Teste biomecânico de tendões murinos

Resumo

O protocolo descreve métodos de teste biomecânicos de tração eficientes e reprodutíveis para tendões murinos através do uso de luminárias impressas em 3D personalizadas.

Resumo

As desordens do tendão são comuns, afetam povos de todas as idades, e são frequentemente debilitantes. Tratamentos padrão, como drogas anti-inflamatórias, reabilitação e reparo cirúrgico, muitas vezes falham. A fim de definir a função tendínea e demonstrar a eficácia de novos tratamentos, as propriedades mecânicas dos tendões de modelos animais devem ser determinadas com precisão. Os modelos animais murinos são agora amplamente utilizados para estudar distúrbios tendíneos e avaliar novos tratamentos para tendinopatias; no entanto, determinar as propriedades mecânicas dos tendões do mouse tem sido desafiador. Neste estudo, um novo sistema foi desenvolvido para testes mecânicos tendinosos que incluem luminárias impressas em 3D que correspondem exatamente às anatomias do úmero e do calcâneo para testar mecanicamente tendões supraespinal e tendões de Aquiles, respectivamente. Estes dispositivos elétricos foram desenvolvidos usando reconstruções 3D de anatomia óssea nativa, modelagem sólida e manufatura aditiva. A nova abordagem eliminou falhas de preensão vesícula (por exemplo, falha na falha da placa de crescimento em vez do tendão), tempo de teste global diminuído e maior reprodutibilidade. Além disso, este novo método é prontamente adaptável para o teste de outros tendões e tendões murinos de outros animais.

Introdução

As desordens tendíneas são comuns e altamente prevalentes entre as populaçõesde^{envelhecimento, Atlético}e ativo^1,2,3. Nos Estados Unidos, 16,4 milhões lesões do tecido conjuntivo são relatadas a cada ano⁴ e respondem por 30% de todas as visitas de consultório médico relacionadas a lesões^3,5,6,7, a ⁸. Os sítios mais comumente afetados incluem o manguito rotador, o tendão de Aquiles e o tendão patelar⁹. Embora uma variedade de tratamentos não operativos e operativos tenha sido explorada, incluindo fármacos anti-inflamatórios, reabilitação e reparação cirúrgica, os resultados permanecem pobres, com retorno limitado à função e altas taxas de falha^5, a ⁶. Estes resultados clínicos pobres motivaram estudos básicos e translacional que procuram compreender a tendinopatia e desenvolver aproximações novas do tratamento.

As propriedades biomecânicas elásticas são os desfechos quantitativos primários que definem a função tendínea. Conseqüentemente, a caracterização do laboratório da tendinopatia e da eficácia do tratamento deve incluir um teste rigoroso de propriedades elásticas do tendão. Inúmeros estudos descreveram métodos para determinar as propriedades biomecânicas de tendões de modelos animais como ratos, ovinos, cães e coelhos^10,11,12. No entanto, poucos estudos testaram as propriedades biomecânicas dos tendões murinos, principalmente devido às dificuldades em prender os pequenos tecidos para testes de tração. Como os modelos murinos têm inúmeras vantagens para o estudo mecanisticamente tendinopatia, incluindo a manipulação genética, extensas opções de reagentes e baixo custo, o desenvolvimento de métodos precisos e eficientes para testar biomecanicamente os tecidos murinos é necessário.

A fim testar corretamente as propriedades mecânicas dos tendões, o tecido deve ser agarrado eficazmente, sem deslizar ou rasgar vesícula na relação do aperto ou no fraturamento da placa do crescimento. Em muitos casos, particularmente para tendões curtos, o osso é agarrado em uma extremidade e o tendão é agarrado na outra extremidade. Os ossos são tipicamente fixados incorporando-os em materiais tais como a^{resina de cola}Epoxy¹³ e o polimetilmetacrilato^14,15. Os tendões são frequentemente colocados entre duas camadas de lixa, coladas com cianoacrilato, e fixadas usando grampos de compressão (se a seção transversal é plana) ou em um meio congelado (se a seção transversal é grande)^15,16,17 . Estes métodos têm sido aplicados a testes biomecânicos de tendões murinos, mas os desafios surgem devido ao pequeno tamanho dos espécimes e à conformidade da placa de crescimento, que nunca ossifica¹⁸. Por exemplo, o diâmetro da cabeça úmero murino é somente alguns milímetros, assim fazendo a preensão do osso difícil. Especificamente, os testes de tração de amostras de tendão-osso murino supraespinal muitas vezes resultam em falha na placa de crescimento, em vez de no tendão ou na entese do tendão. Da mesma forma, o teste biomecânico do tendão de Aquiles é desafiador. Embora o tendão de Aquiles seja maior do que outros tendões murinos, o calcâneo é pequeno, dificultando a preensão deste osso. O osso pode ser removido, seguido por agarrar as duas extremidades do tendão; Entretanto, isto impede o teste do acessório do tendão-à-osso. Outros grupos relatam prender o osso do calcâneo usando dispositivos elétricos feitos medida^19,20, ancorando pelas braçadeiras²¹, fixando no cimento plástico²² da cura do auto ou usando um entalhe cônico²², contudo estes os métodos anteriores permanecem limitados pela baixa reprodutibilidade, por taxas de falha de preensão elevadas, e por exigências tediosas da preparação.

O objetivo do presente estudo foi desenvolver um método preciso e eficiente para testes biomecânicos de tração de tendões murinos, com foco nos tendões supraespinal e Aquiles como exemplos. Usando uma combinação de reconstruções 3D da anatomia nativa do osso, da modelagem contínua, e da fabricação aditiva, um método novo foi desenvolvido para segurar os ossos. Estes dispositivos elétricos efetivamente garantiu os ossos, impediu a falha da placa de crescimento, diminuição do tempo de preparação do espécime, e aumento da reprodutibilidade do teste. O novo método é prontamente adaptável para testar outros tendões murinos, bem como tendões em ratos e outros animais.

Protocolo

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Columbia. Camundongos utilizados neste estudo foram de um fundo C57BL/6J e foram comprados no laboratório Jackson (Bar Harbor, ME, EUA). Eles foram alojados em condições de barreira livre de patógenos e foram fornecidos alimentos e água ad libitum.

1. desenvolvimento de Custom-Fit 3D impresso luminárias para prender o osso

1. Aquisição de imagem óssea e construção de modelos ósseos 3D
   1. Dissecar o osso do interesse na preparação para a criação do modelo 3D e a impressão do aperto do osso 3D; o úmero e o calcâneo são usados como exemplos no protocolo atual.
      Nota: instruções detalhadas para dissecar espécimes osso-tendão-músculo para testes mecânicos são fornecidas na etapa 2.1.1. Os seguintes passos devem ser seguidos para isolar os ossos com a finalidade de criar apertos ósseos impressos em 3D.
      1. Dissecção do úmero: Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Remova a pele da extremidade superior, remova todos os músculos sobre o úmero, desarticule o cotovelo e as junções glenoumeral, e remova com cuidado todos os tecidos conexivos Unidos ao úmero.
      2. Dissecção do calcâneo: Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Remova a pele da extremidade mais baixa, desarticule a junção do tendão-calcâneo de Aquiles e as junções entre o calcâneo e os outros ossos do pé, e remova com cuidado todos os tecidos conexivos Unidos ao calcâneo.
   2. Realize uma tomografia computadorizada de todo o osso, por exemplo, analise as amostras de úmero e calcâneo.
      Observação: dependendo do scanner usado, as configurações serão diferentes. Para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 6 μm.
      1. Misture o pó do agarose na água ultrapura e na microonda para 1-3 minutos até que o agarose esteja dissolvido completamente. É útil para microondas para 30-45 s, parar e redemoinho, e depois continuar para ferver. Encha os criotubos até três quartos cheios com agarose. Deixe o agarose esfriar por cerca de 5-10 min.
      2. Insira o osso no gel de agarose (isso impedirá artefatos de movimento durante a digitalização). Insira um criotubo com osso no scanner.
         Nota: para o scanner utilizado no estudo atual, um trocador automático de amostras de 16 posições foi usado para todos os exames. Este scanner pode selecionar automaticamente a ampliação de acordo com o tamanho e a forma de uma amostra.
   3. Reconstrua imagens da projeção da varredura do tomography microcomputado em imagens do cross-section. Use os parâmetros recomendados para a combinação de scanner/software do experimentador.
      Nota: para o programa utilizado no presente estudo (tabela de materiais) recomenda-se a utilização dos seguintes parâmetros de reconstrução: suavização: 0-2, correção de endurecimento por feixe: 45, redução de artefactos em anel: 4-9 e para reconstruir fatias em TIFF de 16 bits Formato.
   4. Crie um modelo 3D e salve em um formato STL padrão compatível com a maioria das impressoras 3D e prototipagem rápida. Para o programa utilizado no estudo atual (tabela de materiais), faça o seguinte:
      1. Selecione o arquivo de comando > abrir para abrir o conjunto de dados de arquivo. Abra o arquivo de diálogo > preferências e selecione a guia avançado .
      2. Use o algoritmo de renderização adaptável para construir os modelos 3D. Este algoritmo minimiza o número de triângulos faceta e fornece detalhes de superfície mais suaves. Use 10 como o parâmetro de localidade; Este parâmetro define a distância em pixels para o ponto vizinho usado para localizar a borda do objeto. Minimize a tolerância para 0,1 para diminuir o tamanho do arquivo.
         Nota: depois de abrir o conjunto de dados, as imagens são mostradas na página "imagens RAW".
      3. Para especificar o volume de juros (VOI), selecione manualmente duas imagens para definir como a parte superior e inferior do intervalo VOI selecionado.
      4. Mover para a segunda página, região de interesse. Selecione manualmente a região de interesse em uma única imagem de seção transversal.
         Observação: a região selecionada será destacada em vermelho (ou seja, a área de corte transversal do úmero).
      5. Repita a etapa anterior a cada 10 – 15 imagens de seção transversal.
      6. Mover para a terceira página seleção binária. No menu do histograma, clique em do conjunto de dados. A distribuição do histograma de brilho de todas as imagens do conjunto de dados será mostrada. Também no menu do histograma, clique no menu criar um arquivo de modelo 3D .
   5. Salve um modelo 3D do osso no formato de arquivo STL.
   6. Refine a malha: manipule a malha para reduzir o tamanho do arquivo STL e torne-o compatível com qualquer programa de design assistido por computador de modelagem sólida. Para o programa utilizado no estudo atual (tabela de materiais), siga os passos abaixo:
      1. Importe malha e selecione tudo para editar. Escolha reduzir do conjunto de ferramentas Editar. Em seguida, selecione orçamento do triângulo no conjunto de ferramentas reduzir destino. Reduza a contagem tri e aceite as alterações. Salve novamente o arquivo recém-reduzido no formato STL escolhendo Exportar como...
2. Projeto de dispositivos elétricos do osso do costume-ajuste
   1. Osso tendão-úmero de supraspinatus
      1. Use um programa de desenho assistido por computador de modelagem sólida para criar um modelo de ajuste personalizado de dispositivo elétrico de preensão de úmero (Figura 1, arquivos suplementares).
         Nota: o programa utilizado no estudo atual está listado na tabela de materiais.
      2. Abra o arquivo de formato STL do osso úmero em um programa de modelagem sólida e salve como um arquivo de peça.
         Nota: para o software utilizado no estudo atual (tabela de materiais), o objeto ósseo 3D foi salvo no formato SLDPRT.
      3. Abra o arquivo de peça e crie manualmente três planos anatomicamente relevantes (ou seja, sagital, coronal, transversal).
         1. Definir manualmente o plano sagital para cortar através do acessório do tendão do supraespinal na tuberosidade maior. Assegure-se de que o bloco 3D contenha o plano sagital como um plano de simetria. Para conseguir isso, adicione ou corte material do bloco, se necessário.
            Nota: este plano de simetria assegura que quando o espécime é introduzido nos dispositivos elétricos o tendão e o acessório do tendão são situados no eixo central do dispositivo elétrico.
      4. Medir as dimensões do osso ao longo de cada um dos três planos (ou seja, altura, largura, comprimento).
      5. Meça as dimensões dos apertos mecânicos do teste onde o dispositivo elétrico impresso 3D será Unido.
      6. Comece por projetar uma peça de bloco sólido (por exemplo, um cilindro sólido).
         1. Assegure-se de que cada dimensão do bloco seja pelo menos 5 milímetros maior do que as dimensões do úmero.
         2. Conta para restrições de design de alças de testes mecânicos (ou seja, garantir que o dispositivo elétrico impresso em 3D pode ser montado e desmontado livremente nos apertos de teste mecânicos).
      7. Crie um modelo de montagem com dois componentes: o bloco sólido e o osso do úmero direito ou esquerdo. Definir a orientação do osso dentro do bloco (ou seja, o ângulo entre o tendão e o osso). Assegure-se de que todo o volume ósseo caiba dentro do bloco.
      8. Crie uma cavidade no bloco usando o osso do úmero como o molde. Se estiver usando o software especificado na tabela de materiais, siga as seguintes etapas:
         1. Insira a peça de design (úmero) e a base do molde (bloco de cilindros) em uma montagem provisória. Na janela de montagem, selecione o bloco e clique em Editar componente na barra de ferramentas do assembly .
         2. Clique em inserir > recursos > cavidade. Selecione dimensionamento uniforme e insira 0% como o valor a ser dimensionado em todas as direções.
      9. Suprimir a parte óssea e salvar a montagem como uma peça.
      10. Parte aberta (cilindro com cavidade). Corte a peça ao longo do plano sagital para criar dois componentes simétricos que se encaixam no osso anterioramente e posteriormente (por exemplo, dois cilindros de meio, como visto na Figura 1).
          Nota: dois componentes são projetados que cabem o osso anteriormente e posterior. O componente anterior inclui uma meia cavidade esférica-dada forma estendida do lado anterior da cabeça úmero até o acessório do tendão do supraespinal. A cavidade do componente posterior é moldada como a parte posterior do úmero (i.e., lado posterior da cabeça do úmero, tuberosidade deltóide e epicôndilo medial e lateral).
      11. Salve cada componente como uma parte separada do arquivo.
      12. Para o componente anterior, assegure-se de que a cabeça do úmero esteja encaixada na cavidade da peça definindo tolerâncias apropriadas.
          Nota: no estudo atual, usando o software especificado na tabela de materiais, sugere-se seguir os passos abaixo:
          1. Crie um corte revolvido para suavizar a geometria da malha da cavidade. Crie um esboço para o corte emulando a geometria da cavidade e adicionando uma folga locacional.
             Nota: a folga permite a montagem e desmontagem livres entre o osso e o componente anterior.
      13. Modifique o componente posterior para imitar a geometria da cavidade para criar um corte que adicione folga, como descrito acima para o componente anterior.
      14. Faça um corte no plano transversal a partir do topo do componente posterior até a crista do tubérculo maior/menor.
          Nota: como visto na Figura 1 e na Figura 2, o componente posterior inclui um corte que cria uma abertura no acessório do tendão.
      15. Crie um ajuste confortável entre os dois componentes para permitir a montagem e desmontagem livres.
          Nota: um furo-eixo cabido com uma folga running frouxa foi criado para os dispositivos elétricos no estudo atual.
      16. Crie modelos de espelhos 3D para cada componente do acessório para o membro oposto (ou seja, esquerda ou direita).
      17. Adicione um etch na parte inferior dos dispositivos elétricos para distinguir entre os lados esquerdo e direito.
      18. Salve todas as peças de fixação no formato de arquivo padrão STL em preparação para impressão 3D.
   2. Tendão de Aquiles-osso calcâneo
      1. Siga as mesmas etapas descritas acima para o dispositivo elétrico principal supraspinatus-humeral.
         Nota: apenas um conjunto de luminárias é necessário para o calcâneo-Aquiles, uma vez que a anatomia dos ossos do calcâneo esquerdo e direito é quase simétrica.

2. testes biomecânicos de tendões murinos

1. Preparação de amostras e medição da área transversal
   1. Dissecar o músculo-tendão-osso do interesse na preparação para o teste mecânico elástico. No estudo atual, espécimes do osso do músculo-tendão-úmero do supraespinal (n = 10, 5 machos, 5 fêmeas) e músculo do gastrocnêmio-espécimes do osso do tendão-calcâneo de Aquiles (n = 12, 6 machos, 6 fêmeas) foram isolados dos ratos C57Bl/6J velhos da semana 8.
      1. Dissecção do espécime do osso do músculo-tendão-úmero do supraespinal
         1. Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Posicione o mouse em uma posição propensa. Faça uma incisão na pele de cima do cotovelo da pata para o ombro.
         2. Retire cuidadosamente a pele com dissecção contundente para que a musculatura do ombro seja visível. Retire o tecido em torno do úmero até que o osso é exposto e pode ser mantido firmemente com fórceps.
         3. Segure o úmero com fórceps e Retire cuidadosamente os músculos deltóide e trapézios para expor o arco coracoacromial. Identifique a articulação acromioclavicular e separe cuidadosamente a clavícula do acrômio com uma lâmina de bisturi.
         4. Tomando o cuidado para não danificar o tendão do supraespinal e seu acessório ósseo, remova o músculo de seu acessório escapular usando uma lâmina do bisturi. Tomando o cuidado para não danificar o tendão do supraespinal e seu acessório ósseo, separe a cabeça úmero do glenoid; usando uma lâmina de bisturi, dilacerar a cápsula articular e os tendões infraspinatus, subscapularis e teres Minor.
         5. Desarticular a articulação do cotovelo para separar o úmero da ulna e do raio. Isole o espécime do tendão-músculo do úmero-supraespinal e limpe fora dos tecidos macios excedentes no úmero e na cabeça úmero.
      2. Dissecção do tendão de Aquiles-amostra óssea do calcâneo
         1. Eutanizar um rato por procedimento aprovado pelo IACUC. Posicione o mouse em uma posição propensa. Tomando o cuidado para não danificar o tendão de Aquiles e seu acessório ósseo, remova a pele com dissecção sem corte de modo que a musculatura em torno das junções do tornozelo e do joelho esteja exposta.
         2. Usando uma lâmina do bisturi, começando no acessório do tendão-calcâneo de Achilles, retire com cuidado o músculo do gastrocnêmio de seus anexos proximal.
         3. Desarticular cuidadosamente o calcâneo dos vários ossos adjacentes. Isolar o tendão de Aquiles-calcâneo espécime e limpar o excesso de tecidos moles.
   2. Determine a área transversal do tendão usando tomografia computadorizada.
      Nota: para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 5 μm.
      1. Misture o pó do agarose na água ultrapura e na microonda para 1-3 minutos até que o agarose esteja dissolvido completamente. É útil para microondas para 30-45 s, parar e redemoinho, e depois continuar para ferver. Encha os criotubos até três quartos cheios com agarose. Deixe o agarose esfriar por cerca de 5-10 min.
      2. Suspenda o espécime no criotubo introduzindo o osso upside-down.
         Nota: apenas o osso deve estar no gel de agarose. O tendão e o músculo devem ser suspensos lá fora.
   3. Após a varredura, remova delicadamente o músculo do tendão usando a lâmina do bisturi. Insira a amostra no dispositivo impresso em 3D.
      Nota: as alças são reutilizáveis para cada teste. Não use cola ou epóxi no dispositivo elétrico; o osso é mantido em um ajuste da imprensa.
   4. Insira e cole o tendão entre um papel de tecido fino dobrado (2 cm x 1 cm) e prenda a construção usando apertos de filme fino. Fixe o dispositivo impresso 3D com a amostra nos apertos de teste.
   5. Insira a amostra e as alças em um banho de teste de fosfato salina tamponado (PBS) a 37 ° c (ou seja, a temperatura do corpo do mouse²³).
2. Testes de tração
   1. Execute o teste mecânico elástico em um frame de teste material.
      Observação: para o quadro de teste usado no estudo atual (tabela de materiais), o protocolo recomendado é:
      1. Defina o comprimento do calibre como a distância do acessório do tendão à aderência superior.
      2. Pré-requisito com 5 ciclos entre 0, 5 N e 0,2 N.
      3. Segure por 120 s.
      4. Use uma tensão à falha de 0.2%/s.
   2. Colete dados de deformação de carga.
   3. Calcule a deformação como o deslocamento em relação ao comprimento do calibre inicial do tendão.
   4. Calcule o stress como a força dividida pela área transversal do tendão inicial (medida do microCT).
   5. Se estiver interessado em comportamento viscoelástico, realize um relaxamento de estresse antes do teste de tensão para falha e use os dados para calcular parâmetros como a, B, C, Tau1 e Tau2 do modelo viscoelástico equações²⁴.
   6. A partir da curva de deformação da carga, calcule a rigidez (inclinação da porção linear da curva), a força máxima e o trabalho a produzir (a área a curva até a força de escoamento).
      1. Identifique a porção linear escolhendo uma janela de pontos na curva de deformação de carga que maximiza o valor de R² para uma regressão linear de mínimos quadrados²⁵.
      2. Determine a rigidez como a inclinação da porção linear da curva de deslocamento de carga^25,26.
   7. A partir da curva de deformação de tensão, calcule o módulo (inclinação da porção linear da curva), a força (tensão máxima) e a resiliência (área a curva até a tensão de escoamento).
      Nota: usando o algoritmo RANSAC, a deformação de rendimento (valor x) é definida como o primeiro ponto quando o ajuste y se desviou mais de 0,5% do valor de tensão esperado (valor y). A tensão de escoamento é o valor y correspondente da cepa de escoamento.
      Nota: além do carregamento de tração monotônico à falha descrita no estudo atual, o carregamento cíclico pode fornecer informações importantes sobre a fadiga do tendão e/ou propriedades viscoelásticas. Por exemplo, Freedman et al. relataram Propriedades de fadiga dos tendões murinos de Aquiles²⁷.
   8. Após a conclusão do teste de tração, realize uma tomografia computadorizada de todo o osso, por exemplo, analise as amostras de úmero e calcâneo.
      Nota: para o scanner utilizado no estudo atual (tabela de materiais), as configurações recomendadas são: digitalizar a uma energia de 55 kVp, Al 0,25 filtro, com uma resolução de 6 μm.
      1. Repita as etapas 1.1.2.1 – 1.1.2.2.
   9. Repita a etapa 1.1.3.
   10. Use um programa de visualização 3D compatível com o scanner para criar um modelo 3D renderizado por volume do objeto digitalizado.
       Nota: o programa utilizado no estudo atual está listado na tabela de materiais.
   11. Determine o modo de falha e a área do site de falha inspecionando o objeto 3D.
3. Análise estatística: mostrar todos os resultados da amostra como média ± desvio padrão (DP). Fazer comparações entre grupos usando testes t de Student (bicaudal e não emparelhado). Definir significância como p < 0, 5.
   Nota: o software estatístico utilizado no presente estudo está listado na tabela de materiais.

Resultados

os dispositivos elétricos 3D-Printed foram usados para testar o supraespinal murino velho de 8 semanas e os tendões de Achilles. Todas as amostras testadas mecanicamente falharam na entese, caracterizada por exames de microtomografia, inspeção visual e análise de vídeo após testes de tração. Uma comparação um-para-um dos métodos anteriores e atuais para o teste do tendão do supraespinal em nosso laboratório é mostrada na Figura 3. No método anterior²⁸<...

Discussão

Os modelos animais murinos são comumente usados para estudar distúrbios tendinosos, mas a caracterização de suas propriedades mecânicas é desafiadora e incomum na literatura. A finalidade deste protocolo é descrever um método eficiente e reprodutível do tempo para o teste elástico de tendões murino. Os novos métodos reduziram o tempo necessário para testar uma amostra de horas a minutos e eliminaram um artefato importante que era um problema comum em métodos anteriores.

Diversas ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100	Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose
Bruker microCT	Bruker BioSpin Corp	Skyscan 1272	Used by authors
ElectroForce	TA Instruments	3200	Testing platform
Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips	Custom made		Used by authors
Kimwipes	Kimberly-Clark	S-8115	As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
MilliQ water (Ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	100 ml
Meshmixer	Autodesk	http://www.meshmixer.com/	Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS	Stratasys LTD		Precision Prototyping
Objet Studio	Stratasys LTD		Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	10010031	2.5 L of 10% PBS
S&T Forceps	Fine Science Tools	00108-11	Used by authors
Scalpel Blade - #11	Fine Science Tools	10011-00	Used by authors
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	Used by authors
SkyScan 1272	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
Skyscan CT-Vox	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SkyScan NRecon	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SolidWorks CAD	Dassault Systèmes	SolidWorks Research Subsription	Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue	Loctite	234790	As suggested in protocol
Testing bath	Custom made		Used by authors
Thin film grips	Custom made		Used by authors
VeroWhitePlus	Stratasys LTD	NA	3D printing material used by authors
WinTest	WinTest Software		Used by authors to collect data