsulePLANO GmbH4614pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030Bal-Tec AGCO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCDZeissthis stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500Zeissthis microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scannerDectrissingle-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scannerExcillumhigh-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).

References

  1. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. . Theory and Practice of Histological Techniques. 7th edn. , (2013).
  2. Chatterjee, S. Artefacts in histopathology. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 18 (4), 111-116 (2014).
  3. McInnes, E. Artefacts in histopathology. Comparative Clinical Pathology. 13 (3), 100-108 (2005).
  4. Andreasen, A., Drewes, A., Assentoft, J., Larsen, N. Computer-assisted alignment of standard serial sections without use of artificial land-marks. A practical approach to the utilization of incomplete information in 3-d reconstruction of the hippocampal region. Journal of Neuroscience Methods. 45 (3), 199-207 (1992).
  5. Braverman, M. S., Braverman, I. M. Three-dimensional reconstructions of objects from serial sections using a microcomputer graphics system. Journal of Investigative Dermatology. 86 (3), 290-294 (1986).
  6. Denk, W., Hortsmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
  7. Mohun, T. J., Weninger, J. W. Imaging heart development using high-resolution episcopic microscopy. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 573-578 (2011).
  8. Weninger, J. W., Meng, S., Streicher, J., Müller, G. B. A new episcopic method for rapid 3-d reconstruction: applications in anatomy and embryology. Anatomy and Embryology. 197 (5), 341-348 (1998).
  9. Odgaard, A., Andersen, K., Melsen, F., Gundersen, H. J. G. A Direct Method for Fast 3-Dimensional Serial Reconstruction. Journal of Microscopy. 159, 335-342 (1990).
  10. Müller, M., et al. Myoanatomy of the velevt worm leg revealed by labratory-based nanofocus X-ray source tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12378-12383 (2017).
  11. Salomon, M., Hanke, R., Krüger, P., Uhlmann, N., Voland, V. Realization of a computed tomography setup to achieve resolutions below 1 µm. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A. 591, 50-53 (2008).
  12. Tkachuk, A., et al. X-ray computed tomography in Zernike phase contrast mode at 8 keV with 50-nm resolution using Cu rotating anode X-ray source. Zeitschrift für Kristallographie. 222, 650-655 (2007).
  13. Withers, P. J. X-ray nanotomography. Materials Today. 10, 26-34 (2007).
  14. Jahn, H., et al. Evaluation of contrasting techniques for X-ray imaging of velvet worms (Onychophora). Journal of Microscopy. 270 (3), 343-358 (2018).
  15. Martins de S. e Silva, J., et al. Three-dimensional non-destructive soft-tissue visualization with X-ray staining micro-tomography. Scientific Reports. 5, 14088 (2015).
  16. Metscher, B. D. MicroCT for Developmental Biology: A Versatile Tool for High-Contrast 3D Imaging at Histological Resolutions. Developmental Dynamics. 238, 632-640 (2009).
  17. Metscher, B. D. MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues. BMC Physiology. 9, 11 (2009).
  18. Mitzutani, R., et al. X-Ray Microtomographic Imaging of Three-Dimensional Structure of Soft Tissues. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (4), 359-363 (2008).
  19. Pauwels, E., Loo, D. v., Cornillie, P., Brabant, L., Hoorebeke, L. v. An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging. Journal of Microscopy. 250, 21-31 (2013).
  20. Degenhardt, K., Wright, A. C., Horng, D., Padmanabhan, A., Epstein, J. A. Rapid 3D phenotyping of cardiovascular development in mouse embryos by micro-CT with iodine staining. Circulation: Cardiovascular Imaging. 3 (3), 314-322 (2010).
  21. Dullin, C., et al. μCT of ex-vivo stained mouse hearts and embryos enables a precise match between 3D virtual histology, classical histology and immunochemistry. PLOS ONE. 12 (2), 0170597 (2017).
  22. Jeffrey, N. S., Stephenson, R. S., Gallagher, J. A., Cox, P. Micro-computed tomography with iodine staining resolves the arrangement of muscle fibres. Journal of Biomechanics. 44, 189-192 (2011).
  23. Johnson, J. T., et al. Virtual Histology of Transgenic Mouse Embryos for High-Throughput Phenotyping. PLOS Genetics. 2, 61 (2006).
  24. Leszczyński, B., et al. Visualization and Quantitative 3D Analysis of Intraocular Melanoma and Its Vascularization in a Hamster Eye. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 332 (2018).
  25. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Mircon. 43, 104-115 (2012).
  26. Busse, M., et al. Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2293-2298 (2018).
  27. Müller, M., et al. Non-destructive high-resolution 3D virtual histology enabled through a cell nucleus-specific stain for X-ray computed tomography. Scientific Reports. 8, 17855 (2018).
  28. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  29. Nachtrab, F., et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation. 10 (11), 11009 (2015).
  30. Kraft, P., et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation. 16 (3), 368-375 (2009).
  31. Kraft, P., et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science. 56 (3), 758-764 (2009).
  32. . ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra Available from: https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html (2019)
  33. Anderson, T. F. Techniques for the preservation of three-dimensional structure in preparing specimens for the electron microscope. Transactions of the New York Academy of Sciences. 13 (4), 130-134 (1951).
  34. Bray, D., Williams, J. R., Clifford, A. A. . Supercritical Fluid Methods and Protocols. Methods in Biotechnology. 13, 235-243 (2000).
  35. Lucy, L. B. An iterative technique for the rectification of observed distributions. The Astronomical Journal. 79, 745-765 (1974).
  36. Richardson, W. H. Bayesian-Based Iterative Method of Image Restoration. The Journal of the Optical Society of America. 62 (1), 55-59 (1972).
  37. Paganin, F., Mayo, S. C., Gureyev, T. E., Miller, P. R., Wilkins, S. W. Simultaneous phase and amplitude extraction from a single defocused image of a homogeneous object. Journal of Microscopy. 206, 33-40 (2002).
  38. Riedelsheimer, B., Büchl-Zimmermann, S., Mulisch, M., Welsch, U. . Mikroskopische Technik. , 193-194 (2015).
  39. Hubbell, J. H., Seltzer, S. M. Tables of Xray mass attenuation coefficients and mass energy-absorption coefficients from 1 keV to 92 keV and 48 additional substances of dosimetric interest, Table 3. National Institute of Standards and Technology. , (1995).
  40. Hong, H. Y., Yoo, G. S., Choi, J. K. An Eosin Y Method for Protein Determination in Solution. Analytical Letters. 32 (12), 2427-2442 (1999).
  41. . GE product information: Phoenix nanotom m Available from: https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf (2019)
  42. Dierick, M., et al. Recent Micro-CT Scanner Developments at UGCT. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B. 324, 35-40 (2014).
  43. Kastner, J., Plank, B., Heinzl, C. Advanced X computed tomography methods: High resolution CT, quantitative CT, 4DCT and phase contrast CT. Proceedings of Digital Industrial Radiology and Computed Tomography. , 120-132 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 3D microstructure

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved