JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول طرق اختبار نشاط الشد الفعالة والقابلة للتكرار لأوتار المريدين من خلال استخدام التركيبات المطبوعة ثلاثية الابعاد المخصصة المناسبة.

Abstract

اضطرابات الأوتار شائعه ، وتؤثر علي الناس من جميع الاعمار ، وغالبا ما تضعف. غالبا ما تفشل العلاجات القياسية ، مثل الادويه المضادة للالتهابات ، وأعاده التاهيل ، والإصلاح الجراحي. من أجل تحديد وظيفة وتر وإثبات فعاليه العلاجات الجديدة ، يجب تحديد الخصائص الميكانيكية للأوتار من النماذج الحيوانية بدقه. وتستخدم نماذج الحيوانية murine الآن علي نطاق واسع لدراسة اضطرابات الأوتار وتقييم العلاجات الجديدة لامراض التين. ومع ذلك ، فان تحديد الخواص الميكانيكية لأوتار الفئران كان صعبا. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام جديد لاختبار وتر الميكانيكية التي تشمل المباراات 3d المطبوعة التي تتطابق تماما مع التشريحية من عظم العضد و عقبي لاختبار ميكانيكيا الأوتار سوبرافياتوس والأوتار اخيل ، علي التوالي. وقد تم تطوير هذه التركيبات باستخدام الإنشاءات ثلاثية الابعاد لتشريح العظام الاصليه ، والنمذجة الصلبة ، وتصنيع المضافات. النهج الجديد القضاء علي الأخطاء التي تجتاح الوقائع (علي سبيل المثال ، فشل في فشل لوحه النمو بدلا من الوتر) ، وانخفاض الوقت الكلي للاختبار ، وزيادة استنساخ. وعلاوة علي ذلك ، هذه الطريقة الجديدة هي قابله للتكيف بسهوله لاختبار الأوتار الأخرى والأوتار murine من الكائنات الأخرى.

Introduction

اضطرابات وتر شائعه ومنتشرة للغاية بين الشيخوخة, رياضي, والسكان النشطة1,2,3. في الولايات المتحدة ، يتم الإبلاغ عن إصابات النسيج الضام 16,400,000 كل عام4 وتمثل 30 ٪ من جميع الإصابات المتعلقة مكتب الطبيب الزيارات3،5،6،7، 8-الآن وتشمل المواقع الأكثر تاثرا الكفة المدورة ، وتر اخيل ، والوتر الرضفي9. علي الرغم من انه تم استكشاف مجموعه متنوعة من العلاجات غير الجراحية والعملية ، بما في ذلك الادويه المضادة للالتهابات ، وأعاده التاهيل ، والإصلاح الجراحي ، والنتائج لا تزال سيئه ، مع عوده محدوده إلى وظيفة ومعدلات عاليه من الفشل5، 6- وقد حفزت هذه النتائج السريرية السيئة الدراسات الاساسيه والانتقالية التي تسعي إلى فهم اعتلال الأوتار وتطوير نهج العلاج الجديدة.

خصائص نشاط الشد هي النتائج الكمية الاوليه تعريف وظيفة وتر. لذلك ، يجب ان يتضمن التوصيف المختبري لاعتلال الأوتار وفعالية العلاج اختبارا دقيقا لخصائص شد الأوتار. وقد وصفت العديد من الدراسات أساليب لتحديد خصائص نشاط من الأوتار من النماذج الحيوانية مثل الفئران والأغنام والطيور والأرانب10،11،12. ومع ذلك ، وقد اختبرت دراسات قليله خصائص نشاط الأوتار murine ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى الصعوبات التي تجتاح الانسجه الصغيرة لاختبار الشد. كما نماذج murine لديها العديد من المزايا لدراسة ميكانيكيا اعتلال الأوتار ، بما في ذلك التلاعب الوراثية ، وخيارات واسعه كاشف ، وانخفاض التكلفة ، وتطوير أساليب دقيقه وفعاله لاختبار الميكانيكا الحيوية الانسجه murine مطلوب.

من أجل اختبار الخصائص الميكانيكية للأوتار بشكل صحيح ، يجب ان تكون الانسجه قد سيطرت علي نحو فعال ، دون الانزلاق أو تمزيق المقالة في واجهه قبضه أو كسر لوحه النمو. في كثير من الحالات ، وخاصه بالنسبة لأوتار قصيرة ، يتم الخناق علي العظم علي طرف واحد ويتم الخناق علي الوتر علي الطرف الآخر. وعاده ما يتم تامين العظام عن طريق تضمينها في مواد مثل راتنجات الايبوكسي13 و بوليميثيلميثريلات14,15. وغالبا ما توضع الأوتار بين طبقتين من الصنفرة ، لاصق مع السيانواكريليت ، والمضمون باستخدام المشابك ضغط (إذا كان المقطع العرضي هو مسطح) أو في وسط المجمدة (إذا كان المقطع العرضي كبير)15،16،17 . وقد طبقت هذه الطرق علي اختبار الميكانيكا الحيوية الأوتار ، ولكن تنشا التحديات بسبب صغر حجم العينات والامتثال للوحه النمو ، والتي لا تحجر18. علي سبيل المثال ، فان قطر الراس murine العضد هو فقط بضعة ملليمترات ، مما يجعل من الصعب الإمساك بالعظم. وعلي وجه التحديد ، فان اختبار الشد لعينات الأوتار إلى العظم من murine غالبا ما يؤدي إلى الفشل في لوحه النمو بدلا من الأوتار أو في الأوتار. المثل ، فان اختبار نشاط وتر العرقوب يشكل تحديا. علي الرغم من ان وتر العرقوب أكبر من الأوتار الأخرى ، فان الكالكيوس صغير ، مما يجعل الإمساك بهذه العظمة أمرا صعبا. يمكن أزاله العظم ، تليها التي تجتاح طرفي الوتر. ومع ذلك ، فان هذا يمنع اختبار التعلق من وتر إلى عظم. مجموعات أخرى تقرير تجتاح العظام عقبي باستخدام التجهيزات المصنوعة خصيصا19،20، رسو من قبل المشابك21، وتحديد في النفس علاج الاسمنت البلاستيك22 أو باستخدام فتحه شكل مخروطي22، ولكن هذه لا تزال الطرق السابقة محدوده بسبب انخفاض استنساخ ، وارتفاع معدلات الفشل التي تجتاح ، ومتطلبات اعداد مملة.

وكان الهدف من الدراسة الحالية لتطوير طريقه دقيقه وفعاله لاختبار نشاط الشد من الأوتار murine ، مع التركيز علي الأوتار فوق العالية والعرقوب كامثله. باستخدام مزيج من أعاده البناء ثلاثي الابعاد من تشريح العظام الاصليه ، والنمذجة الصلبة ، والتصنيع المضافة ، تم تطوير طريقه جديده لقبضه العظام. هذه التركيبات تامين العظام بشكل فعال ، ومنع فشل لوحه النمو ، وانخفاض وقت اعداد العينات ، وزيادة اختبار استنساخ. الطريقة الجديدة قابله للتكيف بسهوله لاختبار الأوتار الأخرى المريدين وكذلك الأوتار في الفئران والكائنات الأخرى.

Protocol

تمت الموافقة علي الدراسات الحيوانية من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام المؤسسي لجامعه كولومبيا. وكانت الفئران المستخدمة في هذه الدراسة من خلفيه C57BL/6J وتم شراؤها من مختبر جاكسون (بار هاربور ، ME ، الولايات الامريكيه). وكانوا يسكنون في ظروف الحاجز الخالي من العوامل المسببة للمرض وزودوا بالغذاء والماء.

1. تطوير العرف تناسب المباراات المطبوعة 3D للعظام التي تجتاح

  1. اكتساب صوره العظام وبناء نموذج العظام 3D
    1. تشريح العظم من الاهتمام في التحضير لإنشاء نموذج 3D و 3D العظام قبضه الطباعة; يتم استخدام عظم العضد والعقبى كامثله في البروتوكول الحالي.
      ملاحظه: يتم توفير تعليمات مفصله لتشريح عينات العضلات وتر العظام للاختبار الميكانيكي في الخطوة 2-1-1. يجب اتباع الخطوات التالية لعزل العظام لغرض إنشاء القبضات العظام المطبوعة ثلاثية الابعاد.
      1. تشريح عظم العضد: موت ببطء الماوس لكل IACUC-الاجراء المعتمد. أزاله الجلد اقصي الطرف العلوي ، وأزاله جميع العضلات فوق عظم العضد ، وتشويه الكوع والمفاصل جلينوهوميرال ، وأزاله بعناية جميع الانسجه الضامة تعلق علي عظم العضد.
      2. تشريح calcaneus: موت ببطء الماوس لكل IACUC-الاجراء المعتمد. أزاله الجلد الطرف السفلي ، وتشويه وتر العرقوب-عقبي المشترك والمفاصل بين عقبي وعظام القدم الأخرى ، وأزاله بعناية جميع الانسجه الضامة تعلق علي عقبي.
    2. اجراء فحص التصوير المقطعي المجهري للعظام بأكملها ، علي سبيل المثال ، مسح عظم العضد وعينات عقبي.
      ملاحظه: اعتمادا علي الماسح الضوئي المستخدم ، ستكون الإعدادات مختلفه. للمسح المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، والإعدادات الموصي بها هي: المسح الضوئي في الطاقة من 55 Kvp ، Al 0.25 فلتر ، بقرار من 6 μm.
      1. اخلطي مسحوق البودرة في الماء فائق النحافة والميكروويف لمده 1-3 دقيقه حتى يذوب الخليط تماما. ومن المفيد ان الميكروويف ل 30-45 s ، ووقف ودوامه ، ومن ثم الاستمرار نحو يغلي. ملء بالتبريد تصل إلى ثلاثه أرباع الكامل مع اجنشا. السماح لل الاغاروز بارد لحوالي 5-10 دقيقه.
      2. ادراج العظام في هلام اجبرز (وهذا سوف يمنع القطع الاثريه الحركة اثناء المسح الضوئي). ادخل المكعب مع العظم في الماسح الضوئي.
        ملاحظه: بالنسبة إلى الماسح الضوئي المستخدم في الدراسة الحالية ، تم استخدام مغير نموذج تلقائي 16 موضع لجميع المسح. يمكن لهذا الماسح الضوئي تحديد التكبير تلقائيا وفقا لحجم العينة وشكلها.
    3. أعاده بناء التصوير المقطعي المجهري مسح الصور الإسقاط في صور المقطع العرضي. استخدم المعلمات الموصي بها لمجموعه الماسح الضوئي/البرنامج لمجرب.
      ملاحظه: بالنسبة للبرنامج المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) فمن المستحسن استخدام المعلمات أعاده الاعمار التالية: تجانس: 0-2 ، تصحيح تصلب الشعاع: 45 ، الحد من الحلقات الدائرية: 4-9 والشرائح في TIFF 16 بت تنسيق.
    4. أنشئ نموذجا ثلاثي الابعاد واحفظه في شكل STL قياسي متوافق مع معظم الطابعات ثلاثية الابعاد والنماذج السريعة. بالنسبة للبرنامج المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، قم بما يلي:
      1. حدد ملف الأمر > فتح لفتح ملف dataset. افتح ملف الحوار > تفضيلات وحدد علامة التبويب خيارات متقدمة .
      2. استخدم خوارزميه التقديم المتكيفة لإنشاء نماذج ثلاثية الابعاد. تقلل هذه الخوارزميه من عدد المثلثات الواجهة وتوفر تفاصيل سطحيه أكثر سلاسة. استخدام 10 كمعلمه محله. تعرف هذه المعلمة المسافة بالبكسل إلى النقطة المجاورة المستخدمة للبحث عن حدود الكائن. تقليل التسامح إلى 0.1 لإنقاص حجم الملف.
        ملاحظه: بعد فتح مجموعه البيانات ، يتم عرض الصور في صفحه "الصور الخام".
      3. لتحديد حجم الفائدة (VOI) ، حدد يدويا صورتين لتعيينهما كاعلي وأسفل نطاق VOI المحدد.
      4. الانتقال إلى الصفحة الثانية ، منطقه الاهتمام. حدد منطقه الاهتمام يدويا علي صوره مقطع عرضي واحد.
        ملاحظه: سيتم تمييز المنطقة المحددة باللون الأحمر (علي سبيل المثال ، منطقه المقطع العرضي لعظم العضد).
      5. كرر الخطوة السابقة كل الصور المقطعة العرضية 10 – 15.
      6. الانتقال إلى الصفحة الثالثة التحديد الثنائي. في قائمه الرسم البياني ، انقر فوق من Dataset. سيتم عرض توزيع الرسم البياني لسطوع من جميع الصور من مجموعه البيانات. أيضا في قائمه الرسم البياني ، انقر فوق القائمة إنشاء ملف نموذج ثلاثي الابعاد .
    5. احفظ نموذج ثلاثي الابعاد للعظام في تنسيق ملف STL.
    6. صقل الشبكة: قم بمعالجه الشبكة لتقليل حجم ملف STL وجعله متوافقا مع اي برنامج تصميم صلب بمساعده الكمبيوتر. بالنسبة للبرنامج المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، اتبع الخطوات التالية:
      1. استيراد شبكه وحدد كل لتحرير. اختر تقليل من مجموعه أدوات التحرير. ثم حدد "موازنة المثلث" من مجموعه أدوات تقليل الهدف. قلل العدد الثلاثي واقبل التغييرات. أعاده حفظ الملف الذي تم تخفيضه حديثا بتنسيق STL عن طريق اختيار تصدير ك...
  2. تصميم تركيبات العظام تناسب مخصص
    1. وتر العظم الحميد
      1. استخدام النمذجة الصلبة بمساعده الكمبيوتر برنامج تصميم لإنشاء نموذج مخصص تناسب العضد التي تجتاح لاعبا أساسيا (الشكل 1، الملفات التكميلية).
        ملاحظه: يتم سرد البرنامج المستخدم في الدراسة الحالية في جدول المواد.
      2. فتح ملف تنسيق STL من عظم العضد في برنامج النمذجة الصلبة وحفظ كملف جزء.
        ملاحظه: بالنسبة للبرنامج المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، تم حفظ كائن العظم ثلاثي الابعاد بتنسيق SLDPRT.
      3. فتح الملف جزء وإنشاء يدويا ثلاث طائرات ذات الصلة تشريحيا (اي ، السهمي ، coronal ، عرضيه).
        1. يدويا تحديد الطائرة السهمي لقطع من خلال المرفق وتر فوق الأعلى في المسك أكبر. تاكد من ان الكتلة ثلاثية الابعاد تحتوي علي المستوي السهمي كمستوي تماثل. لتحقيق ذلك ، أضافه أو قطع المواد من كتله إذا لزم الأمر.
          ملاحظه: هذه الطائرة من التماثل يضمن انه عندما يتم ادراج العينة في المباراات وتقع وتر ووتر المرفقات في المحور المركزي للمباراة.
      4. قياس ابعاد العظم علي طول كل من الطائرات الثلاث (اي ، الطول ، العرض ، الطول).
      5. قياس ابعاد القبضات الاختبار الميكانيكية حيث سيتم إرفاق لاعبا أساسيا المطبوعة 3D.
      6. أبدا بتصميم جزء كتله صلبه (علي سبيل المثال ، اسطوانه صلبه).
        1. تاكد من ان كل بعد من ابعاد الكتلة أكبر بخمسه مم علي الأقل من مكونات عظم العضد.
        2. حساب قيود التصميم من القبضات الاختبار الميكانيكية (اي ، وضمان ان المباراة 3D المطبوعة يمكن تجميعها وتفكيكها بحريه في القبضات اختبار الميكانيكية).
      7. إنشاء نموذج تجميع مع اثنين من المكونات: كتله الصلبة واما عظم العضد الأيمن أو الأيسر. تحديد اتجاه العظم داخل الكتلة (اي ، الزاوية بين الوتر والعظم). تاكد من احتواء حجم العظم بالبالكامل داخل الكتلة.
      8. إنشاء تجويف في كتله باستخدام عظم العضد والعفن. في حاله استخدام البرنامج المحدد في جدول المواداتبع الخطوات التالية:
        1. ادراج جزء التصميم (عظم العضد) وقاعده العفن (كتله اسطوانه) في الجمعية المؤقتة. في اطار التجميع ، حدد الكتلة ، وانقر فوق تحرير مكون من شريط أدوات التجميع .
        2. انقر فوق ادراج ميزات > > تجويف. حدد قياس موحد وادخل 0% كقيمه للقياس في كل الاتجاات.
      9. منع جزء العظام وحفظ التجميع كجزء.
      10. فتح جزء (اسطوانه مع تجويف). قطع الجزء علي طول الطائرة السهمي لإنشاء اثنين من المكونات المتناظرة التي تناسب العظام التقدمية واللاحقة (علي سبيل المثال ، وهما نصف أسطوانات ، كما هو الراي في الشكل 1).
        ملاحظه: تم تصميم مكونين التي تناسب العظام التقدمية واللاحقة. يتضمن المكون الامامي نصف تجويف علي شكل كرويه ممتد من الجانب الامامي من الراس العضد إلى ملحق الأوتار فوق الوتر. يتم تشكيل تجويف المكون الخلفي مثل الجزء الخلفي من عظم العضد (اي الجانب الخلفي من الراس العضد ، والمسك الدرني ، والإنسي والجانبي).
      11. حفظ كل مكون كجزء ملف منفصل.
      12. بالنسبة للمكون الامامي ، تاكد من ان الراس الأحدب مضمن في تجويف الجزء من خلال تحديد التحمل المناسب.
        ملاحظه: في الدراسة الحالية ، باستخدام البرنامج المحدد في جدول المواد، يقترح اتباع الخطوات التالية:
        1. إنشاء قطع تدور لسلاسة هندسه شبكه من تجويف. إنشاء رسم تخطيطي للقطع عن طريق محاكاة الهندسة تجويف وأضافه التخليص المكاني.
          ملاحظه: يسمح التخليص للتجميع الحر والتفكيك بين العظم والمكون الامامي.
      13. تعديل المكون الخلفي لتقليد الهندسة تجويف لإنشاء قطع التي تضيف أزاله ، كما هو موضح أعلاه للمكون الامامي.
      14. جعل قطع في الطائرة العرضية بدءا من الجزء العلوي من المكون الخلفي حتى قمة المسك أكبر/اقل.
        ملاحظه: كما راينا في الشكل 1 والشكل 2، يتضمن المكون الخلفي قطعا تخلق فتحه عند مرفق الوتر.
      15. إنشاء تناسب دافئ بين المكونات اثنين للسماح للتجميع الحر والتفكيك.
        ملاحظه: تم إنشاء ثقب رمح تناسب مع أزاله التشغيل فضفاضة لمباراات في الدراسة الحالية.
      16. إنشاء نماذج مراه 3D لكل مكون من لاعبا أساسيا للطرف الآخر (اي ، اليسار أو اليمين).
      17. أضافه حفر علي الجزء السفلي من المباراات للتمييز بين الجانبين الأيمن والأيسر.
      18. حفظ جميع أجزاء المباراات في شكل الملف القياسي STL استعدادا للطباعة ثلاثية الابعاد.
    2. وتر العرقوب-عظم الككانيوس
      1. اتبع نفس الخطوات كما هو موضح أعلاه ل سوبرااسباناتوس-الرئيسية لاعبا أساسيا.
        ملاحظه: مجموعه واحده فقط من المباراات ضرورية لأخيل-calcaneal ، منذ تشريح العظام calcaneal اليسار واليمين هو متناظرة تقريبا.

2. اختبار نشاط لأوتار المريدين

  1. اعداد العينات وقياس المساحات المقطعية
    1. تشريح العضلات-وتر-العظم من الفائدة في التحضير لاختبار الشد الميكانيكية.
      1. تشريح العضلات العضلية-وتر-عظم العضد العظام عينه
        1. موت ببطء الماوس في الاجراء المعتمد IACUC. ضع الماوس في موضع عرضه. اجراء شق في الجلد من فوق الكوع من السبابة نحو الكتف.
        2. بعناية أزاله الجلد مع تشريح حاده بحيث عضلات الكتف مرئية. أزاله الانسجه المحيطة بعظم العضد حتى يتم كشف العظام ويمكن ان تعقد بشكل أمن مع ملقط.
        3. عقد عظم العضد مع ملقط وأزاله بعناية العضلات الداليه وشبه المنحرفة لفضح قوس العظم العضلي. التعرف علي المفصل الاخرمي بالترقوة وفصل الترقوة بعناية من ضخامة العظمة مع شفره مشرط.
        4. مع الحرص علي عدم الاضرار بالوتر فوق البطيني وملحقه العظمي ، قم بازاله العضلات من مرفقه الكتف باستخدام شفره مشرط. مع الحرص علي عدم الاضرار وتر فوق الراس ومرفقها عظميه ، وفصل رئيس عضد من غلينويد. باستخدام شفره مشرط ، والكبسولات المشتركة والمتعدي ، والأوتار الصغيرة.
        5. تشويه مفصل الكوع للفصل بين عظم العضد من زند ونصف القطر. عزل عظم العضد--العضلات الوتر--العينة العضلية وتنظيف قباله الانسجه الرخوة الزائدة علي عظم العضد والراس عضد.
      2. تشريح العظم وتر العرقوب-عقبي عينه العظام
        1. موت ببطء الماوس في الاجراء المعتمد IACUC. ضع الماوس في موضع عرضه. الحرص علي عدم الاضرار بوتر العرقوب وملحقه العظمي ، وأزاله الجلد مع تشريح حاد بحيث يتم كشف العضلات حول الكاحل والمفاصل في الركبة.
        2. باستخدام شفره مشرط, بدءا من المرفق وتر اخيل-عقبي, فصل بعناية العضلات التواميه من المرفقات القريبة.
        3. التشويه بعناية عقبي من العظام المجاورة المختلفة. عزل العينة وتر العرقوب-عقبي وتنظيف الانسجه الرخوة الزائدة.
    2. تحديد المنطقة المقطعية لوتر باستخدام التصوير المقطعي المجهري.
      ملاحظه: بالنسبة للمسح المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، الإعدادات الموصي بها هي: المسح الضوئي في الطاقة من 55 Kvp ، Al 0.25 فلتر ، في قرار من 5 μm.
      1. اخلطي مسحوق البودرة في الماء فائق النحافة والميكروويف لمده 1-3 دقيقه حتى يذوب الخليط تماما. ومن المفيد ان الميكروويف ل 30-45 s ، ووقف ودوامه ، ومن ثم الاستمرار نحو يغلي. ملء بالتبريد تصل إلى ثلاثه أرباع الكامل مع اجنشا. السماح لل الاغاروز بارد لحوالي 5-10 دقيقه.
      2. تعليق العينة في البرد عن طريق إدخال العظم راسا علي عقب.
        ملاحظه: يجب ان تكون العظام فقط في هلام اجبرز. يجب تعليق الوتر والعضلات في الخارج.
    3. بعد الفحص ، قم بازاله العضلات برفق من الوتر باستخدام شفره المشرط. ادراج عينه في لاعبا أساسيا 3D المطبوعة.
      ملاحظه: القبضات قابله لأعاده الاستخدام لكل اختبار. لا تستخدم الغراء أو الايبوكسي في المباراة الاساسيه. يتم عقد العظام في نوبة الصحافة.
    4. ادراج والغراء الوتر بين ورقه الانسجه رقيقه مطوية (2 سم × 1 سم) والمشبك بناء باستخدام القبضات الفيلم رقيقه. إرفاق 3D المطبوعة لاعبا أساسيا مع العينة في السيطرة الاختبار.
    5. ادراج العينة والقبضات في حمام الاختبار من الفوسفات المالحة مخزنه (تلفزيوني) في 37 درجه مئوية (اي ، درجه حرارة الجسم الماوس23).
  2. اختبار الشد
    1. اجراء اختبار الشد الميكانيكية علي اطار اختبار المواد.
      ملاحظه: بالنسبة لاطار الاختبار المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، فان البروتوكول الموصي به هو:
      1. حدد طول المقياس كالمسافة من مرفق الوتر إلى القبضة العلوية.
      2. شرط مسبق مع 5 دورات بين 0.05 N و 0.2 N.
      3. عقد ل120 s.
      4. استخدام التوتر إلى فشل 0.2 ٪/s.
    2. جمع البيانات تشوه الحمل.
    3. احسب السلالة باعتبارها الازاحه بالنسبة لطول المقياس الاولي للوتر.
    4. حساب الإجهاد كما القوه مقسوما علي المنطقة الاوليه الوتر المقطعية (كما تقاس من microCT).
    5. إذا كانت مهتمة في السلوك لزجه ، وأداء الاسترخاء الإجهاد قبل اختبار التوتر إلى الفشل واستخدام البيانات لحساب المعلمات مثل a ، B ، C ، tau1 ، و tau2 من نموذج quasilinear لزج24.
    6. من منحني الحمل تشوه ، وحساب صلابة (المنحدر من الجزء الخطي من منحني) ، والحد الأقصى للقوه ، والعمل علي الغلة (المنطقة تحت المنحني تصل إلى قوه الغلة).
      1. تحديد الجزء الخطي عن طريق اختيار نافذه من النقاط في منحني التحميل التشوه الذي يزيد من قيمه R2 للانحدار المربعات الأقل خطيا25.
      2. تحديد صلابة كمنحدر الجزء الخطي من منحني الحمولة الازاحه25،26.
    7. من منحني سلاله الإجهاد ، وحساب المعامل (المنحدر من الجزء الخطي من منحني) ، وقوه (الحد الأقصى من الإجهاد) ، والمرونة (المنطقة تحت المنحني تصل إلى الإجهاد الغلة).
      ملاحظه: باستخدام خوارزميه RANSAC ، يتم تعريف سلاله الغلة (x-القيمة) كنقطه الاولي عندما انحرفت y-تناسب أكثر من 0.5 ٪ من قيمه الإجهاد المتوقع (y-القيمة). الإجهاد الناتج هو قيمه y المقابلة لسلاله الغلة.
      ملاحظه: بالاضافه إلى تحميل الشد الرتيب للفشل الموصوف في الدراسة الحالية ، يمكن ان يوفر التحميل الدوري معلومات مهمة حول التعب الوتر و/أو خصائص الفيكومرنه. علي سبيل المثال ، وذكرت فريدمان وآخرون خصائص التعب من الأوتار العرقوب murine27.
    8. بعد الانتهاء من اختبار الشد ، اجراء فحص التصوير المقطعي المجهري للعظام بأكملها ، علي سبيل المثال ، مسح عظم العضد وعينات عقبي.
      ملاحظه: بالنسبة للمسح المستخدم في الدراسة الحالية (جدول المواد) ، الإعدادات الموصي بها هي: المسح الضوئي في الطاقة من 55 Kvp ، Al 0.25 فلتر ، بقرار من 6 μm.
      1. كرر الخطوات 1.1.2.1 – 1.1.2.2.
    9. كرر الخطوة 1-1-3.
    10. استخدم برنامج المرئيات ثلاثية الابعاد المتوافق مع الماسح الضوئي لإنشاء نموذج ثلاثي الابعاد للكائن الممسوح ضوئيا الذي تم تقديمه بحجم الصوت.
      ملاحظه: يتم سرد البرنامج المستخدم في الدراسة الحالية في جدول المواد.
    11. تحديد وضع الفشل ومنطقه موقع الفشل عن طريق فحص الكائن ثلاثي الابعاد.
  3. التحليل الإحصائي: إظهار جميع نتائج العينات علي انها تعني ± الانحراف المعياري (SD). قم باجراء مقارنات بين المجموعات باستخدام اختبارات t الخاصة بالطالب (ثنائيه الذيل وغير المقترنة). تعيين اهميه ك p < 0.05.
    ملاحظه: البرمجيات الاحصائيه المستخدمة في الدراسة الحالية مدرجه في جدول المواد.

النتائج

تم استخدام التركيبات المطبوعة ثلاثية الابعاد لاختبار الأوتار القديمة التي يبلغ عمرها 8 أسابيع ووتر العرقوب. فشلت جميع العينات المختبرة ميكانيكيا في الاطروحه ، كما تتميز بالمسح microCT ، والتفتيش البصري ، وتحليل الفيديو بعد اختبارات الشد. ويرد في الشكل 3مقارنه واحد إلى واحد م?...

Discussion

تستخدم نماذج الحيوانية murine عاده لدراسة اضطرابات الأوتار ، ولكن توصيف خصائصها الميكانيكية أمر صعب وغير مالوف في الأدب. الغرض من هذا البروتوكول هو وصف طريقه فعاله وقابله للتكرار لاختبار الشد من الأوتار murine. الأساليب الجديدة خفضت الوقت اللازم لاختبار عينه من ساعات إلى دقائق والقضاء علي قطع?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

وقد دعمت الدراسة من قبل المعاهد القومية للصحة/NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseFisher ScientificBP160-100Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT Bruker BioSpin CorpSkyscan 1272 Used by authors
ElectroForce TA Instruments3200Testing platform
Ethanol 200 ProofFisher ScientificA4094Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach gripsCustom madeUsed by authors
KimwipesKimberly-Clark S-8115As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)Bruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)100 ml 
MeshmixerAutodeskhttp://www.meshmixer.com/Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS Stratasys LTDPrecision Prototyping
Objet StudioStratasys LTDUsed by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered SalineThermoFisher Scientific100100312.5 L of 10% PBS 
S&T ForcepsFine Science Tools00108-11Used by authors
Scalpel Blade - #11Fine Science Tools10011-00Used by authors
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools10003-12Used by authors
SkyScan 1272Bruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-VoxBruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NReconBruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CADDassault SystèmesSolidWorks Research SubsriptionSolid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlueLoctite234790As suggested in protocol
Testing bathCustom madeUsed by authors
Thin film grips Custom madeUsed by authors
VeroWhitePlusStratasys LTDNA3D printing material used by authors
WinTest WinTest SoftwareUsed by authors to collect data

References

  1. Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
  2. Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
  3. Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
  4. Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
  5. Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
  6. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
  7. Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
  8. Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
  9. Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
  10. Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
  11. West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
  12. Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
  13. Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
  14. Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
  15. Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
  16. Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
  17. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
  18. Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
  19. Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
  20. Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
  21. Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
  22. Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
  23. Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
  24. Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
  25. Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
  26. Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
  27. Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
  28. Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
  29. Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
  30. Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
  31. Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
  32. Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
  33. Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
  34. Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
  35. Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
  36. Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
  37. Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
  38. Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
  39. Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
  40. Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy - Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
  41. Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
  42. Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 murine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved