使用 X 射线特定染色方法和纳米计算机断层扫描对软组织样本进行 3D 成像

摘要

提出了一种利用X射线特异性染色方法对微观组织结构进行三维可视化的协议，该方法专为X射线计算机断层扫描而设计。

摘要

我们演示了一种基于实验室的方法，将X射线微CT和纳米CT与特定的X射线染色相结合，以细胞质为目标。所述方案易于应用，速度快，适用于较大的软组织样品。所呈现的方法能够对关键的组织结构进行三维的表征，并在整个小鼠肾脏上进行演示。多尺度方法允许图像整个小鼠肾脏，并支持选择更多感兴趣的体积，这些兴趣的获取分辨率更高，范围可达纳米范围。因此，复制具有与相应组织学光显微镜图像相似细节级别的软组织形态。在不妨碍通过组织学方法进行进一步调查的情况下，可以深入了解组织结构的 3D 配置。

引言

软组织标本的完整表征需要有关3D组织微观结构的信息。目前软组织样本分析的黄金标准是组织病理学。使用光学^显微镜1在选定感兴趣的区域（ROIs）中以2D方式探索标本的组织和细胞形态。但是，此方法有几个缺点。样品的制备非常耗时、复杂、具有破坏性，而且容易出现伪影。生成的显微幻灯片仅提供与切片平面平行的 2D 信息。通常，由于^{时间限制2，3，}调查组织学部分的数量受到限制。

近年来，3D生物学领域不断发展。在这里，可从任何所需空间平面访问虚拟组织切片。这允许在整个样本中跟踪结构，从而更深入地了解与不同病理相关的 3D 组织架构和结构变化。已经开发出各种方法来生成 3D 体积数据。它们范围从基于序列截面的方法，使用光或电子显微镜4，5，6，7，8，到块面成像方法，如表观3D成像或块面扫描电子显微镜7，8，9。然而，上述所有方法都涉及对样品进行分割或完全销毁，这不允许进一步调查。获得分辨率高度依赖于切片过程容易产生传统方法学中所述的伪影。这些方法还受到对齐伪影的影响。

3D X 射线成像技术，如显微和纳米计算机断层扫描（微CT 和纳米CT），渴望在不破坏组织样本的情况下生成 3D 高分辨率数据。到目前为止，软组织的弱X射线衰减对比度和实验室环境中对高分辨率的获取有限，已影响其用于微观组织结构的3D可视化。最近向基于实验室的高分辨率X射线CT迈进，使分辨率远低于1μm 10、11、12、13。

传统衰减X射线成像中软组织缺乏对比度，通过染色剂得到补偿，从而增强X射线衰减对比度。从其他成像技术（如四氧化二氮（OsO_4）、碘化钾（IKI）或磷酸（PTA）中已知的染色剂，经常使用14、15、16、17 ^{18，19，20，21，22，23，24，25}。允许 （i） 特定生物靶向的染色剂，（ii） 同质和完全染色，（iii） 易于处理，（iv） 快速渗透组织而不产生扩散环等伪影，（v） 大而致密的组织染色，以及 （vi）建立X射线CT作为微观组织结构的3D可视化工具，需要与组织病理学完全兼容。在本作品中，我们展示了如何为X射线CT成像制备软组织样本，并基于符合上述^要求的eosin的细胞质特异性X射线染色。

多尺度成像方法通过概述微CT测量和选择感兴趣的体积（VOI）进行进一步的高分辨率调查，确保对染色质量的评估。对染色质量进行分析的重点是染色参数，如（i） 完整性、（ii） 扩散环的外观、（iii） 对比度增强、（iv） CT 伪影（如条纹）的外观和 （v） 同质性。基于实验室的纳米CT设置，使用几何放大率达到分辨率到100nm，可视化软组织形态在（子）细胞^{水平10，27。}对纳米CT切片与相应的组织学光显微镜图像的比较分析，确认在2D的微观水平上具有相似细节的组织结构的复制，从而能够对组织进行组织病理学特征化样品。这个详细的视频协议旨在提高认识，并突出这种方法作为无损3D软组织成像工具的潜力，为广泛的科学界，如动物学家，生物学家和健康感兴趣专业 人士。

研究方案

注意:使用前请查阅所有相关材料安全数据表 （MSDS）。议定书中使用的几种化学品具有剧毒和致癌性。在执行染色协议时，请使用所有适当的安全做法，包括使用工程控制（烟罩、手套箱）和个人防护设备（安全眼镜、手套、实验室外套、全长裤子、闭趾鞋）。

使用的动物:
根据欧洲联盟2010/63准则，在慕尼黑技术大学Klinikum rechts der Isar进行了动物住房。器官去除由德国慕尼黑克利尼库姆雷希特德伊萨尔内部动物保护委员会批准（内部参考号4-005-09）。所有程序均符合有关准则和条例。所有实验室均接受检查，以符合经合组织良好实验室做法的原则。

1. Eosin 染色协议

1. 要固定软组织样品，请用含有9.5 mL 4%甲醛溶液（FA）和0.5 mL冰川醋酸（AA）的固定溶液填充50mL离心管。
   注:从37%无酸FA溶液中制备FA溶液，稳定约10%甲醇。使用 Dulbecco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 进一步稀释 FA 溶液。选择不含钙和镁的DPBS。将稀释的 FA 溶液保留不超过一个月。在酸化期间，固定溶液的pH从中性到大约3。
   注意:由于 FA 是急性器官毒性、腐蚀性和致癌性，因此必须使用烟罩，并且必须使用适当的防护个人设备。
   1. 将新鲜去除的软组织样品加入 50 mL 离心管中，并将 50 mL 离心管冷藏 24-72 小时。
      注: 可以在此处暂停该协议。
   2. 使用 DPBS 溶液清洗软组织样品 1 小时。
2. 要染色固定软组织样品（例如，整个小鼠肾脏），将软组织放入 2 mL 的 eosin Y 染色溶液中，并将样品孵育 24 小时。将样品放在水平摇动板上，在孵育过程中平滑摇动（约 60 rpm）过程。
   注:eosin Y染色溶液在蒸馏水中的浓度为30%（w/v）。选择染色溶液的体积，使样品完全被染色溶液覆盖，并允许样品在样品容器内自由移动。其他样本的孵育时间可能有所不同，必须作相应调整。
3. 染色后，从样品容器中小心地取出软组织样品。
   1. 用纤维素纸巾小心地去除过量的染色剂。
   2. 将软组织样品放在一个圆锥样品容器中，高于乙醇蒸气相，以便储存和进一步使用。
      注:锥形样品容器必须始终在管底部含有几滴 70% （v/v） 乙醇，以保持软组织样品湿润并防止伪影。

2. X射线微CT成像

注:X射线微CT测量使用微CT扫描仪进行，该扫描仪提供CT测量（在视场（FOV）内成像整个样品的能力）和高分辨率CT测量的性能（聚焦在相同样品的一个所需兴趣体积 （VOI） 下至 1 μm。

1. 将软组织样品安装到适当的样品支架上。确保样品在样品架上紧密配合，以防止样品在 X 射线 CT 测量期间移动。
   1. 在染色小鼠肾脏的情况下:用两个离心管准备一个样品架，切断一个管的底部。使用双组分粘合剂将两个离心管粘合在一起。确保离心管围绕旋转轴进行直线对准。等待胶粘剂硬化。
   2. 一旦样品支架准备就绪，将小鼠肾脏转移到完整的离心机管中，该管在管底部保存几滴 70% （v/v） 乙醇。
      注:样品的稳定性至关重要。花时间准备 X 射线 CT 测量样本。软组织样品保存在乙醇蒸气相中，以保持样品在X射线CT测量过程中湿润，并防止软组织样品收缩和其他伪影。在 X 射线 CT 测量期间，软组织样品不应与溶剂接触，以避免溶剂在样品周围积聚，这可能导致样品在测量过程中移动，或在重建过程中引起问题。如果样品架不允许在底部保存溶剂，则可以在样品架中放置一个用 70% （v/v） 乙醇润湿的纤维素纸。需要注意的是，未观察到溶剂乙醇引起的收缩伪影。
      注: 可以在此处暂停该协议。
2. 仔细校准样品后，选择采集参数以获得最佳图像质量。在提供微CT数据的情况下，在峰值电压为50kV（使用1601投影均匀分布于360°的1601投影）的电流为3.5W时采集扫描。
   注: 选择概述 CT 扫描的采集参数以获得最佳图像质量。因此，选择 0.39x 摄像机目标以覆盖视场 （FOV） 中的整个样品。这产生了12μm的有效像素大小。每个投影 2 s 的曝光时间提供了良好的信噪比。高分辨率 CT 扫描的 ROI 是使用概览扫描中的微CT数据确定的。MicroCT 扫描仪通常集成了集成的软件工具，从而能够精确选择确定的投资回报率。对于高分辨率 CT 数据，选择 4 倍摄像机目标，产生 3.3 μm 的有效像素大小。在这里，每个投影的曝光时间为 15 s。
   注: 可以在此处暂停该协议。
3. 获取 X 射线 CT 数据后，相应地处理投影以重建 3D 体积。在提出的微CT数据的情况下:使用集成软件重建X射线CT数据。
   注:图1和图2所示的微CT数据的体积渲染是使用可视化软件生成的。
   注: 可以在此处暂停该协议。

3. X射线纳米CT成像

注:X射线纳米CT扫描仪已在内部开发。无透镜仪器配有纳米聚焦X射线源和单光子计数检测器。分辨率低于 100 nm 的 3D 数据可以生成¹⁰。通常，纳米CT系统（包括X射线光学系统）是商用的，并不限于所述的纳米CT扫描仪。

1. 纳米CT样品制备
   1. 准备软组织样品的VOIs。使用手术刀和立体显微镜将软组织切成大约 0.5 mm 边缘长度的非常小的块。在小鼠肾脏的情况下:沿着最长的轴将小鼠肾脏切成两半。取取小鼠肾脏的一半，并准备不同的解剖区域，如肾皮层和肾髓。
      注:小鼠肾脏的另一半被转移到组织病理学，其中样品被嵌入石蜡中并进行相应处理，以产生如图3c和图3d所示的典型组织学部分.
   2. 在第一个脱水步骤之前将小件转移到新的培养皿中，它们保留用于所有后续步骤。
   3. 使用浓度（全v/v）以 %: 50、60、70、80、90、96 和 100 乙醇与蒸馏水平衡，脱水样品。执行每个脱水步骤 1 小时。
      注: 可以在此处暂停该协议。将小组织片块放在100%乙醇中过夜。
   4. 临界点干燥（CPD）的小组织片。
      注:使用CPD使组织样品完全脱水，将溶剂（这里乙醇）与干燥剂（此处_为CO2）交换。这是必要的，以确保样品可以安装在纳米CT的样品支架上，在测量过程中不移动，并且可以放置在非常接近X射线源的位置，以获得最佳的几何放大倍率。nanoCT 设置仅基于几何放大，放大系数定义为源到检测器距离在源到样本距离上的距离。干燥技术首先由安德森引入，以保存电子^显微镜28生物标本的三维结构。^布雷29提供了该技术的概述。
      1. 用100%乙醇预填充真空室。将小组织片转移到微孔胶囊中，并将其放入CPD的真空室。关闭系统。
         注:由于 CPD 过程中涉及高压，因此确保 CPD 的所有部件（尤其是接头）完好无损，且系统已正确关闭。
      2. 将腔室冷却至 6-8°C，并充满液体 CO₂。
      3. 搅拌时，等待 3 分钟，以便两个部件正确混合。小心排空腔室。确保样品架仍然覆盖有溶剂。重复此步骤十次，以便在样品中完全用_CO2替代乙醇。
      4. 用 CO₂最终填充腔室后，将机器加热到 CO₂的临界点（31 °C 和 73.8bar），然后以非常缓慢的速度在 30 分钟内释放气体 CO_2。
         注:气体的释放应非常缓慢，否则样品上会形成冷凝水。确保温度不低于 CO₂的临界点。仅当系统释放所有压力时，才打开 CPD 机器。
      5. 从机器中快速取出 CPD 组织片，并将其保存在新的培养皿中，然后继续使用。
         注: 可以在此处暂停该协议。
2. 将 CPD 组织件安装到适当的样品支架上。确保样品在样品架上紧密配合，以防止样品在 CT 测量期间移动。在CPD小鼠肾脏组织片的情况下:用超级胶水将组织片粘附在样品支架上。
   注: 在 CT 测量期间，样品的任何意外移动都可能导致体积重建过程中的问题，尤其是在获取具有纳米体素大小的数据集时。
   注: 可以在此处暂停该协议。
3. 仔细校准样品后，选择采集参数以获得最佳图像质量。在所呈现的纳米CT数据的情况下:在峰值电压为60 kV时采集投影，1599 个投影均匀分布于 360° 以上，体素大小约为 400 nm。
   注:在 400 nm 体素尺寸下获取的单个 CT 测量在旋转轴（垂直）方向上的 FOV 为 75 μm，在垂直于旋转轴（水平）的方向上约为 560 μm。为了调查较大的体积，可以通过组合不同垂直位置的多个扫描来实现沿旋转轴的 FOV 延伸。此外，还可以执行本地断层扫描，以测量样本直径与旋转轴垂直的样本直径大于全局 CT 扫描的 FOV 给出的样本。纳米CT数据采集时，每个投影的暴露时间为4秒。因此，每个数据集的总采集时间约为 3.5 小时。
   注: 可以在此处暂停该协议。
4. 获取 CT 数据后，相应地处理 3D 体积重建的预测。
   1. 在呈现的纳米CT数据的情况下，用平地图像对采集的投影进行规范化。通过使用理查森-露西反卷积^{算法30，31}增强投影的锐度。使用具有一个像素标准偏差的旋转对称高斯函数作为反卷积内核。
   2. 将帕加宁的相位检索算法应用于锐化图像，以增加软组织对比度。设置算法的参数以优化图像^质量32。使用最先进的过滤后投影算法重建预处理的投影。
      注:图3用相应的组织学部分评估获得的纳米CT数据，这些数据厚约7μm。因此，通过计算相关切片中每个像素的最小值，生成了18个相邻纳米CT切片的最小强度投影切片，其虚拟厚度约为7 μm。可视化软件用于渲染纳米CT数据的数量，如图4所示。

结果

图 1显示了低分辨率微CT数据的CT切片和体积渲染，突出显示染色后的对比度增强。图2显示了从整个小鼠肾脏的局部断层扫描中得出的高分辨率微CT数据的CT切片和体积渲染。图 3显示了与相应的组织学部分相比的纳米CT数据的CT切片。图 4显示了纳米CT数据的CT切片和体积渲染，突出细胞层的结构细节。低分辨率微CT测量允许对整个器官进行概览，并有助于识别高分辨率微CT测量的兴趣量（VOIs）。通过这种多尺度方法，确定了纳米CT的VOI。nanoCT 使软组织样本在细胞水平上非常详细。与相应的组织学部分的比较研究突出了与组织病理学的完全相容性。在这里，多式联运成像方法证实了这两种模式的结果。

图 1.低分辨率微CT数据的CT切片和体积呈现。（a， b） 染色前后同一小鼠肾脏的概述图像，分别突出应用基于eosin的染色方案后获得的对比度增强。两个微CT数据集都是使用相同的采集参数获得的。两个数据集中的体素大小均为 12 μm。在 （b） 中实现的对比度增强能够识别以下解剖结构区域:皮质 （I）、外髓母体 （II），在外面髓节 （IIa） 和外髓节 （IIb） 的外条纹中进一步区分，内髓母细胞（III），辣椒（IV）和肾骨盆（V）。（c） 微CT数据的体积渲染，显示整个小鼠肾脏的虚拟下垂部分。这个数字已由Busse和Müller等人^修改，请点击这里查看这个数字的较大版本。

图 2.在应用开发的基于eosin的染色方案后，从同一小鼠肾脏获得的高分辨率微CT数据的CT切片和体积渲染。（a） 左角显示概述微CT图像，突出显示显示的高分辨率图像的 ROI（蓝色框）。以下解剖结构区域是可识别的:皮质 （I）、外膜 （II），外髓节 （IIa） 和外髓节 （IIb）、 内髓节 （III）、小甲膜 （IV） 和血管 （V 和 VI） 的外条纹进一步区分。（b） 以3.3 μm的体素大小采集的高分辨率微CT数据的兴趣量。显示从整个肾脏的局部断层扫描衍生的血管的Medulla区域和虚拟部分。这个数字已由Busse和Müller等人^{修改为26。}请点击此处查看此图的较大版本。

图 3.与从同一小鼠肾脏衍生的组织学部分（c，d）相比，纳米CT数据的CT切片（a，b）在应用开发的基于eosin的染色方案后。（a） 同一小鼠肾脏样本在染色、解剖和CPD后所呈现的纳米CT图像显示了图1和图2所示的区域（IIb）的详细结构。这些被称为亨勒循环的厚厚的上升四肢。（b） 最小强度投影切片派生自 （a） 中显示的相同纳米CT数据集，虚拟切片厚度约为 7 μm，从而能够清晰地可视化细胞核。（c） 代表组织学部分显示亨勒循环的厚升四肢，并清晰地可视化细胞核和刷边框。组织学部分的厚度约为7μm，是在应用基于eosin的染色和嵌入石蜡块后从同一小鼠肾脏样本中获得的。（d） 代表组织学部分，应用反染色血氧林，突出紫色细胞核。组织学部分的准备接近 （c） 中所示的部分，厚度约为 7 μm。这个数字已由Busse和Müller等人^修改，请点击这里查看这个数字的较大版本。

图 4.纳米CT数据的CT切片和体积渲染。（a） 同一小鼠肾脏样本的纳米CT图像，显示亨勒循环的厚升四肢的结构。这是图 1和图 2中从体素大小约为 400 nm 的肾脏小块获取的区域 （IIb） 的详细视图。样品的制备涉及染色、解剖和CPD. （b） 纳米CT数据的体积渲染，可视化了Henle循环厚升四肢的三维结构。这个数字已由Busse和Müller等人^修改，请点击这里查看这个数字的较大版本。

讨论

目前，eosin被用作标准组织学协议，为细胞质贴上标签。染色剂作为0.1%（w/v）水溶液应用于软组织的微小切片（一般切割厚度为2-10^μm）33。这种标准化组织学协议应用于3D组织样本，如整个小鼠肾脏，不会导致衰减对比度增强CT图像。一方面，这可归因于实验室微CT系统通常使用的X射线能量的软组织低内在衰减特性。通常，软组织主要由碳、氢、氧和^氮34组成，因此不会导致对比度的增强。另一方面，用于染色的eosin浓度低是限制因素。即使一个eosin分子包含四个溴化物原子（高原子元素溴与Z = 35^34），X射线CT成像所需的灵敏度水平没有达到。

为了克服低衰减对比度的挑战，研究了几种浓度的eosin。这里的限制是水中eosin的最大溶解度，在水溶液中为30%（w/v）。根据兰伯特-比尔定律，在软组织内观察到最佳衰减对比度增强，其浓度最高，这是预期的。因此，最终的染色方案是在最高浓度下进行的。

pH调整回答了如何在分子水平上为染色程序最佳制备软组织以进一步提高对比度的问题。在这里，在固定期间或染色之前，软组织样品的酸化是至关重要的。洪等人也证明了这^一点。通过改善离子相互作用，使细胞细胞质中染色剂在细胞细胞质中的积累更高，这是细胞细胞质中蛋白质和肽的氨基酸侧链的原型作用的结果。与未染色的软组织样本相比，具有代表性的结果强调了对比度增强，如图 1 a，b所示。在这里，整个小鼠肾脏的结构概述可视化的关键解剖区域，如皮层，髓母，辣椒和肾骨盆。

提出的染色协议应用简单，仅包含三个步骤。所需的试剂易于访问。整个器官染色的总染色时间为 24 小时，使软组织样本（图 1 c、图 2 b 和图 4 b）在实验室环境中实现 3D 可视化（图 1c、图 2b和图 4b）多个比例下降到蜂窝水平。需要注意的是，所需的染色溶液的总染色时间和体积可能需要根据样品的性质进行一些调整。然而，基于eosin的染色方案适用于全器官染色，从而能够对整个器官进行高分辨率的微CT成像。在微CT测量过程中，由于溶剂乙醇而用于保持样品湿润的收缩伪影没有观察到。纳米CT成像需要额外的制备步骤，这允许对从原始样品中检索到的较小组织片段进行调查。对于未来的组织病理学应用，概览扫描将提供对改变的解剖区域和结构的宝贵见解，从而能够确定 ROI，如图2a所示。这些可以通过微CT（图1c和图2b）或纳米CT（图4b）在3D中进行研究，并在2D中用组织学（图3）进行评估。

该协议的另一个优势在于与组织病理学在H&E染色程序方面的完全兼容。在散装样品上应用基于eosin的染色程序并不妨碍进一步组织学研究（图3），即使应用的eosin浓度比组织染色溶液高得多。虚拟厚度约为400nm的纳米CT切片（图3a）与组织学部分（图3c）相比已经非常充分，后者来自相应的软组织样本。考虑到具有 7-10 μm 的组织学部分的近似厚度，纳米CT数据（图 3 b ）的最小强度投影切片的生成（图 3b），对应于大约 7 μm 的虚拟厚度，从而允许更好地与组织学部分进行比较 （图 3c）。在这里，细胞核被清楚地揭示为非衰减区，因为eosin特别染色细胞^质33中的蛋白质和肽。

与标准组织染色程序相比，污渍顺序被颠倒了，但采用标准组织学方法进一步反染色是有可能的。首先从开发的基于eosin的CT染色方案开始，然后对这些基于eosin的基于血氧素的表氧化素进行反染色，允许完全兼容，并产生显示预期形式的高质量染色的外观。用迈尔的酸血氧素对细胞核进行特异性染色应用于组织学部分，以紫色突出细胞核（图3d）。组织学计数器染色的应用目前仅限于H染色。其他标准组织学计数器染色，如周期性酸希夫的基础，弹性范吉森或戈莫里银必须进行评估，以及与免疫组织学技术的兼容性需要测试。

基于eosin的染色协议允许（i）细胞细胞质特异性靶向，（ii）均质和完全染色，（iii）易于实现，（iv）快速穿透组织而不产生扩散环等伪影，（v）染色大而致密的软组织样本，以及（vi）与H&E染色方面的组织病理学完全相容。这些要求对于允许将软组织进行高分辨率 X 射线 CT 可视化到细胞水平非常重要。结合最近开发的纳米CT器件12，36，37，无损生成虚拟组织学切片，在对比度和分辨率上与传统组织学数据相媲美可以呈现。这种组合方法将使X射线CT成为微观组织结构的3D可视化的宝贵工具。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
50-ml centrifuge tube by Falcon	VWR	734-0453
Formaldehyde solution, 37%	Carl Roth	CP10.2	acid-free, stabilized with ~10% MeOH
Glacial acetic acid	Alfa Aesar	36289.AP
Eosin Y disodium salt	Sigma-Aldrich	E4382	certified by Biological Stain Commission
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Merck	L1825	Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium
Sample Tubes by Nalgene	Carl Roth	ATK5.1
Rocking Shaker ST5	CAT	60281-0000
Cellulose tissue paper	VWR	115-0600
Forceps, by USBECK Laborgeräte	VWR	232-0096
Microcentrifuge tubes by Eppendorf	VWR	211-2120	safe-lock, 2.0 ml
Ethanol absolute by Baker Analyzed	VWR	80252500
Disposable safety scalpel by Aesculap	VWR	AESCBA210
Petri dish by Sterilin	VWR	391-2019
Plastic pasteur pipette	Carl Roth	EA68.1	graduated, 1 ml
Desiccator by Duran	VWR	SCOT247826954
Silicone grease by Bayer	Sigma-Aldrich	85404	high-vacuum
Carbon dioxide cylinder with standpipe	Linde	3700113	10 kg, short
micro-porous treatment capsule	PLANO GmbH	4614	pore size 78 µm (B)
Bal-Tec CPD 030	Bal-Tec AG		CO2 as drying agent
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD	Zeiss		this stereomicroscope has been updated(1)
Zeiss Xradia Versa 500	Zeiss		this microCT scanner has been updated(2)
Avizo Fire 8.1	Thermo Fisher Scientific
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner	Dectris		single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7)
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner	Excillum		high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7)
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019).
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019).
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015).
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009).
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009).
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019).
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019).