C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Özet

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

Özet

C. elegans, embriyonik gelişim sırasında hücre kader özelliklerinin ve morfogenetik olayların sistematik analizinde önde gelen sistemdir. Bir sorun embriyogenez dinamik yaklaşık 13 saat bir süre içinde gelişir; bu yarım günlük zaman ölçeği, görüntülenebilen embriyo sayısını sınırlayarak deneylerin kapsamını kısıtlamıştır. Burada, orta zaman çözünürlükte 80-100 embriyoda, 14 farklı koşuldan, tek bir gecede, aynı anda 3D hızlandırılmış gelişim görüntülemesağlayan yarı-yüksek iş letme protokolü açıklıyoruz. Protokol basittir ve nokta ziyaret kapasitesine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. Bu protokolün yararı, mikrop tabakası belirtimi ve morfogenezin önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden iki özel olarak üretilmiş suşları görüntülemek için kullanılarak gösterilmiştir. Verileri analiz etmek için, tüm kanallarda, z adımlarında ve zaman noktalarında tek tek embriyoları daha geniş bir görüş alanından eken ve her embriyo için dizileri ayrı bir tiff yığınına kaydeden özel bir program oluşturulmuştür. Kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içeren program, görselleştirme veya otomatik analize hazırlık olarak bireysel embriyoları izole ederek, ön işlemeye ve tek tip yönlendirerek veri işlemeyi kolaylaştırır. Ayrıca her zaman noktasında her embriyo için maksimum yoğunlukfloresan projeksiyon ve brightfield görüntüleri görüntüleyen bir çok panelli dosya içine bireysel embriyo verileri derleyen bir ImageJ makro. Burada açıklanan protokoller ve araçlar, daha önce tanımlanmış 40 gelişimsel genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulanmıştır; bu analiz daha önce açıklamalı gelişimsel fenotipleri görselleştirmiş ve yenilerini ortaya koymuştur. Özetle, bu çalışma ayrıntıları bir kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı ile birleştiğinde bir yarı-yüksek-throughput görüntüleme yöntemi, bilgilendirici floresan belirteçleri ifade suşları ile birleştiğinde, büyük ölçüde analiz etmek için deneyler hızlandırır embriyonik gelişim.

Giriş

C. elegans embriyo mekanistik hücre biyolojisi ve hücre kader özellikleri ve morfogenetik olayların analizi için önemli bir model sistemi embriyonik gelişim^{sürüş 1,2,3,4 ,5,6,7},^8,9. Bugüne kadar, embriyodaki hem hücresel düzeydeki olayların hem de hücre kaderi özelliklerinin karakterizasyonunun büyük bir kısmı, embriyoların her 10-100'de bir kez elde edilmesiyle göreceli olarak yüksek zamansal çözünürlük tesviye si kullanılarak elde edilmiştir. floresan belirteçler. Saniyeler ile on dakika arasında olan olaylar için çok uygun olsa da, bu yaklaşım teknik olarak daha uzun işlemlerin karakterizasyonu için, saat sırasına göre gün sınırlamaolur. Embriyonik gelişim ilk bölünmeden uzama sonuna kadar yaklaşık 10 saat sürer. Bu zaman ölçeğinde, farklı koşullardan daha büyük embriyo kohortlarının aynı anda daha düşük zaman çözünürlüğü görüntülemesini (yani, 5-20 dk zaman aralıklarında edinimi) sağlayacak yarı yüksek iş hacmi yöntemleri yeni bir deney yelpazesi ni açacak; örneğin, sistematik büyük ölçekli tarama çabalarının ve moleküler tedirginliklerin sonuçlarının karşılaştırılması için yeterli sayıda embriyonun analizini sağlamak.

Burada, 80-100 embriyoda, 14 farklı koşullarda, tek bir gecede gelişimin eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlayan C. elegans embriyogenezi izlemek için yarı-yüksek iş lenme yöntemini tanımlıyoruz. Protokolün uygulanması kolaydır ve nokta ziyaret yeteneklerine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir. Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1'deözetlenmiştir. Kısacası, embriyolar ilgi floresan belirteçleri ifade gravid yetişkin ve görüntüleme için 384-well plaka kuyuları genç embriyolar (2-8 hücre evresi) transfer kesilir. Bu formatta, nispeten küçük ve iyi boyutlu huniler embriyoları dar bir alana aktararak, zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Embriyo kohort genelinde kabaca senkron gelişimi korumak için, diseksiyonlar soğutulmuş ortamda yapılır ve plaka buz üzerinde tutulur, hangi bir saat süren diseksiyon süresi sırasında önemli gelişmeyi önler. Plaka mikroskoba aktarılır ve embriyolar 2 μm adımlarda tam z aralığı toplamak için, 60x yağ daldırma 1.35 NA lens kullanılarak, 20 dakika zaman aralıkları, bir gecede sıcaklık kontrollü bir odada filme alınır. Her biri 1-5 embriyo içeren elli alan, tek bir gecede görüntülenir. İstenilen deneye bağlı olarak, görüntülenmiş alanların sayısını orantılı olarak azaltarak zaman çözünürlüğü (örneğin, 5-10 dk aralıklarla görüntüleme) artırılabilir.

Bu protokolle, tek bir gecede bile önemli miktarda veri (50 alana yayılmış 80-100 embriyo) üretir ve daha büyük deneyler veri analizi açısından hızla yönetilemez hale gelebilir. Bu verilerin işlenmesini, görselleştirilmesini ve çözümlenmesini kolaylaştırmak için, embriyoları kırpmak ve yönlendirmek ve ön işleme adımlarını (isteğe bağlı) gerçekleştirmek için bir program ve görüntülemeyi kolaylaştırmak için verileri derleyen bir ImageJ makrosu oluşturulmuştür. Bu programlar, yalnızca tek bir parlak alan düzlemi gerektiren görüntüleme yönteminden bağımsız olduklarından, geleneksel yaklaşımlar kullanılarak toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir. İlk program birden fazla embriyo içeren bir 4D alan alır (GUI seçeneği veya kaynak kodu embryoCrop.py) veya birden fazla embriyo içeren birden fazla 4D alanları (screenCrop.py), sıkıca embriyolar bitkileri ve ön-posterior yapılandırma onları yönlendirir. Bu programlar ayrıca kullanıcılara arka plan çıkarma, sürüklenme düzeltme ve zayıflatma düzeltmesi yapma seçeneği de verir. Elde edilen dosyalar, otomatik görüntü analizi için değiştirilebilir her embriyo için düzgün bir şekilde önceden işlenmiş, sıkıca kırpılmış tiff yığınlarıdır. Her durum için tüm embriyoları görüntülemeyi kolaylaştırmak için, belirli bir durumdan tüm embriyoları tek bir tiff yığınına ve diziparlak görüntülere ve maksimum yoğunluklu projeksiyon rengine monte eden bir ImageJ makrosu (OpenandCombine_embsV2.ijm) yazıldı. RGB) her embriyo için yan yana bindirmeler. Yöntemler, mikrop tabakasının önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden özel olarak üretilmiş bir çift suşta daha önce tanımlanmış 40 gelişimgenin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulandı. özellikleri ve morfogenez^10,11. Birlikte, yarı-yüksek iş letme embriyo görüntüleme protokolü ve görüntü işleme araçları daha yüksek örnek numarası deneyleri ve gelişimsel süreçleri anlamaya yönelik büyük ölçekli tarama çabaları sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu suşlar da embriyogenez üzerinde moleküler pertürbations etkilerini incelemek için etkili bir araç sağlayacaktır.

Protokol

1. C. elegans Embriyolarının Yarı-yüksek-yüksek-throughput Görüntüleme için hazırlanması

NOT: Protokolün bu bölümünün amacı, uygun marker suşlarından(Şekil 2)parçalanmış yarı senkronize (2 ila 8 hücreli evre) C. elegans embriyolarından oluşan bir popülasyonu görüntüleme için cam dipli 384 kuyulu bir plakaya yüklemektir. Diğer plaka biçimleri de işe yarayabilir, ancak küçük kuyu boyutu embriyoların yayılmasını nispeten küçük bir alana kısıtladığı için 384 kuyu plakası tercih edilir, bu da zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Kabaca embriyosenkronize bir alanda embriyoların her biri için gelişim tam ders yakalanan sağlar.

1. Buz gibi soğuk M9 ortamda çözünmüş tetramisole hidroklorür (TMHC) anestezik 5-10 mL çözeltisi (0.45 M Na₂HPO₄7H₂O, 0.11 M KH₂PO₄, 0.04 M NaCl, 0.09 M NH₄Cl) diseksiyon ve görüntüleme. Bu ortam, hareketli yumurtadan çıkan larvaların daha erken gelişim evrelerinde embriyoların görüntülenmelerini engellememesini sağlamak için bir anestezi içerir.
   NOT: Standart agarose pad montaj yöntemleri kullanılarak elde edilen verileri analiz etmek için kırpma ve görselleştirme araçlarını kullanıyorsanız, aşağıdaki bölüm 3'e geçin.
2. Aliquot 70 μL her durum için bir kuyu ile cam alt 384-iyi plaka bireysel kuyular içine hazırlanan çözüm; kenar efektlerini önlemek için plakanın dış iki satır kaçının.
   NOT: Yapışkan PCR plaka folyosu kullanarak kuyuları çevreleyen kuyuları maskelemek yararlıdır (Şekil 1D'dekiörneğe bakın) bu, gelecekteki deneyler için bitişik kuyuları korur ve diseksiyon mikroskobu altında uygun kuyuların bulunmasını kolaylaştırır. Çözelti bir kez aliquoted sonra, diseksiyon boyunca buz üzerinde plaka ve kalan çözelti tutun.
3. Depresyon slayt (gravid hermafroditler kesilir) kuyulara embriyo transferi için ağız pipetler oluşturun. Kılcal boruları (25°L kalibre edilmiş pipetleri) bir alev üzerinde çekin ve ince konik bir uç oluşturmak için kırın(Şekil 1D). Çapraz kontaminasyonu önlemek için her koşulda bir pipet gereklidir; kullandıktan sonra pipet atın.
4. Her durum için bir depresyon slayt üzerine aliquoted buz soğuk TMHC çözeltisi 150 μL içine bir diseksiyon kapsamı altında ~ 10 gravid yetişkin aktarmak için ince cımbız kullanın. Cımbız ve neşter kullanarak, embriyoları serbest bırakmak için solucanları inceleyin.
5. Pipetler ile birlikte aspiratör ek içine çekilmiş bir kılcal pipet yükve ağız pipet hazırlanan plaka bireysel bir kuyuiçine 2 ila 8 hücreli sahne embriyoların tüm aktarmak için(Şekil 1D). Geç evre embriyolar ve diseksiyon enkaz transfer kaçının. Bir diseksiyon kapsamı altında inceleyin ve embriyo ların agregaları mevcutsa, ağız boruyukarı ve aşağı veya dağıtmak için pipet ucu ile embriyoların kümeleri dokunun.
   NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için, diseksiyon ekipmanlarını temizleyin ve koşullar arasında hareket ederken taze bir ağız pipeti kullanın. Diseksiyonlar arasında buz üzerinde plaka saklayın.
6. Her koşuldan solucanlar kesildikten ve embriyolar uygun kuyuya yerleştirildikten sonra, 384 kuyulu plakayı 1 dk 600 x g'de döndürün.
7. Herhangi bir kalıntıyı çıkarmak için plakanın altını etanollü bir mendille silin ve plakayı sıcaklık kontrollü bir ortamda plaka tutucuyla donatılmış bir konfokal mikroskoba yerleştirin.
   NOT: İzleyen adımlar, laboratuvar kurulumlarını kullanarak bu yöntemi ayrıntıya girer; lütfen satın alma koşullarını deneysel ihtiyaçlara ve ekipmanlara uyacak şekilde değiştirin. Burada, mikrolensle geliştirilmiş çift Nipkow iplik diski, 512 x 512 EM-CCD kamera, yüksek hassasiyetli otomatik XY-Stage (0,1 μm olarak belirlenmiş çözünürlük) ve motorlu z ekseni kontrolü (0,1 μm olarak belirlenmiş çözünürlük) ile donatılmış bir konfokal tarayıcı kutusu kullanılmaktadır. Bu sistem, gece görüntüleme sırasında 21 ile 23 °C arasında mikroskop sıcaklığını koruyan 16 °C'lik bir odada tutulur.
8. Uygun embriyolara sahip alanları belirlemek için, 10x 0.4 NA nesnel ve uygun görüntüleme yazılımı kullanarak her kuyunun ön taramasını yapın. En uygun alanlar, diğer embriyolarla aynı odak düzleminde olan birden fazla erken evre embriyo içerecek ve ideal olarak komşu embriyolar arasında en az temasa sahip olacaktır. Uygun bölgelerin konumlarını işaretleyin.
9. Görüntüleme alanlarını seçmek için 60x hedefine geçin ve her noktada odak düzlemini uygun şekilde embriyoları bölüme göre ayarlayın. 14 kuyuda toplam 50 alan için her kuyuda 1-4 alan görüntülenir ve her alan bir ile beş embriyo içerebilir. Genel olarak, 4-15 embriyolar yüksek çözünürlüklü görüntüleme için her koşuldan seçilir.
   NOT: Bu adımda önemli bir değişken yeterli yağ kullanımıdır; tüm kuyuların yüzeyine yağ yaymak ve daha sonra alanların seçimi önce hedefe yağ ek bir damla uygulamak için her kuyuda ziyaret noktaları, objektif yağ yerleştirin.
10. 60x 1.35 NA hedefi kullanarak seçilen alanları 2 μm aralıklarla 10 saat boyunca her 20 dakikada 18 z kesitelde etmek için görüntüleyin. Germ tabakası ve morfogenez muhabiri suşları kullanılarak görüntüleme koşulları aşağıdaki gibidir: brightfield, 90% güç, 25 ms, 20% kazanç; 488 nm, %100 güç, 200 ms, %60 kazanç; 568 nm, %45 güç, 150 ms, %60 kazanç.
11. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, embriyonik öldürücülüğü düşük büyütme (10x 0.4 NA hedefi) tüm iyi brightfield taraması ~ 20-24 saat geceleme başladıktan sonra gerçekleştirerek değerlendirmek.

2. Embriyonik Öldürücülük Puanlama

1. Post-run 10x taranmış alanları kullanarak, her kuyu için yumurtadan solucanlar ve yumurtadan çıkmamış embriyolar sayarak embriyonik öldürücülük ve larva kusurları değerlendirmek.
2. Yumurtadan çıkmamış embriyoları embriyonik öldürücü olarak puanla. Genç parçalanmış embriyolar bazen yumurta kabuğu oluşumunu tamamlayamadığından (mayoz II henüz tamamlanmamışsa) ve geçirgenlik kusurları ilk iki sinde ozmotik komplikasyonlara yol açabileceğinden, tutuklanan bir ila dört hücreli embriyoları öldürücü lük sayısından hariç tutabilirsiniz. Bölüm.
3. Puan kısmen yumurtadan veya tamamen yumurtadan solucanlar vücut morfolojisi veya davranışsal kusurları ile, dumpy veya felç gibi, 'anormal larva' olarak.

3. Otomatik Kırpma (Şekil 3A)

NOT: Yazılım iki yerde yer almaktadır: (1) Zenodo herhangi bir programlama uzmanlığı gerektirmeyen yazılım¹² kullanıcı dostu bir sürümünü evler. (2) Github, Python ile yeterlilik gerektiren embryoCropUI.py ve screenCrop.py^{yazılımımız 13'ün}kaynak kodunu içerir. Programın her iki versiyonunu indirmek ve işletmek için ayrıntılı talimatlara aşağıda niçin yer bulabilirsiniz.

1. embryoCropUI çalıştırılabilir sürümü kullanarak otomatik kırpma (kullanıcı dostu sürümü)
   1. embriyoCropUI programı kullanmak için, ilk Zenodo programı indirmek (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Programın MacOS veya Windows formatında sürümünü indirin (MacOS sürümünün MacOS X10.11 veya üzeri gerektirdiğini unutmayın).
      2. Test etmek ve embriyoCropUI programını kullanmak için adım adım talimat veren talimatlar dosyasını(GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx)indirin.
      3. Programın platformda düzgün çalışıp çalışmamasını test_files.zip'i indirin (talimatlara bakın).
   2. Bir kez indirilen, unzip ve embriyoCropUI yürütülebilir bulmak için gidin (...\embriyoCropUI\_WINDOWS\embryoCropUI\embryoCropUI.exe)veya (...\embriyoCropUI\_MacOS\embryoCropUI\embryoCropUI\embryoCropUI.exe). Çift tıklayın başlatmak için (veya 'ile açık' terminalseçti) ve embriyoCropUI yürütülebilir çalıştırın.
   3. GUI çalıştırılabilir bir seferde bir 4B görüş alanı ekinler. Sol üst köşede, kırpma (multi-tiff) için belirli bir alanı yüklemek için açık düğmesini seçin. Birden çok boyutu (örneğin, z, zaman, kanal) içeren bir tiff serisini kırpmak, yalnızca klasör içindeki serideki ilk görüntüyü (klasör başına bir tiff serisi) yükler.
   4. Görüntüler yüklendikten sonra aşağıdaki bilgileri belirtin: z- dilim sayısı, (Z), zaman noktası sayısı (T), kanal sayısı (C), DIC veya brightfield'a karşılık gelen kanal (birinci=1, ikinci=2, vb.).
   5. Görüntülerde çalıştırmak için ek işleme seçin. Program Drift Düzeltme, Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltme söner.
   6. GUI isteminde işleme çabalarını yönlendirmek için Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltmesi parametrelerini belirtin. Arka Plan Çıkarma için, anlamlı sinyalboyutunu yansıtacak en büyük özellik boyutunu tanımlayın; bu özellik boyutu arka plan olarak kabul edilmemeli ve tek bir sayı değeri olmalıdır. Zayıflama Düzeltmesi için 0-1'den bir değer girişi. Zayıflatma Düzeltme değeri, görüntülenen nesnenin en uzak derinliğinde kalan orijinal yoğunluğun yüzdesini yansıtır.
      NOT: Arka Plan Çıkarma ve Zayıflama Düzeltmesi birlikte çalıştırılmalıdır.
   7. Görüntü toplama sırasını (yani kanal-z-time (czt) veya z-kanal zamanı (zct)) belirtin.
   8. Kullanılan kameraya dayalı görüntüler için piksel başına mikronları belirtin.
      NOT: Piksel boyutu düzgün tanımlanmamışsa, kötü görüntü kırpma oluşur.
   9. Sol alt köşede Çalıştır'ı seçin. Kırpılmamış klasörle aynı yolda "kırpma" etiketli yeni bir alt klasör oluşturulur; kırpılmış sürümler bu konumda kaydedilir. Dosya boyutuna bağlı olarak, kırpma saniye ler dakika içinde tamamlanmalıdır.
2. screenCrop.py kullanarak otomatik kırpma (yukarıda açıklanan embryoCrop GUI için toplu sürüm alternatif;Python anlayışlı kullanıcılar sadece)^10,13
   1. screenCrop.py kullanmak için, python yazılım sürümü daha büyük veri kümelerini toplu biçimde kırpmak, klonlamak veya kaynak kodu Github'dan indirmek için (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Uygun bir sanal ortamı yapılandırma yönergelerini okuyun ve açıklanan dosya adlandırma sistemini izleyin; her ikisi de Github deposundaki README dosyasında ayrıntılı olarak açıklanır: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Çevresel değişkenler ve adlandırma kuralları düzgün bir şekilde oluşturulduktan sonra, açık parameters.py ve tercih edilen bir editörde screenCrop.py.
   4. Kaynak koduna dokunmadan ayarlanabilir parametreleri değiştirmek için parameters.py dosyasını düzeltin.
      NOT: screenCrop.py üstbilgi içindeki parametreleri doğrudan değiştirmek de mümkündür.
      1. yapılandırma parameters.py kullanıyorsanız, use_configure ayarını True olarak değiştirin. screenCrop.py içinde doğrudan düzenleme kullanıyorsanız, use_configure ayarını False'da bırakın.
      2. parameters.py dosyasında aşağıdaki bilgileri bulun ve istenilen görüntüleme parametrelerine ve dosya yapısına uygun değişiklikler yapın:
         1. loadFolder (satır 9): Dosyaların depolandığı sürücüye göre değiştirin (örn. Z:/, D://, vb.)
         2. tarih (satır 7): Görüntüleme oturumu için dosya içeren klasöre değiştirin. Buna CSV izleme dosyasında 'Deneme Klasör Adı' adı verilir (yönergelere bakın).
         3. trackingFile (satır 11): Deneme bilgilerinin depolandığı CSV dosyasına giden yolu değiştirin.
         4. z (satır 13): z düzlemlerinin sayısı olarak ayarlayın.
         5. nT (satır14): Zaman noktaları nın sayısı olarak ayarlayın.
         6. nWells (satır 19): Kullanılan kuyu sayısı olarak ayarlayın.
         7. pointVisits (satır 20): En fazla nokta ziyaret sayısı olarak ayarlayın (kuyu başına).
         8. Satır 10'da şu anda 'CV1000/' tarafından işgal edilen konumu bulun ve dosya yolunda kullanılan dış klasörü girin. Sorunları önlemek için aşağıdaki kuralı kullanın: 'XXXXXXX/'.
         9. Satır 12'de kırpılmış veriler için en boy oranı verilerini depolamak için geçerli bir dosya yolu girin.
         10. 15, 16, 17 ve 18 satırında, görüntülerin aşağıdaki işleme girip girmediğine göre True/False girişi:
             1. Satır 15'te sürüklenme düzeltmesi için Doğru veya Yanlış girişi.
             2. Satır 16'da arka plan çıkarma için Doğru veya Yanlış girişi. Özellik boyutu, farklı işaretleyici suşları ve piksel boyutları için ampirik olarak belirlenmelidir. Buradaki yapılandırmada özellik boyutu Germ-Layer suşu için 41 ve Morfogenez suşu için 201 olarak tanımlanmıştır. Arka plan çıkarma zayıflama düzeltmesi ile birlikte yapılmalıdır.
             3. Satır 17'de zayıflama düzeltmesi için Doğru veya Yanlış girişi.
             4. Satır 18'de ön arka döndürme için True veya False girişi.
   5. Tüm değişiklikler yapıldıktan sonra kırpma başlayabilir. Bunu yapmak için screenCrop.py'ye geçin ve araç çubuğundaki oynat simgesini seçin, açılan menüde Çalıştır > Python Çalıştır'ıseçin.
   6. Kırpma büyük bir veri kümesi (50 nokta ziyaret 18 z adımları, 3 kanal, 31 zaman noktaları) tamamlamak için birkaç saat sürebilir gibi, konsol penceresinde kırpma ilerleme izleyin. Kırpma tamamlandıktan sonra, küçük bir pencere kaydetmeden önce kırpılan görüntülerin önizlemelerini gösterir. Her görüntü için 3 seçenek vardır:
      1. Kaydet: Görüntü, ilgi alanı kesilmeden düzgün kırpılırsa görüntüyü kaydetmek için Space Bar'a basın.
      2. X: Görüntünün ilgi alanları kesilmiş gibi görünüyorsa X tuşuna basın; görüntü, diğer resimlerden ayırmak için ismin önündeki X ile kaydedilir.
      3. Delete: Görüntü düzgün kırpılmış değilse veya embriyo tatmin edici değilse kırpılmış görüntüyü silmek için D tuşuna basın.
         NOT: Görüntüler Yük Klasöründe "Kırpılmış" adlı bir alt klasöre kaydedilir (programın 9 satırında tanımlanır).

4. Görselleştirme (Şekil 4)

NOT: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 belirli bir gerginlik ve durum için tüm görüntülerden tiff dosyasını görüntülemek kolay bir imageJ makrodur. FIJI/ImageJ^14,15 kurulumu gereklidir. Bu makro dosya yapımıza göre çalışır; diğer dosya yapıları ile çalışmak için değiştirilmesi gerekir. Zenodo deposundaki GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx dosyasının sonunda uygun dosya yapısı ve önemli hususların ayrıntılı açıklaması için bir kılavuzbulunabilir. Lütfen bu makro ile en iyi arayüz için düzgün isim ve yapı dosyaları görüntüleme önce tamamen bu yönergeleri okuyun. Başvuru için, dosya konum yapımız şuna benzer:
Z:\kırpılmış\Hedef\Strain\Emb#\Target_Emb#_15 Haneli Benzersiz Tanımlayıcı _W##F#_T##_Z##_C#.tif
yani Z:\kırpılmış\EMBD0001\GLS\Emb1\EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Karşıdan yükleme OpenandCombine_embsV2 ve GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx from Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Aşağıdaki bilgileri hazırlayın:
   -Resim klasörlerinin depolandığı konum (kırpmadan sonra).
   -Belirli bir koşul(lar) için görüntü klasörü adı(lar) işlenecek (yani, EMBD0002). Bu, yukarıdaki örnekte "Hedef" olarak adlandırılır
   -Belirli bir gecede denemeye özgü 15 basamaklı alfa-sayısal benzersiz tanımlayıcı-bu tanımlayıcı veri toplama klasöradıdır (yani, 20140402T140154) ve benzersiz tanımlayıcı tek tek tiff dosya adına gömülüdür (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) o gün resimde her embriyo için. Makro, aynı tarihte edinilen embriyoları denetlemek için bu tanımlayıcıyı kullanır ve ayrı tarihlerde tekrarlanan koşulları ayrı ImageJ dosyalarında biraraya getirebilir.
3. ImageJ'i açın ve makro dosyasını, OpenandCombine_embsV2.ijm'isürükle ve bırak, ImageJ çubuğuna veya makroyu doğrudan açın.
4. Makro açıldıktan sonra 3 ve 4. (Bölüm 4.2) içinde toplanan bilgileri aşağıdaki adımlara göre girdi:
   1. Satır 3'te (RNAL), işlenecek görüntülerin hedef adını girin. Aşağıdaki yapı newArray her hedef girin("XXXXXXXX/"); tırnak ekle. Aynı anda birden fazla koşulu çalıştırmak için, virgülle ayırmak ve tüm hedef adları parantez içinde tutmak için ("EMBD00000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Satır 4'te (tarih), 15 basamaklı alfa-sayısal benzersiz tanımlayıcıyı tırnak içinde girin, örneğin newArray("20140402T140154").
5. Makro penceresinin sol alt kısmında çalıştır'a basın. Kırpılmış resim klasörlerini içeren (4.4.1'de belirtilen) dış klasöre gitmek için bir istem başlatacak bir pencere görüntülenir.
6. Seçildikten sonra, görüntüleme parametrelerinin belirtimine izin verecek başka bir pencere görüntülenir.
   1. Kanal sayısını, Z dilimlerinin sayısını, derlenen görüntüleri etiketlemede kullanılan metnin yazı tipi boyutunu ve her bir kanalın rengini girin.
   2. Tüm kanallarda otomatik zıtlığı kontrol edin/kapatın.
7. Tüm parametreler belirtildikten sonra, pencerenin altındaki Tamam'ı tıklatın. Bileşik dosya biraraya başlayacak; bu, durum başına, tamamlamak için birkaç dakika sürer.
8. Tamamlandıktan sonra, istenirse açık bırakılan dosyaları gözden geçirin. Makro zaten aşağıdaki şekilde adlandırılmış yeni oluşturulan bir klasöre dosyaları kaydetmiş gibi, kaydetmeden kapatılabilir: dış klasör adı (bölüm 4.5 isteminde belirtilen) + "-fiji-işlenmiş-çıktı" (yani, Z:\ kırpılmış-fiji-işlenmiş-çıktı\EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Sonuçlar

Moleküler tedirginliklerin C. elegans embriyonik gelişimi üzerindeki etkisini karakterize etmede önemli bir zorluk, embriyoların ilk bölünmeden 20°^16'dauzama nın sonuna kadar ilerlemesi için yaklaşık 10 saat almasıdır. Büyük embriyo kohortlarının aynı anda görüntülenebileceği yarı yüksek iş yapma yöntemi, bu zaman ölçeğindeki olaylar için yararlıdır, çünkü her koşul için yeterli topluluk boyutuna paralel olarak birden fazla koşulun görüntülenmesin...

Tartışmalar

Bu çalışma, C. elegansembriyonik gelişim genlerin işlevini profilini daha büyük ölçekli çabaları sağlamak için geliştirilen araçlar ve yöntemler bir paketi açıklanır. Yarı yüksek iş yöntemimiz, tek bir deneyde 80-100 embriyo için 20 dk çözünürlükte embriyonik gelişimin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Bu protokol istenilen herhangi bir belirteç suş (lar) ile kullanılmak üzere adapte edilebilir iken, bu çalışma embriyogenez sırasında olayları izlemek...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832