طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس

Renat  N. Khaliullin; Jeffrey  M. Hendel; Adina Gerson-Gurwitz; Shaohe Wang; Stacy  D. Ochoa; Zhiling Zhao; Arshad Desai; Karen Oegema; Rebecca  A. Green

doi:10.3791/60362

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.

Abstract

C. اليجايليس هو النظام الرئيسي للتحليل المنهجي لمواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء النمو الجنيني. ويتمثل أحد التحديات في ان الاجنه تتكشف ديناميكيا علي مدي فتره تبلغ حوالي 13 ساعة ؛ وقد ادي هذا المقياس الزمني الذي دام نصف يوم إلى تقييد نطاق التجارب من خلال الحد من عدد الاجنه التي يمكن ان تكون غير محدده العمر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه التي تسمح للتصوير في وقت واحد 3D الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه في وقت معتدل القرار ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. البروتوكول هو واضح ويمكن تنفيذها من قبل اي مختبر مع الوصول إلى المجهر مع نقطه القدرة علي الزيارة. ويتجلى الفائدة من هذا البروتوكول باستخدامه لصوره اثنين من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للمواصفات الجرثومية طبقه ونشاه المستنقعات. لتحليل البيانات ، تم بناء برنامج مخصص يقوم باقتصاص الاجنه الفردية من مجال عرض أوسع في جميع القناات ، والخطوات z ، والنقاط الزمنيه ، ويحفظ المتواليات لكل جنين في كومه tiff منفصلة. وهذا البرنامج ، الذي يتضمن واجهه مستخدم رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ، يبسط معالجه البيانات عن طريق العزل ، والمعالجة المسبقة ، وتوجيه الاجنه الفردية بشكل موحد استعدادا للتصور أو التحليل الألى. كما يتم توفير ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع بيانات الجنين الفردية في ملف متعدد اللوحات يعرض الحد الأقصى من الإسقاطات الفلورية وصور الحقول الساطعة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. تم التحقق من صحة البروتوكولات والاداات الموصوفة هنا باستخدامها لتوصيف النمو الجنيني بعد ضرب 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا. هذا التحليل تصور الأنماط الظاهرية التنموية المشروحة سابقا وكشفت عن أخرى جديده. وباختصار ، فان هذا العمل يفصل طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه إلى جانب برنامج الاقتصاص وأداه التصور ImageJ التي ، عندما يقترن مع سلالات التعبير عن علامات الفلورسنت المعلوماتية ، يسرع إلى حد كبير التجارب لتحليل النمو الجنيني.

Introduction

الجنين c. ايلينيسس هو نظام نموذجي مهم لبيولوجيا الخلية الميكانيكية وتحليل مواصفات مصير الخلية والاحداث مورفوجينيتيك قياده التنمية الجنينية¹^,²^,³^,⁴ ^،⁵^،⁶^،⁷^،⁸^،⁹. حتى الآن ، تم تحقيق الكثير من توصيف كل من الاحداث علي المستوي الخلوي ومواصفات مصير الخلية في الجنين باستخدام الاستبانة الزمنيه عاليه نسبيا تجارب التصوير الواحد في الوقت (اي اقتناء كل 10-100 ثانيه) من الاجنه التعبير عن علامات الفلورسنت. وعلي الرغم من ان هذا النهج مناسب تماما للاحداث التي تقام علي ترتيب الثواني إلى عشرات الدقائق ، فانه يصبح مقيدا من الناحية التقنية لتوصيف العمليات الأطول ، علي حسب ترتيب الساعات والأيام. التنمية الجنينية من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله يستغرق حوالي 10 ساعة. في هذا المقياس الزمني ، والطرق شبه عاليه الانتاجيه التي من شانها ان تسمح للتصوير في وقت واحد اقل دقه التصوير (اي الاستحواذ علي فترات زمنيه 5-20 دقيقه) من المجموعات الأكبر من الاجنه ، من ظروف مختلفه ، من شانه ان يفتح نطاقا جديدا من التجارب ؛ علي سبيل المثال ، تمكين جهود الفحص المنهجي علي نطاق واسع وتحليل اعداد كافيه من الاجنه للمقارنة بين عواقب الاضطرابات الجزيئية.

هنا ، ونحن وصف طريقه شبه عاليه الانتاجيه لرصد الاجنه c. التي تمكن في وقت واحد 3d التصوير الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. والبروتوكول مباشر لتنفيذه ويمكن ان يقوم به اي مختبر مع امكانيه الوصول إلى المجهر مع قدرات زيارة نقطه. وترد الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. وباختصار ، يتم تشريح الاجنه من البالغين الذين يعبرون عن علامات الفلورسنت المثيرة للاهتمام ونقل الاجنه الشابة (2 – 8 خلايا المرحلة) إلى الآبار من لوحه 384 البئر للتصوير. وفي هذا الشكل ، فان حجم البئر الصغير نسبيا يدخل الاجنه في منطقه ضيقه ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. للحفاظ علي التطور متزامن تقريبا عبر مجموعه من الاجنه ، يتم تنفيذ التفكيك في وسائل الاعلام المبردة ويتم عقد لوحه علي الجليد ، والذي يمنع تطورا كبيرا خلال النافذة وقت التشريح ساعة طويلة. يتم نقل لوحه إلى المجهر ويتم تصوير الاجنه في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة بين عشيه وضحيها ، في 20 فتره زمنيه دقيقه ، وذلك باستخدام 60x الغمر النفط 1.35 NA عدسه ، لجمع الكامل z-المدى في 2 ميكرومتر الخطوات. 50 الحقول التي تحتوي علي ما بين 1 إلى 5 أجنه ، والتي يتم تصويرها في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. اعتمادا علي التجربة المطلوبة ، يمكن زيادة دقه الوقت (علي سبيل المثال ، التصوير بفواصل زمنيه تتراوح بين 5 و 10 دقائق) من خلال تقليل عدد الحقول التي لم يتم الحد منها بشكل تناسبي.

مع هذا البروتوكول ، حتى الشوط الواحد بين عشيه وضحيها يولد كميه كبيره من البيانات (80-100 الاجنه موزعه علي 50 الحقول) والتجارب الكبيرة يمكن ان تصبح بسرعة لا يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق بتحليل البيانات. لتسهيل المعالجة والتصور وتبسيط تحليل هذه البيانات ، تم بناء برنامج لاقتصاص وتوجيه الاجنه وتنفيذ خطوات المعالجة المسبقة (اختياري) ، وماكرو ImageJ الذي يجمع البيانات لتبسيط العرض. ويمكن استخدام هذه البرامج لمعالجه الصور التي تم جمعها باستخدام النهج التقليدية ، لأنها مستقله عن طريقه التصوير ، وتتطلب فقط طائره واحده من الحقول الساطعة. البرنامج الأول ياخذ في حقل 4D التي تحتوي علي الاجنه متعددة (GUI الخيار أو رمز المصدر embryoCrop.py) أو حقول 4D متعددة تحتوي علي الاجنه متعددة (screenCrop.py) ، والمحاصيل باحكام الاجنه ويوجه لهم في التكوين الخلفي الامامي. كما تمنح هذه البرامج المستخدمين خيار اجراء الطرح الخلفي وتصحيح الانحراف وتصحيح التوهين. الملفات الناتجة هي بشكل موحد قبل المعالجة ، مكدسات tiff اقتصاص باحكام لكل جنين التي هي قابله للتعديل إلى تحليل الصور الألى. لجعله ابسط لعرض جميع الاجنه لكل شرط ، وقد كتب ماكرو ImageJ (OpenandCombine_embsV2) ، الذي يجمع كل الاجنه من حاله معينه في كومه tiff واحده والصور والمصفوفات برايت الحقل الأقصى الإسقاط كثافة اللون ( RGB) تراكبات ، جنبا إلى جنب ، لكل جنين. تم التحقق من صحة الأساليب باستخدامها لتوصيف التنمية الجنينية بعد ضرب من 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا في زوج من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للطبقة الجرثومية مواصفة و [مورفوجنسيس]¹⁰^,¹¹. ومعا ، فان بروتوكول تصوير الاجنه شبه العالية وأداات معالجه الصور ستمكن من اجراء التجارب علي عدد أكبر من العينات وجهود الفرز الواسعة النطاق الرامية إلى فهم العمليات التنموية. الاضافه إلى ذلك ، ستوفر هذه السلالات أيضا وسيله فعاله لفحص اثار الاضطرابات الجزيئية علي الاجنه.

Protocol

1 . اعداد الاجنه الخاصة بالتصوير شبه العالي الانتاجيه

ملاحظه: والهدف من هذا الجزء من البروتوكول هو تحميل السكان من شبه متزامنة (2 إلى 8-خليه المرحلة) c. الاجنه ، تشريح من سلالات علامة مناسبه (الشكل 2) ، إلى أسفل الزجاج 384-بئر لوحه للتصوير. ويمكن أيضا ان تعمل اشكال اللوحات الأخرى ، ولكن يفضل لوحات البئر 384 لان حجم البئر الصغير يقيد انتشار الاجنه إلى منطقه صغيره نسبيا ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. ويضمن تزامن الاجنه تقريبا ان يتم التقاط المسار الكامل للتنمية لكل من الاجنه في الحقل.

اعداد 5-10 مل من 0.1 mg/mL محلول من هيدروكلوريد تيترايسوزول (TMHC) مخدر المذاب في الجليد الباردة مسنومكس المتوسطة (0.45 M Na₂hpo₄∙ 7h₂O, 0.11 m KH₂PO₄, 0.04 m nacl, 0.09 m NH₄Cl) لاستخدامها خلال تشريح والتصوير. وتشمل وسائل الاعلام هذه المخدرات للتاكد من ان اليرقات المتحركة التي فقست لا تعطل تصوير الاجنه في مراحل النمو المبكرة.
ملاحظه: إذا كنت تستخدم أدوات الاقتصاص والتصور لتحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام أساليب تركيب اللوحة القياسية ، فانتقل إلى القسم 3 أدناه.
Aliquot 70 μL من المحلول المعد في الآبار الفردية من الزجاج السفلي 384-بئر لوحه مع واحد جيدا لكل حاله ؛ تجنب الصفين الخارجيين من لوحه لمنع تاثيرات الحافة.
ملاحظه: فمن المفيد لإخفاء الآبار المحيطة بها باستخدام لاصق PCR لوحه إحباط (انظر المثال في الشكل 1د) وهذا يحفظ الآبار المجاورة للتجارب في المستقبل ويجعل من الأسهل لتحديد موقع الآبار المناسبة تحت المجهر تشريح. وبمجرد الاقتباس من الحل ، والحفاظ علي لوحه والحل المتبقي علي الجليد في جميع انحاء تشريح.
توليد الفم pipetsات أليفه لنقل الاجنه من الشريحة الاكتئاب (حيث يتم تشريح المخنثين البيض) إلى الآبار. سحب pipets الشعرية (25 μL الpipets معايره) علي لهب وكسر لتوليد نهاية مدببه غرامه (الشكل 1د). وهناك حاجه إلى ماصه pipet-x واحد لكل حاله لمنع التلوث المتبادل ؛ تجاهل ماصه pipet-x بعد الاستخدام.
استخدام ملاقط غرامه لنقل ~ 10 البالغين البيض تحت نطاق تشريح في 150 μl من محلول الجليد tmhc الباردة المقتبسة علي شريحة الاكتئاب لكل حاله. باستخدام ملاقط ومشرط ، تشريح الديدان للإفراج عن الاجنه.
قم بتحميل ماصه pipet-x الشعرية المسحوبة في ملحق الشفط المرفق مع الpipetsات أليفه ، و ماصه pipet-x الفم لنقل كل من 2 إلى 8-خليه مرحله الاجنه إلى بئر الفرد من لوحه أعدت (الشكل 1د). تجنب نقل أجنه المرحلة المتاخره وبقايا التشريح. فحص تحت نطاق تشريح وإذا المجاميع من الاجنه موجودة ، ماصه pipet-x الفم صعودا وهبوطا أو الاستفادة من كتل من الاجنه مع غيض ماصه pipet-x لتفريق.
ملاحظه: لمنع التلوث المتبادل ، ومعدات التشريح النظيفة واستخدام ماصه pipet-x الفم الطازجة في حين تتحرك بين الظروف. يخزن الطبق علي الثلج بين الأجزاء المتقطعة.
مره واحده وقد تم تشريح الديدان من جميع الظروف ووضع الاجنه في البئر المناسبة ، وتدور لوحه 384-بئر لمده 1 دقيقه في 600 x g لتسويه الاجنه.
امسح الجزء السفلي من الطبق بمسحه من الايثانول المنقوع لأزاله اي بقايا ووضع الصفيحة علي مجهر كونبؤري مزود بحامل لوحه في بيئة تسيطر عليها درجه الحرارة.
ملاحظه: الخطوات التي تتبع التفاصيل هذا الأسلوب باستخدام اعداد المعمل; يرجى تعديل شروط الاقتناء لتلائم الاحتياجات والمعدات التجريبية. هنا ، مربع الماسح الضوئي المحورية مجهزه ميكرولنس-تعزيز المزدوج Nipkow الغزل القرص ، 512 x 512 الكاميرا المضادة لاتفاقيه مكافحه التصحر ، وعاليه الدقة السيارات XY المرحلة (القرار المعين 0.1 μm) والميكانيكية z-محور السيطرة (القرار المعين 0.1 μm) يستخدم. يتم الاحتفاظ بهذا النظام في غرفه 16 درجه مئوية ، والتي تحافظ علي درجه حرارة المجهر بين 21 و 23 درجه مئوية خلال التصوير بين عشيه وضحيها.
للتعرف علي الحقول التي تحتوي علي أجنه مناسبه ، قم باجراء فحص مسبق لكل بئر باستخدام هدف 10x 0.4 وبرنامج التصوير المناسب. ستحتوي الحقول الأكثر مثاليه علي أكثر من جنين في مرحله مبكرة في نفس المستوي البؤري مثل الاجنه الأخرى ، ومن الناحية المثالية سيكون لديك الحد الأدنى من الاتصال بين الاجنه المجاورة. وضع علامة علي مواقع المناطق المناسبة.
لتحديد حقول التصوير ، قم بالتبديل إلى الهدف 60x واضبط المستوي البؤري عند زيارة كل نقطه لقسم الاجنه بشكل مناسب. 1 – 4 حقول لكل بئر يتم تصويرها ، لما مجموعه 50 حقلا عبر 14 بئرا ، ويمكن ان يحتوي كل حقل علي ما بين جنين واحد وخمسه أجنه. وبشكل عام ، يتم اختيار ما بين 4 إلى 15 أجنه من كل حاله للتصوير عالي الدقة.
ملاحظه: والمتغير الرئيسي في هذه الخطوة هو استخدام النفط الكافي ؛ وضع النفط علي الهدف ، وزيارة نقاط في كل بئر لنشر النفط حول سطح جميع الآبار ومن ثم تطبيق قطره اضافيه من النفط إلى الهدف قبل اختيار الحقول.
صوره الحقول المحددة باستخدام 60x 1.35 NA الهدف للحصول علي المقاطع 18 z في فواصل 2 μm كل 20 دقيقه ل 10 ح. ظروف التصوير باستخدام سلالات الجرثومية وطبقه الجراثيم والمراسلات هي كما يلي: برايت فيلد ، 90 ٪ السلطة ، 25 مللي ثانيه ، وزيادة 20 ٪ ؛ 488 nm ، 100% الطاقة ، 200 مللي ثانيه ، 60% كسب ؛ 568 نانومتر ، 45 ٪ الطاقة ، 150 مللي ، 60 ٪ كسب.
بعد التصوير كامله ، وتقييم الفتك الجنينية من خلال أداء منخفضه التكبير (10x 0.4 NA الهدف) المسح الضوئي بشكل جيد كامل برايت فيلد ~ 20 – 24 ساعة بعد بدء التصوير بين عشيه وضحيها.

2. الفتك الجنيني التهديف

باستخدام الحقول الممسوحة ضوئيا التي تم فحصها بعد 10 مرات ، يمكنك تقييم الفتك الجنيني وعيوب اليرقات من خلال عد الديدان الفقسه والاجنه غير المظللة لكل بئر.
يسجل الاجنه غير المظللة كقاتله جنينيه. استبعاد الاجنه المقبوض عليها من واحد إلى أربعه خلايا من العد المميت ، لان الاجنه الصغيرة التي يتم تشريحها تفشل أحيانا في إكمال تكوين قشر البيض (إذا لم يكتمل الانقسام الثاني بعد) ويمكن ان تؤدي عيوب النفاذيه إلى مضاعفات الاسموزي خلال المرحلتين الأوليين الشعب.
النقاط التي فقست جزئيا أو فقست تماما الديدان مع شكل الجسم أو العيوب السلوكية ، مثل دامبي أو مشلولة ، كما "اليرقة غير طبيعيه".

3-الاقتصاص الألى (الشكل 3ا)

ملاحظه: ويقع البرنامج في موقعين: (1) Zenodo المنازل نسخه سهله الاستخدام من البرنامج¹² التي لا تتطلب اي خبره البرمجة. (2) جيثب يحتوي علي شفره المصدر لبرنامجنا embryoCropUI.py و screenCrop.py¹³، والتي تتطلب إتقان مع بيثون. ويمكن الاطلاع علي تعليمات مفصله لتحميل وتشغيل كلا الإصدارين من البرنامج أدناه.

الاقتصاص الألى باستخدام الإصدار القابل للتنفيذ الخاص بالاجنه (الإصدار السهل للمستخدم)
1. لاستخدام برنامج الاجنه ، قم أولا بتحميل البرنامج من Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
  1. قم بتنزيل إصدار تنسيق MacOS أو Windows الخاص بالبرنامج (لاحظ ان إصدار MacOS يتطلب MacOS X 10-11 أو اعلي).
  2. تحميل ملف التعليمات (GUI_Instructions_zenodo_repoV2) ، الذي يوفر تعليمات خطوه بخطوه للاختبار واستخدام برنامج الاجنه.
  3. قم بتنزيل test_files لاختبار إذا كان البرنامج يعمل بشكل صحيح علي النظام الأساسي (انظر التعليمات).
2. مره واحده تحميلها ، بفك وانتقل إلى العثور علي القابلة للتنفيذ الجنينية (... \ الاجنهالجنينية) أو (... \الاجنهالجنينية) (.................. انقر نقرا مزدوجا لإطلاق (أو اختار ' فتح مع ' الطرفية) وتشغيل القابلة للتنفيذ الجنينية.
3. القابل للتنفيذ GUI المحاصيل حقل 4D واحد من طريقه العرض في كل مره. في الزاوية العلوية اليسرى ، حدد الزر فتح لتحميل الحقل المحدد لاقتصاص (متعدد الtiff). في حاله اقتصاص سلسله tiff ، مع ابعاد متعددة (اي ، z ، الوقت ، القناة) ، قم بتحميل الصورة الاولي فقط في السلسلة ضمن المجلد (سلسله tiff واحده لكل مجلد).
4. بمجرد تحميل الصور ، حدد المعلومات التالية: عدد الشرائح z ، (Z) ، عدد النقاط الزمنيه (T) ، عدد القناات (C) ، القناة التي تتوافق مع DIC أو الحقل الساطع (الأول = 1 ، الثاني = 2 ، الخ).
5. حدد معالجه اضافيه لتشغيلها علي الصور. ويقدم البرنامج تصحيح الانجراف ، والطرح الخلفي ، وتصحيح التوهين.
6. تحديد معلمات لطرح الخلفية وتصحيح التوهين لتوجيه جهود المعالجة في موجه واجهه المستخدم الرسوميه. للحصول علي الخلفية طرح ، تعريف أكبر حجم الميزة لتعكس حجم اشاره ذات مغزى; لا يجب اعتبار حجم هذه الميزة كخلفيه ويجب ان تكون قيمه رقم فردي. إدخال قيمه من 0-1 لتصحيح التوهين. تعكس قيمه تصحيح التوهين نسبه الكثافة الاصليه التي تبقي عند العمق الأبعد للكائن قيد التصوير.
  ملاحظه: يجب تشغيل الطرح الخلفي وتصحيح التوهين معا.
7. حدد أمر مجموعه الصور (اي ، القناة-z-الوقت (czt) ، أو z-قناه-الوقت (zct)).
8. تحديد ميكرون لكل بكسل للصور استنادا إلى الكاميرا المستخدمة.
  ملاحظه: سيحدث اقتصاص الصورة الضعيف إذا لم يتم تعريف حجم البكسل بشكل صحيح.
9. حدد تشغيل في الزاوية اليسرى السفلية. سيتم إنشاء مجلد فرعي جديد يسمي "اقتصاص" في نفس مسار المجلد غير الاقتصاص; سيتم حفظ الإصدارات التي تم اقتصاصها في هذا الموقع. اعتمادا علي حجم الملف ، يجب إكمال الاقتصاص في غضون ثوان إلى دقائق.
الاقتصاص الألى باستخدام screenCrop.py (النسخة الدفعة بديلا لواجهه المستخدم الرسوميه المذكورة أعلاه.المستخدمين الدهاء بيثون فقط)¹⁰^,¹³
1. لاستخدام screenCrop.py ، إصدار برنامج بايثون لاقتصاص مجموعات البيانات الكبيرة بتنسيق دفعي ، استنساخ أو تحميل شفره المصدر من جيثب (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
2. قراءه الإرشادات لتكوين بيئة افتراضيه صحيحه واتبع نظام تسميه الملفات الموصوفة; كل منها مفصله في الملف التمهيدي في مستودع جيثب: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
3. وبمجرد ان يتم إنشاء المتغيرات البيئية واصطلاحات التسمية بشكل صحيح ، افتح parameters.py و screenCrop.py في محرر الاختيار.
4. لتعديل المعلمات القابلة للتعديل بدون لمس الشفرة المصدرية ، حرر ملف parameters.py .
  ملاحظه: من الممكن أيضا تغيير المعلمات مباشره داخل راس screenCrop.py.
  1. في حاله استخدام ملف التكوين parameters.py تغيير اعداد use_configure إلى True. إذا كنت تستخدم التحرير المباشر داخل screenCrop.py ، اترك الاعداد use_configure في False.
  2. حدد موقع المعلومات التالية داخل ملف parameters.py وقم باجراء تعديلات لتلائم معلمات التصوير المطلوبة وبنيه الملف:
    1. loadFolder (خط 9): تغيير إلى محرك الاقراص الذي يتم تخزين الملفات (علي سبيل المثال ، Z:/، D://، الخ)
    2. التاريخ (السطر 7): التغيير إلى المجلد الذي يحتوي علي ملفات لجلسة التصوير. يشار إلى هذا ب "اسم المجلد التجربة" في ملف تتبع CSV (انظر التعليمات).
    3. trackingFile (السطر 11): تغيير إلى المسار إلى ملف CSV الذي يتم تخزين معلومات التجربة.
    4. z (الخط 13): تعيين عدد الطائرات z.
    5. nT (line14): تعيين عدد النقاط الزمنيه.
    6. nWells (الخط 19): تعيين عدد الآبار المستخدمة.
    7. نقطه الزيارات (السطر 20): تعيين الحد الأقصى لعدد زيارات النقاط (لكل بئر).
    8. في السطر 10 العثور علي الموقع الذي يشغله حاليا ' CV1000/' وإدخال المجلد الخارجي المستخدم في مسار الملف. لتجنب المشاكل ، استخدم الاصطلاح التالي: ' XXXXXXX/'.
    9. في السطر 12 ، ادخل مسار ملف صالح لتخزين بيانات نسبه الارتفاع للبيانات التي تم اقتصاصها.
    10. في خطوط 15 و 16 و 17 و 18 إدخال صواب/False لمعرفه ما إذا كانت الصور تمر من خلال المعالجة التالية:
      1. إدخال صواب أو خطا لتصحيح الانحراف علي خط 15.
      2. الإدخال True أو False للحصول علي الخلفية طرح علي السطر 16. يجب تحديد حجم الميزة تجريبيا لسلالات علامة مختلفه واحجام بكسل. في التكوين هنا ، تم تعريف حجم الميزة كما 41 لسلاله جرثومه طبقه و 201 لسلاله Morphogenesis. ويجب ان يتم طرح المعلومات الاساسيه بالاقتران مع تصحيح التوهين.
      3. إدخال صواب أو خطا لتصحيح التوهين علي السطر 17.
      4. إدخال True أو False للدوران الخلفي الامامي علي السطر 18.
5. وبمجرد اجراء جميع التغييرات ، يمكن ان يبدا الاقتصاص. للقيام بذلك ، قم بالتبديل إلى screenCrop.py وحدد رمز التشغيل في شريط الاداات ، في القائمة المنسدلة حدد تشغيل ك > بيثون تشغيل.
6. كما يمكن ان يستغرق الاقتصاص عده ساعات لإكمال لمجموعه بيانات كبيره (50 نقطه الزيارات 18 z الخطوات ، 3 قنوات ، 31 نقطه زمنيه) ، تتبع تقدم الاقتصاص في اطار وحده التحكم. بمجرد اكتمال عمليه الاقتصاص ، ستظهر نافذه صغيره معاينات للصور التي تم اقتصاصها قبل الحفظ. لكل صوره هناك 3 خيارات:
  1. حفظ: اضغط علي شريط المسافة لحفظ الصورة إذا تم اقتصاص الصورة بشكل صحيح مع عدم قطع المجالات ذات الاهتمام.
  2. X: اضغط X إذا كانت الصورة تظهر ان مناطق الفائدة مقطوعة ؛ سيتم حفظ الصورة بعلامة X امام الاسم لفصلها عن الصور الأخرى.
  3. حذف: اضغط D لحذف الصورة التي تم اقتصاصها إذا لم يتم اقتصاص الصورة بشكل صحيح أو إذا كان الجنين غير مرض.
    ملاحظه: سيتم حفظ الصور إلى مجلد فرعي باسم "اقتصاص" في "مجلد التحميل" (المعرفة في السطر 9 من البرنامج).

4-التصور (الشكل 4)

ملاحظه: OpenandCombine_embsV2¹⁰^،¹² هو ماكرو imagej من شانها ان بناء سهله لعرض ملف tiff من جميع الصور لسلاله محدده وشرط. مطلوب تركيب فيجي/imagej¹⁴^،¹⁵ . يعمل هذا الماكرو وفقا لهيكل الملف الخاص بنا; وسوف تحتاج إلى تعديل للعمل مع هياكل الملفات الأخرى. يمكن العثور علي دليل للهيكل الصحيح للملفات ووصف مفصل للاعتبارات الهامه في نهاية الملف GUI_Instructions_zenodo_repoV2 علي مستودع zenodo. يرجى قراءه من خلال هذه التعليمات تماما قبل التصوير لاسم بشكل صحيح وهيكل الملفات إلى واجهه أفضل مع هذا الماكرو. للرجوع اليها ، هيكل موقع الملف لدينا يبدو مثل هذا:
المعرف الفريد _W # #F # _T # #_Z # #_C # .tif # \Taterpbb\tett\strin\sdd& #
اي Z:\cropped\embd0001\glorb1\embd0001_m1_20140327t135219_w02f1_t01_zcyp1.ec

تحميل OpenandCombine_embsV2 و GUI_Instructions_zenodo_repoV2 من zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
اعداد المعلومات التالية:
-الموقع حيث يتم تخزين مجلدات الصورة (بعد الاقتصاص).
-اسم (أسماء) مجلد الصورة للشرط (الشروط) المحددة التي ستتم معالجتها (اي EMBD0002). ويشار إلى هذا باسم "الهدف" في المثال أعلاه
-معرف فريد رقمي مكون من 15 رقما خاصا بتجربة ليليه معينه — هذا المعرف هو اسم مجلد الحصول علي البيانات (اي ، 20140402T140154) والمعرف الفريد مضمن في اسم ملف tiff الفردي (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) لكل جنين في ذلك اليوم. يستخدم الماكرو هذا المعرف للتحقق من الاجنه المكتسبة في نفس التاريخ ويمكن تجميع الشروط المتكررة ، مع تواريخ منفصلة ، في ملفات ImageJ منفصلة.
افتح ImageJ ، واسحب وأسقط ملف الماكرو ، OpenandCombine_embsV2، إلى الشريط imagej ، أو افتح الماكرو بشكل مباشر.
بمجرد فتح الماكرو ، حدد موقع الأسطر 3 و 4. إدخال المعلومات التي تم جمعها في (القسم 4.2) وفقا للخطوات التالية:
1. في السطر الثالث (RNAL) ، ادخل اسم الهدف للصور التي ستتم معالجتها. إدخال كل هدف في البنية التالية نيوصفيف ("XXXXXXXX/"); تتضمن عروض الأسعار. لتشغيل شروط متعددة في نفس الوقت ، افصل بفاصله واحتفظ بكافة الأسماء المستهدفة ضمن الأقواس (اي ، Newarray ("EMBD0000/" ، "EMBD0001/" ، "EMBD0002/").
2. في السطر الرابع (التاريخ) ، ادخل المعرف الفريد الرقمي المكون من 15 رقما في عروض الأسعار ، علي سبيل المثال Newarray ("20140402t140154").
اضغط تشغيل في الجزء السفلي الأيسر من اطار الماكرو. ستظهر نافذه ، والتي ستقوم بتشغيل موجه للانتقال إلى المجلد الخارجي الذي يحتوي علي مجلدات الصور التي تم اقتصاصها (المحددة في 4.4.1).
مره واحده محدده ، سوف تظهر نافذه أخرى ، والتي سوف تسمح مواصفات المعلمات التصوير.
1. ادخل عدد القناات ، وعدد شرائح Z ، وحجم الخط للنص المستخدم في وضع العلامات علي الصور المترجمة ، واللون لكل قناه.
2. تحقق علي/قباله السيارات المتناقضة في جميع القناات.
بمجرد تحديد كافة المعلمات ، انقر فوق "موافق " في الجزء السفلي من الإطار. سيبدا الملف المركب في التجميع; وهذا سوف يستغرق عده دقائق ، لكل حاله ، لإكمال.
بمجرد الانتهاء ، قم بمراجعه الملفات التي تم تركها مفتوحة إذا رغبت في ذلك. يمكن ان تكون مغلقه بدون حفظ ، كما الماكرو بالفعل حفظ الملفات إلى مجلد تم إنشاؤه حديثا يسمي بالطريقة التالية: اسم المجلد الخارجي (المحدد في موجه القسم 4.5) + "-فيجي-معالجه-الإخراج" (اي ، Z:\ cropped-fiji-processed-output\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

النتائج

تحديا كبيرا في توصيف تاثير الاضطرابات الجزيئية علي التنمية الجنينية c. هو ان يستغرق حوالي 10 ساعة للجنين للتقدم من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله في 20 °¹⁶. والطريقة شبه العالية الانتاجيه التي يمكن فيها لمجموعات كبيره من الاجنه ان تكون في نفس الوقت مفيده للاحداث علي هذا ال...

Discussion

يصف هذا العمل مجموعه من الاداات والأساليب التي تم تطويرها لتمكين الجهود علي نطاق أوسع لتوصيف وظيفة الجينات في التنمية الجنينية في c. اليجينات. طريقتنا شبه عاليه الانتاجيه تسمح بالتصوير بالفاصل الزمني ثلاثي الابعاد للتطوير الجنيني بدقه 20 دقيقه لأجنه 80 – 100 في تجربه واحده. في حين ان هذا...

Disclosures

اي

Acknowledgements

وقد تم دعم S.D.O. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة برعاية جامعه كاليفورنيا سان دييغو البحوث المؤسسية وجائزه التطوير الوظيفي الاكاديميه (المعاهد القومية للصحة/IRACDA K12 GM068524). وقد تم دعم كو من قبل معهد لودفيغ لأبحاث السرطان ، والذي قدم لهم أيضا تمويل الأبحاث المستخدمة لدعم هذا العمل. ونحن ممتنون لأندرو Chisholm لنصيحته في المراحل المبكرة من هذا المشروع ، رونالد بيجز للمساهمات في هذا المشروع بعد مرحله تطوير الأسلوب الاولي ، وديف جينكينس واندي Shiau للحصول علي الدعم والوصول إلى اكتشاف جزيء صغير نظام التصوير عالي المحتوي الخاص بالمجموعة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832

References

Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
. Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 c

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: