マウス腱の生体力学的試験

要約

このプロトコルは、カスタムフィット3Dプリント器具の使用を通じて、マウス腱の効率的で再現性の高い引張生体力学的試験方法について説明します。

要約

腱障害は一般的であり、すべての年齢の人々に影響を与え、しばしば衰弱している。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復などの標準的な治療法は、しばしば失敗します。腱機能を定義し、新しい治療法の有効性を実証するためには、動物モデルからの腱の機械的特性を正確に決定する必要があります。マウス動物モデルは現在、腱障害を研究し、腱症の新しい治療法を評価するために広く使用されています。しかし、マウス腱の機械的特性を決定することは困難でした。本研究では、それぞれ上頭症腱とアキレス腱を機械的にテストするために、ヒューマラスとカルカヌスの解剖学に正確に一致する3Dプリント器具を含む腱機械試験用に新しいシステムが開発された。これらの器具は、ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、および添加剤製造の3D再構成を使用して開発されました。この新しいアプローチにより、実際のグリップの失敗(腱ではなく成長プレートの故障など)が排除され、全体的な試験時間が減少し、再現性が向上しました。さらに、この新しい方法は、他の動物からの他のマウス腱や腱のテストに容易に適応可能である。

概要

腱障害は、老化、運動、および活性^{集団1、2、3}の間で一般的で非常に一般的である。米国では、毎年1,640万人の結合組織損傷が報告され、すべての傷害関連の医師の^{オフィス訪問}の3、5、6、7^の30%を占めています。 ⁸.最も一般的に影響を受ける部位には、回転子カフ、アキレス腱、膝蓋^腱9が含まれる。抗炎症薬、リハビリテーション、外科的修復など、様々な非手術・手術治療が検討されているが、結果は依然として乏しく、機能への回帰が限られ、故障率^{が高い5 6}.これらの貧弱な臨床結果は、腱症を理解し、新しい治療アプローチを開発しようとする基礎的および翻訳的研究を動機づけています。

引張生体力学的特性は、腱機能を定義する主要な定量的結果である。したがって、腱症および治療有効性の実験室的特徴付けは、腱引張特性の厳密な試験を含む必要があります。ラット、ヒツジ、イヌ、ウサギ10、11、12などの動物モデルから腱の生体力学的特性を決定する方法を数多くの研究が^記載されている。しかし、主に引張試験のために小さな組織をつかむのが難しいため、マウス腱の生体力学的特性をテストした研究はほとんどありません。マウスモデルは、遺伝子操作、広範な試薬の選択肢、低コストなど、機械的に腱症を研究するための多くの利点を有するので、マウス組織を生体的にテストする正確で効率的な方法の開発が必要とされています。

腱の機械的特性を適切にテストするためには、組織を効果的につかむ必要があり、グリップ界面で滑ったり、実際に引き裂いたり、成長板を破砕したりする必要があります。多くの場合、特に短い腱の場合、骨は一方の端でつかまれ、腱はもう一方の端でつかまれる。骨は、典型的には、エポキシ^樹脂13およびポリメチルメタクリ^{レート14、15}などの材料にそれらを埋め込むことによって確保される。腱は、多くの場合、サンドペーパーの2つの層の間に配置され、シアノクリレートで接着され、圧縮クランプ(断面が平らな場合)または凍結媒体(断面が大きい場合)15、16、17を使用して固定されています。.これらの方法は、生体力学的にマウス腱をテストするために適用されているが、試料のサイズが小さく、成長プレートのコンプライアンスが原因で問題が生^じ、18を振動させない。例えば、マウスの頭の直径はわずか数ミリメートルで、骨のつかみにくくなります。具体的には、マウス上頭腱から骨までのサンプルの引張試験は、腱や腱のエンテシスではなく成長板で失敗することがよくあります。同様に、アキレス腱の生体力学的試験は困難である。アキレス腱は他のマウス腱よりも大きいが、カルカヌエウスは小さく、この骨のつかみ取りが困難である。骨を取り除き、その後に2つの腱の端をつかみます。しかし、これは腱と骨の付着のテストを妨げる。他のグループは、カスタムメイドの^{器具19、20、}ク^ランプ21による固定、自己硬化プラスチック^{セメント22}で固定または円錐形^{スロット22}を使用して、カルカインの骨をつかむ報告します。以前の方法は、再現性が低く、高いグリップ故障率、および退屈な準備要件によって制限されたままです。

今回の研究の目的は、マウス腱の引張生体力学的検査のための正確かつ効率的な方法を開発し、例として上脊椎およびアキレス腱に焦点を当てた。ネイティブ骨解剖学、固体モデリング、添加物製造からの3D再構成を組み合わせて、骨をつかむ新しい方法を開発しました。これらの器具は骨を効果的に確保し、成長板の故障を防ぎ、検体の調製時間を減らし、テストの再現性を高めた。この新しい方法は、ラットや他の動物の腱と同様に、他のマウス腱をテストするために容易に適応可能である。

プロトコル

動物研究は、コロンビア大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました.この研究で使用されたマウスはC57BL/6Jの背景を有し、ジャクソン研究所(バーハーバー、ME、米国)から購入した。彼らは病原体を含まないバリア条件で収容され、食物と水のアドリビタムを提供された。

1. 骨を握るためのカスタムフィット3Dプリント器具の開発

1. 骨画像取得と3D骨モデル構築
   1. 3D モデル作成および 3D ボーン グリップ印刷の準備に関心のあるボーンを解剖します。ヒューマラスとカルカヌスは、現在のプロトコルの例として使用されます。
      注:機械的試験のための骨腱筋標本を解剖するための詳細な指示は、ステップ2.1.1で提供されています。3D プリントボーン グリップを作成する目的で、ボーンを分離するには、次の手順に従う必要があります。
      1. ヒューマラスの解剖:IACUC承認の手順に基べてマウスを安楽死させる。上肢皮膚を取り除き、ヒューマラス上のすべての筋肉を取り除き、肘と光の関節を解き明かし、ヒューマラスに付着したすべての結合組織を慎重に取り除く。
      2. カルカウスの解剖:IACUC承認の手順に基べてマウスを安楽死させる。下肢皮膚を取り除き、アキレス腱-カルカヌウス関節と他の足の骨との関節を解き明かし、気道に付着したすべての結合組織を慎重に除去する。
   2. 骨全体のマイクロコンピュータ断層撮影スキャンを行い、例えば、ヒューマラスおよびカルカヌスサンプルをスキャンする。
      注:使用するスキャナによって設定が異なります。現在の研究(材料の表)で使用されるスキャナの場合、推奨される設定は、55 kVP のエネルギーでスキャンし、Al 0.25 フィルターを 6 μm の解像度でスキャンします。
      1. アガロースが完全に溶解するまで、アガロース粉末を超純水と電子レンジで1~3分間混ぜます。30-45sの電子レンジで停止して旋回し、沸騰に向かって続けると便利です。アガローズで満たされた3四半期まで凍結チューブを埋めます。アガロースを約5〜10分間冷まします。
      2. アガロースゲルに骨を挿入します(これはスキャン中に動きのアーティファクトを防ぎます)。スキャナーに骨の付いているクライオチューブを挿入します。
         注:現在のスタディで使用されているスキャナでは、すべてのスキャンに16ポジションの自動サンプルチェンジャーが使用されました。このスキャナは、サンプルのサイズと形状に応じて自動的に倍率を選択できます。
   3. マイクロコンピュータ断層撮影スキャン投影画像を断面画像に再構築します。実験者のスキャナとソフトウェアの組み合わせに推奨パラメータを使用します。
      注:現在の研究(材料の表)で使用されるプログラムでは、次の再構成パラメータを使用することをお勧めします:スムージング:0-2、ビーム硬化補正:45、リングアーティファクト低減:4-9、16ビットTIFFでスライスを再構築します。形式。
   4. 3D モデルを作成し、ほとんどの 3D プリンターと互換性のある標準の STL 形式に保存し、ラピッド プロトタイピングを行います。現在の研究 (材料の表)で使用されているプログラムでは、次の操作を行います。
      1. ファイルデータセットを開くコマンドファイル>開きコマンドを選択します。ダイアログファイル>環境設定を開き、[詳細]タブを選択します。
      2. アダプティブ レンダリング アルゴリズムを使用して、3D モデルを構築します。このアルゴリズムは、ファセット三角形の数を最小限に抑え、サーフェスの詳細をスムーズにします。局所性パラメータとして 10 を使用します。このパラメータは、オブジェクトの境界線の検索に使用される隣接点までの距離をピクセル単位で定義します。許容値を 0.1 に最小化してファイル サイズを小さくします。
         注: データセットを開くと、画像が [未加工の画像] ページに表示されます。
      3. 対象のボリューム(VOI)を指定するには、選択したVOI範囲の上下に設定する2つの画像を手動で選択します。
      4. 2 ページ目の[対象地域]に移動します。単一の断面イメージ上の対象領域を手動で選択します。
         注: 選択した領域は赤でハイライト表示されます(つまり、ヒューマラス断面領域)。
      5. 前の手順を 10 ~ 15 枚の断面画像ごとに繰り返します。
      6. 3 ページ目のバイナリ選択に移動します。ヒストグラム メニューで、[データセットから]をクリックします。データセットのすべての画像からの明るさのヒストグラム分布が表示されます。ヒストグラムメニューでも、[3Dモデルファイルを作成]メニューをクリックします。
   5. ボーンの 3D モデルを STL ファイル形式で保存します。
   6. メッシュをリファインする: メッシュを操作して STL ファイルのサイズを小さくし、ソリッド モデリング コンピュータ支援設計プログラムと互換性を持たえるようにします。現在の調査 (材料の表)で使用されているプログラムについては、次の手順に従います。
      1. メッシュを読み込み、編集するすべてを選択します。[ツールセットの編集]から[削減]を選択します。次に、ツールセットから [ターゲットを減らす] から [三角形の予算] を選択します。トライカウントを減らし、変更を受け入れます。[エクスポート] を選択して、新しく縮小したファイルを STL 形式で再保存します。
2. カスタムフィット骨器具の設計
   1. 上頭椎腱-humeral 骨
      1. ソリッド モデリング コンピュータ支援設計プログラムを使用して、humerus グリップ フィクスチャのカスタム フィット モデルを作成します (図 1、補足ファイル)。
         注: 現在の研究で使用されているプログラムは、材料の表に記載されています。
      2. ソリッド モデリング プログラムで humerus ボーンの STL 形式ファイルを開き、パーツ ファイルとして保存します。
         注:現在のスタディ(材料の表)で使用されているソフトウェアの場合、3DボーンオブジェクトはSLDPRT形式で保存されました。
      3. 部品ファイルを開き、解剖学的に関連する3つの平面(矢状、冠状動脈、横)を手動で作成します。
         1. より大きな管状で上脊椎腱の付着を切り取るために矢状面を手動で定義する。3D ブロックに対称平面として矢状面が含まれていることを確認します。これを実現するには、必要に応じてブロックから材料を追加またはカットします。
            注:対称のこの平面は、標本が器具に挿入されるとき腱および腱の付属品が器具の中心軸に置かれることを保障する。
      4. 3 つの平面のそれぞれに沿ってボーンの寸法 (高さ、幅、長さ) を測定します。
      5. 3D プリント フィクスチャが取り付けられる機械試験グリップの寸法を測定します。
      6. まず、ソリッドブロック部分(固体シリンダーなど)を設計します。
         1. ブロックの各寸法が、ヒューマラスの寸法より少なくとも 5 mm 大きいことを確認します。
         2. 機械試験グリップからの設計上の制約を考慮します(つまり、3Dプリントされた器具を機械試験グリップで自由に組み立て、分解できることを確認してください)。
      7. ソリッド ブロックと右または左のヒューマラス ボーンの 2 つのコンポーネントを持つアセンブリ モデルを作成します。ブロック内のボーンの向き(腱と骨の間の角度)を定義します。骨のボリューム全体がブロック内に収まるようにします。
      8. ヒューマラスボーンを金型として使用して、ブロック内に空洞を作成します。「材料の表」で指定したソフトウェアを使用する場合は、次の手順に従います。
         1. 設計部品(humerus)と金型ベース(シリンダーブロック)を中間アセンブリに挿入します。アセンブリ ウィンドウでブロックを選択し、[アセンブリ]ツールバーから[コンポーネントの編集]をクリックします。
         2. [挿入>機能>キャビティ]をクリックします。[均一スケーリング]を選択し、すべての方向にスケーリングする値として 0% を入力します。
      9. ボーン パーツを抑制し、アセンブリをパーツとして保存します。
      10. 開いている部品(空洞付きシリンダー)。矢状面に沿って部分をカットして、骨を前部および後部に収まる2つの対称成分を作成します(例えば、図1に見られるように、2つの半円柱)。
          注:2つのコンポーネントは、骨を前部および後部に合うように設計されています。前部成分は、ヒューマラス頭部の前側から上平頭腱の付着まで伸びる半球形の空洞を含む。後部成分の空洞は、ヒューマラスの後部(すなわち、ヒューマラス頭部の後側、デルトイド管状、および中間および側面エピコンダイユ)のような形をしています。
      11. 各コンポーネントを個別のファイル パーツとして保存します。
      12. 前部コンポーネントの場合は、適切な許容値を定義して、ヒューマラル ヘッドが部品の空洞に埋め込まれていることを確認します。
          注:現在の研究では、材料の表で指定されたソフトウェアを使用して、以下の手順に従うことをお勧めします。
          1. キャビティのメッシュ ジオメトリを滑らかにするために回転カットを作成します。キャビティ ジオメトリをエミュレートし、位置クリアランスを追加して、カットのスケッチを作成します。
             注:クリアランスは、骨と前部部品の間の自由なアセンブリおよび分解を可能にする。
      13. 前のコンポーネントの前述のように、キャビティ ジオメトリを模倣するように後部コンポーネントを変更して、クリアランスを追加するカットを作成します。
      14. 後部コンポーネントの上部から大きい/より小さい結核の頂上まで、横面平面をカットします。
          注:図1および図2に示すように、後部コンポーネントには腱の付属品に開口部を作成するカットが含まれています。
      15. 2 つの構成部品間にぴったりフィットを作成して、自由なアセンブリと分解を可能にします。
          注:現在のスタディの器具に対して、緩い走行クリアランスを持つ穴シャフトフィットが作成されました。
      16. 反対側の四肢(左または右)の器具の各コンポーネントに対して 3D ミラー モデルを作成します。
      17. フィクスチャの下部にエッチングを追加して、左側と右側を区別します。
      18. 3D プリントに備えて、すべての器具パーツを STL 標準ファイル形式で保存します。
   2. アキレス腱-カルカレス骨
      1. 上脊椎の頭部の器具のために上記と同じ手順に従ってください。
         注:左右の心骨骨の解剖学はほぼ対称であるため、アキレス心骨には1セットの器具のみが必要です。

2. マウス腱の生体力学的検査

1. 試料調製および断面積測定
   1. 引張機械試験の準備に関心のある筋肉腱骨を解剖する。現在の研究では、上脊椎筋- 腱 - ヒューマラス骨標本(N=10、5オス、5雌)および胃腸筋-アキレス腱-カルカヌス骨標本(N=12、6オス、6雌)を8週齢のC57BL/6Jマウスから単離した。
      1. 上脊椎筋の解剖 - 腱 - ヒューマラス骨標本
         1. IACUC承認の手順に合ってマウスを安楽死させる。マウスを傾向のある位置に配置します。前足の肘の上から肩に向かって皮膚に切開を行います。
         2. 肩の筋肉が見えるように鈍い解剖で皮膚を慎重に取り除きます。骨が露出し、鉗子でしっかりと保持することができるまで、ヒューマラスを取り囲む組織を取り除きます。
         3. 鉗子でヒューマラスを保持し、慎重に心因性のアーチを露出するために、デルトイドと台皮の筋肉を削除します。アクロミオラヴリキュラー関節を同定し、慎重にメスの刃でアクロミオンから鎖骨を分離します。
         4. 上頭葉腱とその骨の付着物を損傷しないように注意して、メスの刃を使用して、その肩甲骨の添付ファイルから筋肉を削除します。上頭骨腱とその骨の付着を損傷しないように注意して、グレノイドからヒューメラヘッドを取り外します。メスブレードを使用して、関節カプセルと赤外線、皮下症、およびテレスマイナー腱をレースします。
         5. 肘関節を解き明かして、ヒューマラスをウルナと半径から分離します。ヒューマラスを分離する - 上頭筋腱 - 筋肉標本とヒューマラスとヒューマラス頭上の余分な軟部組織をきれいにします。
      2. アキレス腱の解剖 - カルカネウス骨サンプル
         1. IACUC承認の手順に合ってマウスを安楽死させる。マウスを傾向のある位置に配置します。アキレス腱とその骨の付着を損傷しないように注意して、足首と膝関節の周りの筋肉が露出するように鈍い解剖で皮膚を取り除きます。
         2. メスブレードを使用して、アキレス腱から始まる - カルカヌスの付属品は、慎重にその近位の付属品から胃腸筋を切り離します。
         3. 慎重に様々な隣接する骨からカルカヌースを解離します。アキレス腱を分離する - カルカインの標本と余分な軟部組織をきれいにします。
   2. マイクロコンピュータ断層撮影を使用して腱の断面積を決定します。
      注:現在の研究(材料の表)で使用されるスキャナの場合、推奨される設定は、55 kVP のエネルギーでスキャンし、Al 0.25 フィルターを 5 μm の解像度でスキャンします。
      1. アガロースが完全に溶解するまで、アガロース粉末を超純水と電子レンジで1~3分間混ぜます。30-45sの電子レンジで停止して旋回し、沸騰に向かって続けると便利です。アガローズで満たされた3四半期まで凍結チューブを埋めます。アガロースを約5〜10分間冷まします。
      2. 骨を逆さまに挿入して、クライオチューブ内の標本を中断します。
         注:骨だけがアガロースゲルに入っている必要があります。腱と筋肉は外に懸濁する必要があります。.
   3. スキャン後、メスブレードを使用して腱から筋肉をそっと取り除きます。3Dプリントの器具に試料を挿入します。
      注: グリップはテストごとに再利用可能です。器具に接着剤やエポキシを使用しないでください。骨はプレスフィットで保持されます。
   4. 折りたたまれた薄いティッシュペーパー(2 cm x 1 cm)の間に腱を挿入して接着し、薄膜グリップを使用して構造をクランプします。3Dプリントされた器具を試料でテストグリップに取り付けます。
   5. サンプルとグリップを37°C(すなわち、マウスの体^温23)でリン酸緩衝生理食液(PBS)の試験浴に挿入する。
2. 引張試験
   1. 材料試験フレームで引張機械試験を行います。
      注: 現在のスタディ (材料の表)で使用されているテスト フレームの場合、推奨されるプロトコルは次のとおりです。
      1. ゲージの長さを、腱のアタッチメントから上部グリップまでの距離として定義します。
      2. 0.05 N と 0.2 N の間の 5 サイクルを持つ前提条件。
      3. 120 s のホールド。
      4. 0.2%/sの故障に張力を使用してください。
   2. 荷重変形データを収集します。
   3. 腱の初期ゲージ長に対する変位としてひずみを計算します。
   4. 力を最初の腱断面積で割った力として応力を計算します(microCTから測定)。
   5. 粘弾性挙動に興味がある場合は、故障する張力試験の前に応力緩和を行い、そのデータを使用して準線形粘弾性^モデル24からA、B、C、tau1、およびtau2などのパラメータを計算する。
   6. 荷重変形曲線から、剛性(曲線の線形部分の傾き)、最大力、および降伏する作業(カーブの下の面積から降伏力までの領域)を計算します。
      1. 線形最小二乗回帰²⁵の R²値を最大化する荷重変形曲線内の点のウィンドウを選択して、線形部分を識別します。
      2. 荷重変位曲線^25,26の線形部分の勾配として剛性を決定します。
   7. 応力ひずみ曲線から、係数(曲線の線形部分の傾き)、強度(最大応力)、およびレジリエンス(カーブの下の領域から降力応力まで)を計算します。
      注: RANSAC アルゴリズムを使用すると、Y フィットが期待応力値 (Y 値) の 0.5% を超える偏差を持つ最初のポイントとして、降伏ひずみ (x 値) が定義されます。降伏応力は、歩留まり歪みの対応するy値である。
      注:現在の研究で説明されている単調な引張負荷に加えて、周期荷重は腱疲労および/または粘弾性特性に関する重要な情報を提供することができます。例えば、Freedmanらは、マウスアキレス^腱27の疲労特性を報告した。
   8. 引張試験の完了後、骨全体のマイクロコンピュータ断層撮影スキャンを行い、例えば、ヒューマラスおよびカルカヌスサンプルをスキャンする。
      注:現在の研究(材料の表)で使用されるスキャナの場合、推奨される設定は、55 kVP のエネルギーでスキャンし、Al 0.25 フィルターを 6 μm の解像度でスキャンします。
      1. 手順 1.1.2.1 ~ 1.1.2.2 を繰り返します。
   9. 手順 1.1.3 を繰り返します。
   10. スキャナと互換性のある 3D ビジュアライゼーション プログラムを使用して、スキャンしたオブジェクトのボリューム レンダリング 3D モデルを作成します。
       注: 現在の研究で使用されているプログラムは、材料の表に記載されています。
   11. 3D オブジェクトを検査して、故障モードと故障サイト領域を特定します。
3. 統計分析: すべてのサンプル結果を平均 ± 標準偏差(SD)として表示します。学生のt検定(両尾と非対)を使用してグループ間で比較を行います。有意性をp < 0.05 として設定します。
   注: 現在の研究で使用されている統計ソフトウェアは、材料の表に記載されています。

結果

3Dプリントされた器具は、8週齢のマウス上脊椎間およびアキレス腱をテストするために使用された。すべての機械的にテストされたサンプルは、引張試験後のマイクロCTスキャン、目視検査、およびビデオ分析によって特徴づけられるように、封入で失敗しました。本研究室における上脊椎腱試験の前の方法と現在の方法の1対1の比較を図3に示す。前の方法28,29,30では、...

ディスカッション

マウス動物モデルは、腱障害を研究するために一般的に使用されますが、その機械的特性の特徴付けは困難であり、文献では珍しいです。このプロトコルの目的は、マウス腱の引張試験のための時間効率が良く、再現可能な方法を記述することです。新しい方法では、サンプルのテストに必要な時間が数時間から数分に短縮され、以前の方法で一般的な問題であった主要なグリップアーティ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100	Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose
Bruker microCT	Bruker BioSpin Corp	Skyscan 1272	Used by authors
ElectroForce	TA Instruments	3200	Testing platform
Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips	Custom made		Used by authors
Kimwipes	Kimberly-Clark	S-8115	As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
MilliQ water (Ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	100 ml
Meshmixer	Autodesk	http://www.meshmixer.com/	Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS	Stratasys LTD		Precision Prototyping
Objet Studio	Stratasys LTD		Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	10010031	2.5 L of 10% PBS
S&T Forceps	Fine Science Tools	00108-11	Used by authors
Scalpel Blade - #11	Fine Science Tools	10011-00	Used by authors
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	Used by authors
SkyScan 1272	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
Skyscan CT-Vox	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SkyScan NRecon	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SolidWorks CAD	Dassault Systèmes	SolidWorks Research Subsription	Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue	Loctite	234790	As suggested in protocol
Testing bath	Custom made		Used by authors
Thin film grips	Custom made		Used by authors
VeroWhitePlus	Stratasys LTD	NA	3D printing material used by authors
WinTest	WinTest Software		Used by authors to collect data