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  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo describe métodos de ensayo biomecánicos de tracción eficientes y reproducibles para tendones murinos mediante el uso de accesorios impresos en 3D de ajuste personalizado.

Resumen

Los trastornos del tendón son comunes, afectan a personas de todas las edades y a menudo son debilitantes. Los tratamientos estándar, como los antiinflamatorios, la rehabilitación y la reparación quirúrgica, a menudo fallan. Con el fin de definir la función del tendón y demostrar la eficacia de los nuevos tratamientos, las propiedades mecánicas de los tendones de los modelos animales deben determinarse con precisión. Los modelos animales murinos ahora se utilizan ampliamente para estudiar trastornos tendinosos y evaluar nuevos tratamientos para las tendinopatías; sin embargo, determinar las propiedades mecánicas de los tendones del ratón ha sido un reto. En este estudio, se desarrolló un nuevo sistema para pruebas mecánicas de tendones que incluye accesorios impresos en 3D que coinciden exactamente con las anatomías del húmero y el calcáneo para probar mecánicamente los tendones supraespinatus y los tendones de Aquiles, respectivamente. Estos accesorios fueron desarrollados utilizando reconstrucciones 3D de anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva. El nuevo enfoque eliminó las fallas de agarre artifreales (por ejemplo, fallas en la falla de la placa de crecimiento en lugar de en el tendón), disminuyó el tiempo total de prueba y aumentó la reproducibilidad. Además, este nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones y tendones murinos de otros animales.

Introducción

Los trastornos del tendón son comunes y muy frecuentes entre las poblaciones de envejecimiento, atletismo y activa1,2,3. En los Estados Unidos, 16,4 millones de lesiones por tejido conectivo se reportan cada año4 y representan el 30% de todas las visitas al consultorio médico relacionadas con lesiones3,5,6,7, 8. Los sitios más comúnmente afectados incluyen el manguito rotador, tendón de Aquiles, y tendón rotuliano9. Aunque se han explorado una variedad de tratamientos no quirúrgicos y operativos, incluyendo medicamentos antiinflamatorios, rehabilitación y reparación quirúrgica, los resultados siguen siendo pobres, con un retorno limitado a la función y altas tasas de falla5, 6. Estos malos resultados clínicos han motivado los estudios básicos y traslacionales que buscan comprender la tendinopatía y desarrollar nuevos enfoques de tratamiento.

Las propiedades biomecánicas de tracción son los principales resultados cuantitativos que definen la función del tendón. Por lo tanto, la caracterización de laboratorio de la tendinopatía y la eficacia del tratamiento deben incluir una prueba rigurosa de las propiedades de la tensión del tendón. Numerosos estudios han descrito métodos para determinar las propiedades biomecánicas de los tendones a partir de modelos animales como ratas, ovejas, perros y conejos10,11,12. Sin embargo, pocos estudios han probado las propiedades biomecánicas de los tendones murinos, principalmente debido a las dificultades para agarrar los tejidos pequeños para las pruebas de tracción. Como los modelos murinos tienen numerosas ventajas para el estudio mecanicistamente tendinopatía, incluyendo la manipulación genética, amplias opciones de reactivos y bajo costo, se necesita el desarrollo de métodos precisos y eficientes para probar biomecánicamente los tejidos murinos.

Con el fin de probar adecuadamente las propiedades mecánicas de los tendones, el tejido debe ser agarrado eficazmente, sin resbalones o desgarros artifes reales en la interfaz de agarre o fractura de la placa de crecimiento. En muchos casos, particularmente para tendones cortos, el hueso se agarra en un extremo y el tendón se agarra en el otro extremo. Los huesos se fijan típicamente incrustándolos en materiales como resina epoxi13 y polimetilmetacrilato14,15. Los tendones a menudo se colocan entre dos capas de papel de lija, pegados con cianoacrilato, y asegurados mediante abrazaderas de compresión (si la sección transversal es plana) o en un medio congelado (si la sección transversal es grande)15,16,17 . Estos métodos se han aplicado a tendones murinas de ensayo biomecánicos, pero surgen desafíos debido al pequeño tamaño de los especímenes y al cumplimiento de la placa de crecimiento, que nunca osifie18. Por ejemplo, el diámetro de la cabeza hueral murina es de sólo unos pocos milímetros, lo que dificulta el agarre del hueso. Específicamente, las pruebas de tracción de muestras de tendón-hueso de supraespinato murino a menudo resultan en falla en la placa de crecimiento en lugar de en el tendón o en la entesis del tendón. Del mismo modo, las pruebas biomecánicas del tendón de Aquiles son desafiantes. Aunque el tendón de Aquiles es más grande que otros tendones murinos, el calcáneo es pequeño, lo que dificulta el agarre de este hueso. El hueso se puede extraer, seguido de agarrar los dos extremos del tendón; sin embargo, esto impide la prueba de la unión de tendón a hueso. Otros grupos informan de agarrar el hueso de calcáneo utilizando accesorios hechos a medida19,20, anclaje por abrazaderas21, fijación en cemento plástico autocurado22 o utilizando una ranura de forma cónica22, sin embargo, estos métodos anteriores siguen estando limitados por la baja reproducibilidad, las altas tasas de fallas de agarre y los requisitos tediosos de preparación.

El objetivo del estudio actual fue desarrollar un método preciso y eficiente para las pruebas biomecánicas de tracción de los tendones murinos, centrándose en los tendones supraespinato y Aquiles como ejemplos. Utilizando una combinación de reconstrucciones 3D de la anatomía ósea nativa, modelado sólido y fabricación aditiva, se desarrolló un método novedoso para agarrar los huesos. Estos accesorios aseguraron eficazmente los huesos, evitaron fallas en la placa de crecimiento, disminuyeron el tiempo de preparación de la muestra y aumentaron la reproducibilidad de las pruebas. El nuevo método es fácilmente adaptable para probar otros tendones murinos, así como tendones en ratas y otros animales.

Protocolo

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Columbia. Los ratones utilizados en este estudio eran de un fondo C57BL/6J y fueron comprados en the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA). Estaban alojados en condiciones de barrera libre de patógenos y se les proporcionaba alimentos y agua ad libitum.

1. Desarrollo de accesorios impresos en 3D para agarrar hueso

  1. Adquisición de imagen ósea y construcción de modelos óseos 3D
    1. Diseccionar el hueso de interés en la preparación para la creación de modelos 3D y la impresión de agarre óseo 3D; el húmero y el calcáneo se utilizan como ejemplos en el protocolo actual.
      NOTA: En el paso 2.1.1 se proporcionan instrucciones detalladas para diseccionar muestras de hueso-tendón-músculo para pruebas mecánicas. Se deben seguir los siguientes pasos para aislar los huesos con el fin de crear pinzamientos óseos impresos en 3D.
      1. Disección del húmero: Euthanize un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Retire la piel de las extremidades superiores, retire todos los músculos sobre el húmero, desarticula el codo y las articulaciones glenohumerales, y retire cuidadosamente todos los tejidos conectivos unidos al húmero.
      2. Disección del calcáneo: Euthanize un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Retire la piel inferior de las extremidades, desarticula las articulaciones del tendón-calcáneo de Aquiles y las articulaciones entre calcáneo y otros huesos del pie, y retire cuidadosamente todos los tejidos conectivos unidos al calcáneo.
    2. Realice una tomografía microcalculada de todo el hueso, por ejemplo, escanee las muestras de húmero y calcáneo.
      NOTA: Dependiendo del escáner utilizado, los ajustes serán diferentes. Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 6 m.
      1. Mezclar el polvo de agarosa en agua ultrapura y microondas durante 1-3 minutos hasta que la agarosa se disuelva por completo. Es útil para microondas para 30-45 s, detener y girar, y luego continuar hacia un hervor. Llena criotubos hasta tres cuartos llenos de agarosa. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 5-10 min.
      2. Inserte hueso en el gel de agarosa (esto evitará artefactos de movimiento durante el escaneo). Inserte un criotubo con hueso en el escáner.
        NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual, se utilizó un cambiador automático de muestras de 16 posiciones para todos los escaneos. Este escáner puede seleccionar automáticamente la ampliación de acuerdo con el tamaño y la forma de una muestra.
    3. Reconstruya imágenes de proyección de tomografía microcalculada en imágenes de sección transversal. Utilice los parámetros recomendados para la combinación de escáner/software del experimentador.
      NOTA: Para el programa utilizado en el estudio actual(Tabla de Materiales)se recomienda utilizar los siguientes parámetros de reconstrucción: Suavizado: 0-2, Corrección de endurecimiento de haz: 45, Reducción de artefacto de anillo: 4-9 y para reconstruir rodajas en TIFF de 16 bits Formato.
    4. Cree un modelo 3D y guárdelo en un formato STL estándar compatible con la mayoría de las impresoras 3D y la creación rápida de prototipos. Para el programa utilizado en el estudio actual (Tabla de materiales), haga lo siguiente:
      1. Seleccione el comando Archivo > Abrir para abrir el dataset de archivos. Abra el cuadro de diálogo Archivo > Preferencias y seleccione la pestaña Avanzadas.
      2. Utilice el algoritmo de representación adaptable para construir los modelos 3D. Este algoritmo minimiza el número de triángulos facetas y proporciona un detalle de superficie más suave. Utilice 10 como parámetro de localidad; este parámetro define la distancia en píxeles al punto vecino utilizado para buscar el borde del objeto. Minimice la tolerancia a 0,1 para reducir el tamaño del archivo.
        NOTA: Después de abrir el conjunto de datos, las imágenes se muestran en la página "Imágenes en bruto".
      3. Para especificar el volumen de interés (VOI), seleccione manualmente dos imágenes para establecerlas como la parte superior e inferior del rango de VOI seleccionado.
      4. Vaya a la segunda página, Región de interés. Seleccione manualmente la región de interés en una sola imagen de sección transversal.
        NOTA: La región seleccionada se resaltará en rojo (es decir, el área transversal del húmero).
      5. Repita el paso anterior cada 10–15 imágenes de sección transversal.
      6. Vaya a la tercera página Selección binaria. En el menú del histograma, haga clic en Desde conjunto de datos. Se mostrará la distribución del histograma del brillo de todas las imágenes del conjunto de datos. También en el menú del histograma, haga clic en el menú Crear un archivo de modelo 3D.
    5. Guarde un modelo 3D del hueso en formato de archivo STL.
    6. Refinar la malla: Manipule la malla para reducir el tamaño del archivo STL y hacerla compatible con cualquier programa de diseño asistido por ordenador de modelado sólido. Para el programa utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales), siga los pasos que se indican a continuación:
      1. Importe malla y seleccione todo para editar. Seleccione Reducir en el conjunto de herramientas Editar. A continuación, seleccione Presupuesto de triángulo en el conjunto de herramientas Reducir destino. Reduzca el recuento de tri y acepte los cambios. Vuelva a guardar el archivo recién reducido en formato STL seleccionando Exportar como...
  2. Diseño de accesorios de hueso de ajuste personalizado
    1. Hueso tendinésal-humeral de Supraspinatus
      1. Utilice un programa de diseño asistido por ordenador de modelado sólido para crear un modelo personalizado de fijación de agarre de húmero(Figura 1, Archivos suplementarios).
        NOTA: El programa utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.
      2. Abra el archivo de formato STL del hueso del húmero en un programa de modelado sólido y guárdelo como un archivo de pieza.
        NOTA: Para el software utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),el objeto óseo 3D se guardó en formato SLDPRT.
      3. Abra el archivo de pieza y cree manualmente tres planos anatómicamente relevantes (es decir, sagitales, coronales, transversales).
        1. Definir manualmente el plano sagital para cortar a través del apego del tendón supraespinato en la mayor tuberosidad. Asegúrese de que el bloque 3D contiene el plano sagital como un plano de simetría. Para ello, añada o corte material del bloque si es necesario.
          NOTA: Este plano de simetría garantiza que cuando se inserta la muestra en los accesorios, el tendón y el accesorio del tendón se encuentran en el eje central del accesorio.
      4. Mida las dimensiones del hueso a lo largo de cada uno de los tres planos (es decir, altura, anchura, longitud).
      5. Mida las dimensiones de las pinzas de prueba mecánicas donde se conectará el accesorio impreso en 3D.
      6. Comience diseñando una pieza de bloque sólido (por ejemplo, un cilindro sólido).
        1. Asegúrese de que cada dimensión del bloque sea al menos 5 mm mayor que las dimensiones del húmero.
        2. Tenga en cuenta las limitaciones de diseño de las pinzas de prueba mecánicas (es decir, asegúrese de que el accesorio impreso en 3D se pueda montar y desmontar libremente en las empuñaduras de prueba mecánicas).
      7. Cree un modelo de ensamblaje con dos componentes: el bloque sólido y el hueso del húmero derecho o izquierdo. Defina la orientación del hueso dentro del bloque (es decir, el ángulo entre el tendón y el hueso). Asegúrese de que todo el volumen óseo se ajuste dentro del bloque.
      8. Cree una cavidad en el bloque utilizando el hueso del húmero como molde. Si utiliza el software especificado en la Tabla de materiales, siga estos pasos:
        1. Inserte la pieza de diseño (húmero) y la base del molde (bloque de cilindros) en un conjunto intermedio. En la ventana de ensamblaje, seleccione el bloque y haga clic en Editar componente en la barra de herramientas Ensamblaje.
        2. Haga clic en Insertar > Operaciones > Cavidad. Seleccione Escala uniforme e introduzca 0% como valor para escalar en todas las direcciones.
      9. Suprima la pieza ósea y guarde el ensamblaje como una pieza.
      10. Pieza abierta (cilindro con cavidad). Corte la pieza a lo largo del plano sagital para crear dos componentes simétricos que se ajusten al hueso anterior y posteriormente (por ejemplo, dos medio cilindros, como se ve en la Figura 1).
        NOTA: Dos componentes están diseñados que se ajustan al hueso anterior y posteriormente. El componente anterior incluye una cavidad de forma esférica media extendida desde el lado anterior de la cabeza humeral hasta el accesorio del tendón supraespinato. La cavidad del componente posterior tiene la forma de la parte posterior del húmero (es decir, el lado posterior de la cabeza humeral, la tuberosidad deltoides y el epicóndilo medial y lateral).
      11. Guarde cada componente como una pieza de archivo independiente.
      12. Para el componente anterior, asegúrese de que el cabezal humeral esté incrustado en la cavidad de la pieza definiendo las tolerancias adecuadas.
        NOTA: En el estudio actual, utilizando el software especificado en la Tabla de Materiales,se sugiere seguir los pasos a continuación:
        1. Cree un corte rallado para suavizar la geometría de malla de la cavidad. Cree un croquis para el corte emulando la geometría de la cavidad y añadiendo una holgura de ubicación.
          NOTA: El espacio libre permite un montaje y desmontaje gratuitos entre el hueso y el componente anterior.
      13. Modifique el componente posterior para imitar la geometría de la cavidad para crear un corte que añada holgura, como se ha descrito anteriormente para el componente anterior.
      14. Realice un corte en el plano transversal a partir de la parte superior del componente posterior hasta la cresta del tubérculo mayor/menor.
        NOTA: Como se ve en la Figura 1 y la Figura 2, el componente posterior incluye un corte que crea una abertura en el accesorio de tendón.
      15. Cree un ajuste ajustado entre los dos componentes para permitir el montaje y el desmontaje gratuitos.
        NOTA: Se ha creado un ajuste de eje de agujero con una holgura de carrera suelta para los accesorios en el estudio actual.
      16. Cree modelos de espejo 3D para cada componente de la luminaria para la extremidad opuesta (es decir, izquierda o derecha).
      17. Añade un etch en la parte inferior de los accesorios para distinguir entre los lados izquierdo y derecho.
      18. Guarde todas las piezas de fijación en formato de archivo estándar STL como preparación para la impresión 3D.
    2. Hueso tendones-calcáneo de Aquiles
      1. Siga los mismos pasos descritos anteriormente para el accesorio de cabeza supraespinato-humeral.
        NOTA: Sólo un conjunto de accesorios es necesario para el Aquiles-calcaneal, ya que la anatomía de los huesos del calcáneo izquierdo y derecho es casi simétrica.

2. Pruebas biomecánicas de tendones murinos

  1. Preparación de muestras y medición de área transversal
    1. Diseccionar el músculo-tendón-hueso de interés en la preparación para pruebas mecánicas de tracción. En el estudio actual, el músculo supraespinatus - tendón - muestras óseas del húmero (N-10, 5 machos, 5 hembras) y músculo gastrocnemius - especímenes óseos del tendón-calcaneus de Aquiles (N-12, 6 machos, 6 hembras) fueron aislados de ratones C57BL/6J de 8 semanas de edad.
      1. Disección del músculo supraespinato - tendón - muestra ósea húmero
        1. Eutanasia un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Coloque el ratón en una posición propensa. Haga una incisión en la piel desde arriba del codo de la pata delantera hacia el hombro.
        2. Retire cuidadosamente la piel con disección contundente para que la musculatura del hombro sea visible. Retire el tejido que rodea el húmero hasta que el hueso esté expuesto y pueda mantenerse firmemente con fórceps.
        3. Sostenga el húmero con fórceps y retire cuidadosamente los músculos deltoides y trapecios para exponer el arco coracoacromial. Identifique la articulación acromioclavicular y separe cuidadosamente la clavícula del acromion con una cuchilla de bisturí.
        4. Teniendo cuidado de no dañar el tendón supraespinato y su fijación ósea, retire el músculo de su fijación escapularia usando una cuchilla de bisturí. Teniendo cuidado de no dañar el tendón supraespinato y su apego óseo, separar la cabeza humeral del glenoide; usando una cuchilla del bisturí, lacera la cápsula articular y los tendones subespinatus, subescapularis y teres menores.
        5. Desarticula la articulación del codo para separar el húmero del cúbito y el radio. Aislar el húmero - tendón supraespinato - espécimen muscular y limpiar el exceso de tejidos blandos en el húmero y la cabeza húeral.
      2. Disección del tendón de Aquiles - muestra ósea de calcáneo
        1. Eutanasia un ratón por procedimiento aprobado por la IACUC. Coloque el ratón en una posición propensa. Teniendo cuidado de no dañar el tendón de Aquiles y su apego óseo, retire la piel con disección contundente para que la musculatura alrededor de las articulaciones del tobillo y la rodilla se exponga.
        2. Usando una hoja de bisturí, comenzando en el tendón de Aquiles - accesorio calcáneo, separar cuidadosamente el músculo gastrocnemius de sus accesorios proximales.
        3. Desarticula cuidadosamente el calcáneo de los diversos huesos adyacentes. Aísle el tendón de Aquiles - espécimen de calcáneo y limpie el exceso de tejidos blandos.
    2. Determinar el área transversal del tendón mediante microtomografía.
      NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 5 m.
      1. Mezclar el polvo de agarosa en agua ultrapura y microondas durante 1-3 minutos hasta que la agarosa se disuelva por completo. Es útil para microondas para 30-45 s, detener y girar, y luego continuar hacia un hervor. Llena criotubos hasta tres cuartos llenos de agarosa. Deje que la agarosa se enfríe durante unos 5-10 min.
      2. Suspenda la muestra en el criotubo insertando el hueso al revés.
        NOTA: Sólo el hueso debe estar en el gel de agarosa. El tendón y el músculo deben suspenderse al aire libre.
    3. Después de la exploración, retire suavemente el músculo del tendón usando la cuchilla del bisturí. Inserte la muestra en el accesorio impreso en 3D.
      NOTA: Los pinzamientos son reutilizables para cada prueba. No utilice pegamento o epoxi en el aparato; el hueso se mantiene en un ajuste de prensa.
    4. Inserte y pegue el tendón entre un papel de tejido fino doblado (2 cm x 1 cm) y sujete la construcción con empuñaduras de película delgadas. Coloque el accesorio impreso en 3D con la muestra en las empuñaduras de prueba.
    5. Inserte la muestra y las empuñaduras en un baño de prueba de solución salina tamponada de fosfato (PBS) a 37 oC (es decir, temperatura corporal del ratón23).
  2. Pruebas de tracción
    1. Realice pruebas mecánicas de tracción en un marco de prueba de material.
      NOTA: Para el marco de prueba utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),el protocolo recomendado es:
      1. Defina la longitud del medidor como la distancia desde el accesorio del tendón hasta el pinzamiento superior.
      2. Condición previa con 5 ciclos entre 0,05 N y 0,2 N.
      3. Espera 120 s.
      4. Utilice una tensión de fallo del 0,2%/s.
    2. Recopilar datos de deformación de carga.
    3. Calcule la deformación unitaria como el desplazamiento en relación con la longitud inicial del medidor del tendón.
    4. Calcule la tensión como la fuerza dividida por el área transversal del tendón inicial (medida a partir de microCT).
    5. Si está interesado en el comportamiento viscoelástico, realice una relajación de tensión antes de que la prueba de tensión se incumpla y utilice los datos para calcular parámetros como A, B, C, tau1 y tau2 a partir del modelo viscoelástico cuasilineal24.
    6. A partir de la curva de deformación de carga, calcule la rigidez (pendiente de la parte lineal de la curva), la fuerza máxima y el trabajo a ceder (el área bajo la curva hasta la fuerza de rendimiento).
      1. Identifique la parte lineal eligiendo una ventana de puntos en la curva de deformación de carga que maximice el valor R2 para una regresión lineal de mínimos cuadrados25.
      2. Determine la rigidez como la pendiente de la parte lineal de la curva de desplazamiento de carga25,26.
    7. A partir de la curva de tensión unitaria, calcule el módulo (pendiente de la parte lineal de la curva), la fuerza (tensión máxima) y la resiliencia (área debajo de la curva hasta la tensión de rendimiento).
      NOTA: Utilizando el algoritmo RANSAC, la deformación unitaria de rendimiento (valor x) se define como el primer punto cuando el ajuste y se ha desviado más del 0,5% del valor de tensión esperado (valor y). La tensión de rendimiento es el valor y correspondiente de la deformación unitaria de rendimiento.
      NOTA: Además de la carga de tracción motónica a fallo descrita en el estudio actual, la carga cíclica puede proporcionar información importante sobre la fatiga del tendón y/o las propiedades viscoelásticas. Por ejemplo, Freedman et al. informaron propiedades de fatiga de los tendones de Aquiles murino27.
    8. Después de completar las pruebas de tracción, realice una tomografía microcomputada de todo el hueso, por ejemplo, escanee las muestras de húmero y calcáneo.
      NOTA: Para el escáner utilizado en el estudio actual(Tabla de materiales),los ajustes recomendados son: escanear a una energía de 55 kVP, filtro Al 0.25, a una resolución de 6 m.
      1. Repita los pasos 1.1.2.1–1.1.2.2.
    9. Repita el paso 1.1.3.
    10. Utilice un programa de visualización 3D compatible con el escáner para crear un modelo 3D representado por volumen del objeto escaneado.
      NOTA: El programa utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.
    11. Determine el modo de error y el área del sitio de error inspeccionando el objeto 3D.
  3. Análisis estadístico: Mostrar todos los resultados de la muestra como media - desviación estándar (SD). Haga comparaciones entre grupos utilizando las pruebas t del alumno (de dos colas y sin emparejar). Establezca la importancia como p < 0.05.
    NOTA: El software estadístico utilizado en el estudio actual aparece en la Tabla de materiales.

Resultados

Los accesorios impresos en 3D se utilizaron para probar el supraespinato murino de 8 semanas de edad y los tendones de Aquiles. Todas las muestras analizadas mecánicamente fallaron en la entesis, como se caracteriza por escaneos microCT, inspección visual y análisis de video después de pruebas de tracción. En la Figura 3se muestra una comparación uno a uno de los métodos anteriores y actuales para las pruebas de tendón supraespinato en nuestro laboratorio. En el método anterior

Discusión

Los modelos animales murinos se utilizan comúnmente para estudiar trastornos del tendón, pero la caracterización de sus propiedades mecánicas es desafiante y poco común en la literatura. El propósito de este protocolo es describir un método eficiente en el tiempo y reproducible para las pruebas de tracción de los tendones murinos. Los nuevos métodos redujeron el tiempo necesario para probar una muestra de horas a minutos y eliminaron un artefacto de agarre importante que era un problema común en métodos anteri...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El estudio fue apoyado por los NIH / NIAMS (R01 AR055580, R01 AR057836).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseFisher ScientificBP160-100Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose 
Bruker microCT Bruker BioSpin CorpSkyscan 1272 Used by authors
ElectroForce TA Instruments3200Testing platform
Ethanol 200 ProofFisher ScientificA4094Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach gripsCustom madeUsed by authors
KimwipesKimberly-Clark S-8115As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)Bruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
MilliQ water (Ultrapure water)Millipore SigmaQGARD00R1 (or related purifier)100 ml 
MeshmixerAutodeskhttp://www.meshmixer.com/Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS Stratasys LTDPrecision Prototyping
Objet StudioStratasys LTDUsed by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered SalineThermoFisher Scientific100100312.5 L of 10% PBS 
S&T ForcepsFine Science Tools00108-11Used by authors
Scalpel Blade - #11Fine Science Tools10011-00Used by authors
Scalpel Handle - #3Fine Science Tools10003-12Used by authors
SkyScan 1272Bruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
Skyscan CT-VoxBruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SkyScan NReconBruker BioSpin CorpUsed by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans 
SolidWorks CADDassault SystèmesSolidWorks Research SubsriptionSolid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlueLoctite234790As suggested in protocol
Testing bathCustom madeUsed by authors
Thin film grips Custom madeUsed by authors
VeroWhitePlusStratasys LTDNA3D printing material used by authors
WinTest WinTest SoftwareUsed by authors to collect data

Referencias

  1. Girish, N., Ramachandra, K., Arun, G. M., Asha, K. Prevalence of Musculoskeletal Disorders Among Cashew Factory Workers. Archives of Environmental & Occupational Health. 67, 37-42 (2012).
  2. Thomopoulos, S., Parks, W. C., Rifkin, D. B., Derwin, K. A. Mechanisms of tendon injury and repair. Journal of Orthopaedic Research. 33, 832-839 (2016).
  3. Scott, A., Ashe, M. C. Common Tendinopathies in the Upper and Lower Extremities. Current Sports Medicine Reports. 5, 233-241 (2006).
  4. Praemer, A., Furner, S., Rice, D. P. Musculoskeletal Conditions in the United States. American Academy of Orthopaedic Surgeons. , (1992).
  5. Nourissat, G., Berenbaum, F., Duprez, D. Tendon injury: From biology to tendon repair. Nature Reviews Rheumatology. 11, 223-233 (2015).
  6. Galatz, L. M., Ball, C. M., Teefey, S. A., Middleton, W. D., Yamaguchi, K. The outcome and repair integrity of completely arthroscopically repaired large and massive rotator cuff tears. The Journal of Bone and Joint Surgery. 86, 219-224 (2004).
  7. Sher, J. S., Uribe, J. W., Posada, A., Murphy, B. J., Zlatkin, M. B. Abnormal findings on magnetic resonance images of asymptomatic shoulders. The Journal of Bone and Joint Surgery. 77, 10-15 (1995).
  8. Ker, R. F., Wang, X. T., Pike, A. V. Fatigue quality of mammalian tendons. The Journal of Experimental Biology. 203, 1317-1327 (2000).
  9. Wilson, J. J., Best, T. M. Common overuse tendon problems: A review and recommendations for treatment. American Family Physician. 72, 811-818 (2005).
  10. Fleischer, J., et al. Biomechanical strength and failure mechanism of different tubercula refixation methods within the framework of an arthroplasty for shoulder fracture. Orthopaedics & Traumatology: Surgery & Research. 103, 165-169 (2017).
  11. West, J. R., Juncosa, N., Galloway, M. T., Boivin, G. P., Butler, D. L. Characterization of in vivo Achilles tendon forces in rabbits during treadmill locomotion at varying speeds and inclinations. Journal of Biomechanics. 37, 1647-1653 (2004).
  12. Cavinatto, L., et al. Early versus late repair of rotator cuff tears in rats. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 27, 606-613 (2018).
  13. Potter, R., Havlioglu, N., Thomopoulos, S. The developing shoulder has a limited capacity to recover after a short duration of neonatal paralysis. Journal of Biomechanics. 47, 2314-2320 (2014).
  14. Connizzo, B. K., Sarver, J. J., Iozzo, R. V., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Effect of Age and Proteoglycan Deficiency on Collagen Fiber Re-Alignment and Mechanical Properties in Mouse Supraspinatus Tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 135, 021019 (2013).
  15. Beason, D. P., et al. Hypercholesterolemia increases supraspinatus tendon stiffness and elastic modulus across multiple species. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 22, 681-686 (2013).
  16. Miller, K. S., Connizzo, B. K., Soslowsky, L. J. Collagen fiber re-alignment in a neonatal developmental mouse supraspinatus tendon model. Annals of Biomedical Engineering. 40, 1102-1110 (2012).
  17. Cong, G. T., et al. Evaluating the role of subacromial impingement in rotator cuff tendinopathy: Development and analysis of a novel murine model. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2780-2788 (2018).
  18. Thomopoulos, S., Birman, V., Genin, G. M. Structural Interfaces and Attachments in Biology. Infection and Immunity. 35, (2013).
  19. Boivin, G. P., et al. Biomechanical properties and histology of db/db diabetic mouse Achilles tendon. Muscles, Ligaments and Tendons Journal. 4, 280-284 (2014).
  20. Ansorge, H. L., Adams, S., Birk, D. E., Soslowsky, L. J. Mechanical, Compositional, and Structural Properties of the Post-natal Mouse Achilles Tendon. Annals of Biomedical Engineering. 39, 1904-1913 (2011).
  21. Shu, C. C., Smith, M. M., Appleyard, R. C., Little, C. B., Melrose, J. Achilles and tail tendons of perlecan exon 3 null heparan sulphate deficient mice display surprising improvement in tendon tensile properties and altered collagen fibril organisation compared to C57BL/6 wild type mice. PeerJ. 6, 5120 (2018).
  22. Probst, A., et al. A new clamping technique for biomechanical testing of tendons in small animals. Journal of Investigative Surgery. 13, 313-318 (2000).
  23. Talan, M. Body temperature of C57BL/6J mice with age. Experimental Gerontology. 19, 25-29 (1984).
  24. Newton, M. D., et al. The influence of testing angle on the biomechanical properties of the rat supraspinatus tendon. Journal of Biomechanics. 49, 4159-4163 (2016).
  25. Schwartz, A. G., Lipner, J. H., Pasteris, J. D., Genin, G. M., Thomopoulos, S. Muscle loading is necessary for the formation of a functional tendon enthesis. Bone. 55, 44-51 (2014).
  26. Gimbel, J. A., Van Kleunen, J. P., Williams, G. R., Thomopoulos, S., Soslowsky, L. J. Long durations of immobilization in the rat result in enhanced mechanical properties of the healing supraspinatus tendon. Journal of Biomechanical Engineering. 129, 400-404 (2006).
  27. Freedman, B. R., Sarver, J. J., Buckley, M. R., Voleti, P. B., Soslowsky, L. J. Biomechanical and structural response of healing Achilles tendon to fatigue loading following acute injury. Journal of Biomechanics. 47, 2028-2034 (2014).
  28. Deymier, A. C., et al. The multiscale structural and mechanical effects of mouse supraspinatus muscle unloading on the mature enthesis. Acta Biomaterialia. 83, 302-313 (2019).
  29. Killian, M. L., Thomopoulos, S. Scleraxis is required for the development of a functional tendon enthesis. FASEB Journal. 30, 301-311 (2016).
  30. Schwartz, A. G., Long, F., Thomopoulos, S. Enthesis fibrocartilage cells originate from a population of Hedgehog-responsive cells modulated by the loading environment. Development. 142, 196-206 (2015).
  31. Bell, R., Taub, P., Cagle, P., Flatow, E. L., Andarawis-Puri, N. Development of a mouse model of supraspinatus tendon insertion site healing. Journal of Orthopaedic Research. 33, 25-32 (2014).
  32. Connizzo, B. K., Bhatt, P. R., Liechty, K. W., Soslowsky, L. J. Diabetes Alters Mechanical Properties and Collagen Fiber Re-Alignment in Multiple Mouse Tendons. Annals of Biomedical Engineering. 42, 1880-1888 (2014).
  33. Eekhoff, J. D., et al. Functionally Distinct Tendons From Elastin Haploinsufficient Mice Exhibit Mild Stiffening and Tendon-Specific Structural Alteration. Journal of Biomechanical Engineering. 139, 111003 (2017).
  34. Mikic, B., Bierwert, L., Tsou, D. Achilles tendon characterization in GDF-7 deficient mice. Journal of Orthopaedic Research. 24, 831-841 (2006).
  35. Sikes, K. J., et al. Knockout of hyaluronan synthase 1, but not 3, impairs formation of the retrocalcaneal bursa. Journal of Orthopaedic Research. 36, 2622-2632 (2018).
  36. Wang, V. M., Banack, T. M., Tsai, C. W., Flatow, E. L., Jepsen, K. J. Variability in tendon and knee joint biomechanics among inbred mouse strains. Journal of Orthopaedic Research. 24, 1200-1207 (2006).
  37. Wang, V. M., et al. Murine tendon function is adversely affected by aggrecan accumulation due to the knockout of ADAMTS5. Journal of Orthopaedic Research. 30, 620-626 (2011).
  38. Zhang, K., et al. Tendon mineralization is progressive and associated with deterioration of tendon biomechanical properties, and requires BMP-Smad signaling in the mouse Achilles tendon injury model. Matrix Biology. 52-54, 315-324 (2016).
  39. Rooney, S. I., et al. Ibuprofen differentially affects supraspinatus muscle and tendon adaptations to exercise in a rat model. American Journal of Sports Medicine. 44, 2237-2245 (2016).
  40. Galasso, O., et al. Quality of Life and Functional Results of Arthroscopic Partial Repair of Irreparable Rotator Cuff Tears. Arthroscopy - Journal of Arthroscopic and Related Surgery. 33, 261-268 (2017).
  41. Sarver, D. C., et al. Sex differences in tendon structure and function. Journal of Orthopaedic Research. 35, 2117-2126 (2017).
  42. Razmjou, H., et al. Disability and satisfaction after Rotator Cuff decompression or repair: A sex and gender analysis. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 66 (2011).

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