鼠头的生物力学试验

摘要

该协议描述了使用定制尺寸的3D打印夹具对肌腱进行高效和可重复的拉伸生物力学测试方法。

摘要

肌腱疾病是常见的，影响所有年龄的人，并经常使人衰弱。标准治疗，如消炎药、康复和手术修复，往往失败。为了定义肌腱功能并展示新疗法的疗效，必须准确确定动物模型中肌腱的机械特性。鼠种模型现在被广泛用于研究肌腱疾病和评估肌腱病的新疗法;然而，确定小鼠肌腱的机械特性一直具有挑战性。在这项研究中，为肌腱机械测试开发了一个新的系统，其中包括三维打印的固定装置，这些装置与腐殖质和钙化物的解剖完全匹配，分别用于机械地测试上皮肌腱和跟腱。这些夹具是使用原生骨解剖、固体建模和增材制造的 3D 重建来开发的。新方法消除了工件夹持故障（例如，生长板故障而不是肌腱故障），减少了总体测试时间，并增加了可重复性。此外，这种新方法很容易适应测试其他动物的其他肌腱和肌腱。

引言

肌腱疾病在老化、运动和活跃^{人群1、2、3}中很常见和高度流行。在美国，每年有1640万结缔组织损伤^报告，占所有与伤害有关的医生^{办公室就诊人数}的30%， ⁸.最常见的受影响的部位包括旋转手铐，跟腱，和骨^腱9。虽然已经探索了各种非手术和手术治疗，包括消炎药、康复和手术修复，但效果仍然很差，恢复功能有限，失败率^{高5 6}.这些不良的临床结果促使基础和翻译研究寻求了解肌腱病，并开发新的治疗方法。

拉伸生物力学特性是定义肌腱功能的主要定量结果。因此，肌腱病变和治疗效果的实验室表征必须包括对肌腱拉伸特性的严格测试。许多研究描述了从动物模型（如大鼠、绵羊、狗和^{兔子10、11、12）}中确定肌腱的生物力学特性的方法。然而，很少有研究测试过肌腱的生物力学特性，这主要是因为难以抓住小组织进行拉伸测试。由于鼠模型在机械研究肌腱病方面有许多优点，包括基因操作、广泛的试剂选择和低成本，因此需要开发准确、高效的生物力学方法来检测鼠组织。

为了正确测试肌腱的机械特性，必须有效地抓住组织，而不会在抓斗界面处打滑或被工器撕裂或生长板破裂。在许多情况下，特别是对于短肌腱，骨头被抓住一端，肌腱抓住另一端。骨骼通常通过嵌入环氧^树脂13和聚甲基丙烯酸^酯14、15等材料来固定。肌腱通常放置在两层沙纸之间，用氰丙烯酸酯粘附，并使用压缩夹（如果横截面平坦）或冷冻介质（如果横截面较大）15、16、17 固定.这些方法已应用于生物力学试验鼠肌腱，但由于标本体积小，生长板的符合性，从未^出现过18种，因此出现了挑战。例如，鼠头的直径只有几毫米，因此很难抓住骨头。具体来说，对肌腱到骨骼样本的拉伸测试通常会导致生长板的失效，而不是在肌腱或肌腱上。同样，对跟腱进行生物力学测试也极具挑战性。虽然跟腱比其他肌腱大，但卡内肌很小，使得抓住这个骨头变得困难。骨骼可以去除，然后抓住两个肌腱末端;然而，这排除了肌腱到骨骼附件的测试。其他团体报告使用定制的^{夹具19，20，}锚定在^夹21，固定在自固化塑料^水泥22或使用锥形^槽22，但这些以前的方法仍然受到低重现性、高夹持故障率和繁琐的准备要求的限制。

目前的研究目标是开发一种准确而有效的方法，用于对肌腱进行拉伸生物力学测试，以上皮肌腱和跟腱为例。利用来自原生骨骼解剖、实体建模和增材制造的 3D 重建组合，开发了一种控制骨骼的新方法。这些夹具有效地固定了骨骼，防止了生长板故障，减少了试样制备时间，并增加了测试的可重复性。新方法很容易适应测试其他鼠肌腱以及大鼠和其他动物的肌腱。

研究方案

动物研究得到了哥伦比亚大学机构动物护理和使用委员会的批准。本研究中使用的小鼠具有 C57BL/6J 背景，是从杰克逊实验室（美国梅港巴港）购买的。他们被安置在无病原体屏障条件下，并向他们提供食物和水。

1. 开发用于夹持骨的定制贴合 3D 打印夹具

1. 骨骼图像采集与3D骨骼模型构造
   1. 在准备 3D 模型创建和 3D 骨夹持打印时，解剖感兴趣的骨骼;腐殖质和卡卡内乌斯在当前协议中用作示例。
      注:步骤 2.1.1 中提供了用于机械测试的解剖骨肌肌肉标本的详细说明。应遵循以下步骤来隔离骨骼，以便创建 3D 打印的骨骼夹点。
      1. 腐殖质的解剖:根据IACUC批准的程序对一只老鼠进行安乐死。去除上肢皮肤，去除腐殖质上的所有肌肉，消除肘部和关节，并小心地去除所有附着在腐殖质上的结缔组织。
      2. 切卡内分科:根据IACUC批准的程序对一只老鼠进行安乐死。去除下肢皮肤，消除卡卡内斯和其他脚骨之间的跟腱-卡卡内斯关节和关节，并小心地去除所有连接到钙化物的连接组织。
   2. 对整个骨骼进行微计算断层扫描，例如扫描腐殖质和钙化物样本。
      注: 根据所使用的扫描仪，设置会有所不同。对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是:以55 kVP的能量扫描，以6μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 将阿加玫瑰粉混合在超纯水和微波中1-3分钟，直到甘蔗完全溶解。它有助于微波30-45秒，停止和旋转，然后继续朝沸腾。将冷冻管装满四分之三的甘蔗。让甘蔗冷却约5-10分钟。
      2. 将骨插入胶质凝胶（这将防止扫描过程中的运动伪影）。将带骨骼的冷冻管插入扫描仪。
         注:对于当前研究中使用的扫描仪，所有扫描都使用 16 位置自动样本更换器。此扫描仪可以根据样本的大小和形状自动选择放大倍率。
   3. 重建微计算断层扫描投影图像到横截面图像。对实验者的扫描仪/软件组合使用推荐的参数。
      注:对于当前研究中使用的程序（材料表），建议使用以下重建参数:平滑:0-2，光束硬化校正:45，环技术还原:4-9，并在16位TIFF中重建切片格式。
   4. 创建 3D 模型并保存到与大多数 3D 打印机和快速原型设计兼容的标准 STL 格式中。对于当前研究中使用的程序（材料表），执行以下操作:
      1. 选择命令文件>打开以打开文件数据集。打开对话框"文件>首选项"并选择"高级"选项卡。
      2. 使用自适应渲染算法构造 3D 模型。该算法最大限度地减少了分面三角形的数量，并提供更平滑的表面细节。使用 10 作为局部参数;此参数定义到用于查找对象边框的相邻点的距离（以像素为单位）。将容差最小化为 0.1，以减小文件大小。
         注: 打开数据集后，图像将显示在"原始图像"页中。
      3. 要指定兴趣量 （VOI），请手动选择要设置为所选 VOI 范围的顶部和底部的两个图像。
      4. 移动到第二页，感兴趣的区域。在单个横截面图像上手动选择感兴趣的区域。
         注: 所选区域将以红色突出显示（即，胡同横截面区域）。
      5. 每 10~15 个横截面图像重复上一步。
      6. 移动到第三页二进制选择。在直方图菜单上，单击"从数据集"。将显示数据集所有图像的亮度直方图分布。此外，在直方图菜单上，单击"创建 3D 模型"文件菜单。
   5. 以 STL 文件格式保存骨骼的 3D 模型。
   6. 优化网格:操作网格以减小 STL 文件的大小，使其与任何实体建模计算机辅助设计程序兼容。对于当前研究中使用的程序（材料表），请按照以下步骤操作:
      1. 导入网格并选择要编辑的所有网格。从工具集"编辑"中选择"减少"。然后，从工具集中选择"减少目标"三角形预算。减少三次计数并接受更改。通过选择"导出"作为...
2. 定制骨骼夹具的设计
   1. 上皮拉皮纳斯肌腱-腐殖质骨
      1. 使用实体建模计算机辅助设计程序创建 Humerus 夹持夹具的自定义拟合模型（图 1，补充文件）。
         注:当前研究中使用的程序列在"材料表"中。
      2. 在实体建模程序中打开腐殖质骨骼的 STL 格式文件，并保存为零件文件。
         注:对于当前研究中使用的软件（材料表），3D骨骼对象以SLDPRT格式保存。
      3. 打开零件文件并手动创建三个与解剖学相关的平面（即，下垂、日冕、横向）。
         1. 手动定义下垂平面，以在更大的管状下切开上皮肌腱附件。确保 3D 块包含作为对称平面的下垂平面。为此，如果需要，应从块中添加或切割材料。
            注:此对称平面可确保将试样插入夹具时，肌腱和肌腱附件位于夹具的中轴。
      4. 沿三个平面（即高度、宽度、长度）测量骨骼的尺寸。
      5. 测量将连接 3D 打印夹具的机械测试夹具的尺寸。
      6. 首先设计实心块零件（例如，实心圆柱体）。
         1. 确保块的每个尺寸至少比腐殖质的尺寸大 5 mm。
         2. 考虑机械测试夹具的设计约束（即，确保 3D 打印夹具可以在机械测试夹具中自由组装和拆卸）。
      7. 创建具有两个零部件的装配模型:实心块和右侧或左侧腐殖质骨骼。定义块内骨骼的方向（即肌腱和骨骼之间的角度）。确保整个骨骼体积适合块内。
      8. 使用腐殖质骨作为模具在块中创建空腔。如果使用材料表中指定的软件，请按照以下步骤操作:
         1. 将设计零件（腐殖质）和模具底座（缸体）插入临时组件。在装配体窗口中，选择块，然后从装配体工具栏单击"编辑零部件"。
         2. 单击插入>特征>型腔。选择"均匀缩放"，然后输入 0% 作为在所有方向进行缩放的值。
      9. 抑制骨骼零件并将装配体另存为零件。
      10. 打开零件（带型腔的圆柱体）。沿下垂平面切割零件，以创建两个对称的部件，这些组件在骨骼前部和后部配合（例如，两个半圆柱体，如图1所示）。
          注:两个组件设计为适合骨骼前和后。前部分量包括一个半球形的腔，从腐殖质头的前侧延伸到上皮肌腱附件。后部腔的形状类似于腐殖质的后部分（即腐殖质头的后侧、三角管状、中侧和侧史诗）。
      11. 将每个组件另存为单独的文件部件。
      12. 对于前部分量，通过定义适当的公差，确保腐殖质头嵌入零件的腔中。
          注:在当前研究中，使用材料表中指定的软件，建议按照以下步骤操作:
          1. 创建旋转切割以平滑型腔的网格几何体。通过模拟型腔几何体并添加位置间隙，为切割创建草图。
             注: 间隙允许在骨骼和前零部件之间自由组装和拆卸。
      13. 修改后零部件以模仿型腔几何体以创建增加间隙的切口，如上文所述的前零部件。
      14. 在横向平面上进行切割，从后部的顶部开始，一端到大/小管板的峰顶。
          注:如图1和图2所示，后侧分量包括一个切口，在肌腱附件处创建一个开口。
      15. 在两个零部件之间创建舒适配合，以便自由组装和拆卸。
          注: 在当前算例中，为夹具创建了带有松散运行间隙的孔轴配合。
      16. 为对方肢体（即左侧或右侧）的夹具的每个零部件创建 3D 镜像模型。
      17. 在夹具底部添加蚀刻以区分左右两侧。
      18. 以 STL 标准文件格式保存所有夹具部件，为 3D 打印做准备。
   2. 阿基里斯肌腱-卡卡内斯骨
      1. 按照上述步骤操作，用于上皮胡体头夹具。
         注:阿喀琉斯卡卡内只需一组固定装置，因为左右钙化物骨骼的解剖结构几乎对称。

2. 鼠腱的生物力学试验

1. 标本制备和横截面面积测量
   1. 在准备拉伸机械测试时，解剖感兴趣的肌肉-肌腱骨。在目前的研究中，从8周大的C57BL/6J小鼠中分离出超皮肌 - 肌腱 - 腐殖质骨标本（N=10，5雄性，5雌性）和胃关节肌- 阿基里斯肌腱-卡内乌斯骨标本（N=12，6雄性，6雌性）。
      1. 解剖上皮皮肌 - 肌腱 - 腐殖质骨标本
         1. 根据IACUC批准的程序对鼠标实施安乐死。将鼠标置于易放置位置。从前爪肘部上方向肩部切开皮肤。
         2. 用钝切除仔细去除皮肤，使肩部的肌肉可见。取出腐殖质周围的组织，直到骨头暴露，并可以用钳子牢固地固定。
         3. 用钳子握住腐殖质，并小心地去除三角和梯形肌肉，以暴露胸围。识别关节关节，用手术刀小心地将锁骨与颈骨分离。
         4. 注意不要损坏上皮肌腱及其骨质附件，使用手术刀从其肩囊附件中取出肌肉。注意不要损坏上皮肌腱及其骨质附件，将腐殖质头从鹰形分离;使用手术刀刀片，撕裂关节胶囊和红外线，下囊，和三叶肌腱。
         5. 分解肘关节，将腐殖质与 ulna 和半径分开。分离腐殖质 - 上皮肌腱 - 肌肉标本，并清除腐殖质和腐殖质头上多余的软组织。
      2. 阿基里斯肌腱的解剖 - 卡卡内斯骨样本
         1. 根据IACUC批准的程序对鼠标实施安乐死。将鼠标置于易放置位置。注意不要损坏跟腱及其骨质附件，用钝切除去除皮肤，使脚踝和膝关节周围的肌肉暴露。
         2. 使用手术刀刀片，从跟腱 - 卡卡内斯附件开始，小心地将胃肠肌从近端附件中分离出来。
         3. 仔细地从各种相邻的骨头中解说钙化物。分离跟腱 - 卡卡内斯标本，并清除多余的软组织。
   2. 使用微计算断层扫描确定肌腱的横截面区域。
      注:对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是:以55 kVP的能量扫描，以5μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 将阿加玫瑰粉混合在超纯水和微波中1-3分钟，直到甘蔗完全溶解。它有助于微波30-45秒，停止和旋转，然后继续朝沸腾。将冷冻管装满四分之三的甘蔗。让甘蔗冷却约5-10分钟。
      2. 将骨骼倒置插入冷冻管中，将试样挂起。
         注:只有骨头应位于胶质凝胶中。肌腱和肌肉应该悬挂在外。
   3. 扫描后，使用手术刀轻轻去除肌腱的肌肉。将试样插入 3D 打印夹具中。
      注: 夹持对于每个测试都是可重用的。请勿在夹具中使用胶水或环氧树脂;骨头被扣在压合。
   4. 在折叠的薄纸巾（2 厘米 x 1 厘米）之间插入和粘合肌腱，并使用薄膜夹紧夹紧结构。将带有试样的 3D 打印夹具连接到测试夹具中。
   5. 在37°C（即小鼠^体温23）将样品和手柄插入磷酸盐缓冲盐水（PBS）测试槽中。
2. 拉伸测试
   1. 在材料测试框架上执行拉伸机械测试。
      注:对于当前研究中使用的测试框架（材料表），建议的协议是:
      1. 将仪表长度定义为从肌腱附件到上部手柄的距离。
      2. 在 0.05 N 和 0.2 N 之间循环 5 个周期的前提条件。
      3. 保持 120 s。
      4. 使用张力以 0.2%/s 的故障。
   2. 收集负载变形数据。
   3. 将应变计算为相对于肌腱初始仪表长度的位移。
   4. 计算应力，将力除以初始肌腱横截面面积（从微CT测量）。
   5. 如果对粘弹性行为感兴趣，在张力测试失败之前执行应力松弛，并使用数据从准线性粘弹性模型²⁴中计算 A、B、C、tau1 和 tau2 等参数。
   6. 从载荷变形曲线中，计算刚度（曲线线性部分的斜率）、最大力和要屈服的工作（曲线下的面积到屈服力）。
      1. 通过在负载变形曲线中选择点窗口来标识线性部分，该窗口在线性最小二乘回归²⁵中最大化 R²值。
      2. 将刚度确定为载荷位移曲线^25、26的线性部分的斜^率。
   7. 从应力应变曲线中，计算模量（曲线线性部分的斜率）、强度（最大应力）和弹性（曲线下的面积，以产生应力）。
      注: 使用 RANSAC 算法，当 y 拟合偏离预期应力值 （y 值） 的 0.5% 时，屈服应变 （x 值） 被定义为第一个点。屈服应力是屈服应变的对应 y 值。
      注:除了当前研究中描述的单调拉伸载荷到故障之外，循环载荷还可以提供有关肌腱疲劳和/或粘弹性特性的重要信息。例如，弗里德曼等人^报告了27号肌腱的疲劳特性。
   8. 完成拉伸测试后，对整个骨骼进行微计算断层扫描，例如扫描腐殖质和卡卡内乌斯样本。
      注:对于当前研究中使用的扫描仪（材料表），建议的设置是:以55 kVP的能量扫描，以6μm的分辨率扫描Al0.25滤波器。
      1. 重复步骤 1.1.2.1~1.1.2.2。
   9. 重复步骤 1.1.3。
   10. 使用与扫描仪兼容的 3D 可视化程序创建扫描对象的卷渲染 3D 模型。
       注:当前研究中使用的程序列在"材料表"中。
   11. 通过检查 3D 对象确定故障模式和故障站点区域。
3. 统计分析:将所有样本结果显示为均值 = 标准差 （SD）。使用学生的 t 测试（双尾和未配对）对组进行比较。将显著性设置为p < 0.05。
   注:当前研究中使用的统计软件列在材料表中。

结果

3D打印的固定装置用于测试8周大的鼠超脊柱和跟腱。所有经过机械测试的样品在检测时均失败，其特点是微CT扫描、目视检查和拉伸测试后的视频分析。图3对实验室中以前和当前超皮肌腱测试方法的一对一比较。在上一种方法28，29，30中，腐殖质骨被嵌入环氧树脂中，一个回形针被放置在腐殖质头部，以防止生长板断裂。...

讨论

鼠群模型通常用于研究肌腱疾病，但其机械特性的表征在文献中具有挑战性且罕见。该协议的目的是描述一种对肌腱进行拉伸测试的时间高效和可重复的方法。新方法将测试样本所需的时间从数小时缩短到几分钟，并消除了以前方法中常见的重大夹持伪影。

该协议中描述的几个步骤对于生产有效的夹具至关重要，机械测试鼠超脊柱和跟腱。首先，步骤 1.1.4 是创建所需骨骼的 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Fisher Scientific	BP160-100	Dissovle 1g in 100 ml ultrapure water to make 1% agarose
Bruker microCT	Bruker BioSpin Corp	Skyscan 1272	Used by authors
ElectroForce	TA Instruments	3200	Testing platform
Ethanol 200 Proof	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% and use as suggested in protocol
Fixture to attach grips	Custom made		Used by authors
Kimwipes	Kimberly-Clark	S-8115	As suggested in protocol
MicroCT CT-Analyser (Ctan)	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
MilliQ water (Ultrapure water)	Millipore Sigma	QGARD00R1 (or related purifier)	100 ml
Meshmixer	Autodesk	http://www.meshmixer.com/	Free engineering software used by authors to refine mesh
Objet EDEN 260VS	Stratasys LTD		Precision Prototyping
Objet Studio	Stratasys LTD		Used by authors with 3D printer
PBS - Phosphate-Buffered Saline	ThermoFisher Scientific	10010031	2.5 L of 10% PBS
S&T Forceps	Fine Science Tools	00108-11	Used by authors
Scalpel Blade - #11	Fine Science Tools	10011-00	Used by authors
Scalpel Handle - #3	Fine Science Tools	10003-12	Used by authors
SkyScan 1272	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
Skyscan CT-Vox	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SkyScan NRecon	Bruker BioSpin Corp		Used by authors for visualizing and analyzing micro-CT scans
SolidWorks CAD	Dassault Systèmes	SolidWorks Research Subsription	Solid modeling computer-aided design used by authors
SuperGlue	Loctite	234790	As suggested in protocol
Testing bath	Custom made		Used by authors
Thin film grips	Custom made		Used by authors
VeroWhitePlus	Stratasys LTD	NA	3D printing material used by authors
WinTest	WinTest Software		Used by authors to collect data