Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development

Résumé

Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l'imagerie simultanée en time-lapse 3D de l'embryogenèse dans 80-100 embryons d'élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d'image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l'analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l'embryogenèse.

Résumé

C. elegans est le premier système d'analyse systématique de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques au cours du développement embryonnaire. Un défi est que l'embryogenèse se déroule dynamiquement sur une période d'environ 13 h; cette demi-journée a limité la portée des expériences en limitant le nombre d'embryons qui peuvent être photographiés. Ici, nous décrivons un protocole semi-haut-débit qui permet l'imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons à la résolution de temps modérée, de jusqu'à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple et peut être mis en œuvre par n'importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec une capacité de visite ponctuelle. L'utilité de ce protocole est démontrée en l'utilisant pour l'image de deux souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la spécification germinale et de la morphogénèse. Pour analyser les données, un programme personnalisé qui récolte des embryons individuels à partir d'un champ de vision plus large dans tous les canaux, z-étapes, et les points de temps et enregistre les séquences pour chaque embryon dans une pile tiff séparée a été construit. Le programme, qui comprend une interface utilisateur graphique conviviale (GUI), simplifie le traitement des données en isolant, pré-traitant et en orientant uniformément les embryons individuels en vue de la visualisation ou de l'analyse automatisée. Une macro ImageJ qui compile des données d'embryons individuelles dans un fichier multipanel qui affiche la projection de fluorescence d'intensité maximale et les images des champs lumineux pour chaque embryon à chaque moment. Les protocoles et les outils décrits ci-dessus ont été validés en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits ; cette analyse a visualisé les phénotypes développementaux précédemment annotés et en a révélé de nouveaux. En résumé, ce travail détaille une méthode d'imagerie semi-haut débit couplée à un programme de recadrage et à un outil de visualisation ImageJ qui, combiné à des souches exprimant des marqueurs fluorescents informatifs, accélère considérablement les expériences d'analyse développement embryonnaire.

Introduction

L'embryon de C. elegans est un système modèle important pour la biologie cellulaire mécaniste et l'analyse de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques conduisant au développement embryonnaire^1,2,3^{,4 ,5,6,7,8,9}. À ce jour, une grande partie de la caractérisation des événements au niveau cellulaire et de la spécification du destin cellulaire dans l'embryon a été réalisée à l'aide d'expériences d'imagerie ponctuelles à résolution temporelle relativement élevée (c.-à-d. acquisition tous les 10 à 100 s) d'embryons exprimant marqueurs fluorescents. Bien que bien adaptée aux événements de l'ordre de secondes à des dizaines de minutes, cette approche devient techniquement limitative pour la caractérisation de processus plus longs, de l'ordre des heures à des jours. Le développement embryonnaire du premier clivage à la fin de l'allongement prend environ 10 h. À cette échelle temporelle, des méthodes semi-à-haut débit qui permettraient l'imagerie simultanée à faible résolution temporelle (c.-à-d. l'acquisition à des intervalles de temps de 5 à 20 min) de cohortes plus importantes d'embryons, provenant de conditions différentes, ouvriraient une nouvelle gamme d'expériences; par exemple, permettre des efforts systématiques de dépistage à grande échelle et l'analyse d'un nombre suffisant d'embryons pour comparer les conséquences des perturbations moléculaires.

Ici, nous décrivons une méthode semi-haut-débit pour surveiller l'embryogenèse de C. elegans qui permet l'imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons, de jusqu'à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple à mettre en œuvre et peut être réalisé par n'importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec des capacités de visite ponctuelle. Les principales étapes de ce protocole sont décrites à la figure 1. En bref, les embryons sont disséqués à partir d'adultes gravidés exprimant des marqueurs fluorescents d'intérêt et de transférer de jeunes embryons (stade de 2 à 8 cellules) à des puits d'une plaque de 384 puits pour l'imagerie. Dans ce format, la taille relativement petite des embryons de puits entonne les embryons dans une zone étroite, ce qui facilite l'identification des champs contenant plusieurs embryons pour l'imagerie en accéléré. Pour maintenir un développement à peu près synchrone dans la cohorte d'embryons, des dissections sont effectuées dans des médias réfrigérés et la plaque est maintenue sur la glace, ce qui empêche le développement significatif pendant la fenêtre de temps de dissection d'une heure. La plaque est transférée au microscope et les embryons sont filmés dans une pièce à température contrôlée pendant la nuit, à intervalles de 20 min, à l'aide d'une lentille d'immersion d'huile de 60x 1,35 NA, pour recueillir toute la plage de Z en 2 m d'étapes. Cinquante champs, contenant chacun entre 1 et 5 embryons, sont représentés en une seule nuit. Selon l'expérience souhaitée, la résolution temporelle pourrait être augmentée (par exemple, l'imagerie à intervalles de 5 à 10 minutes) en diminuant proportionnellement le nombre de champs d'image.

Avec ce protocole, même une seule course de nuit génère une quantité importante de données (80 à 100 embryons répartis sur 50 champs) et des expériences de plus grande envergure peuvent rapidement devenir ingérables en ce qui concerne l'analyse des données. Pour faciliter le traitement, la visualisation et la rationalisation de l'analyse de ces données, un programme a été conçu pour recadrer et orienter les embryons et effectuer des étapes de prétraitement (facultatif), et une macro ImageJ qui compile les données pour simplifier la visualisation. Ces programmes peuvent être utilisés pour traiter les images recueillies à l'aide d'approches conventionnelles, car elles sont indépendantes de la méthode d'imagerie, ne nécessitant qu'un seul plan brightfield. Le premier programme prend en charge un champ 4D contenant plusieurs embryons (option GUI ou code source embryoCrop.py) ou plusieurs champs 4D contenant plusieurs embryons (screenCrop.py), cultures serrées embryons et les oriente dans une configuration antérieure-postérieure. Ces programmes donnent également aux utilisateurs la possibilité d'effectuer la soustraction de fond, la correction de dérive et la correction d'atténuation. Les fichiers qui en résultent sont des piles de tiff uniformément prétraitées et étroitement recadrées pour chaque embryon qui sont modifiables à l'analyse automatisée de l'image. Pour simplifier la vue de tous les embryons pour chaque condition, une macro ImageJ (OpenandCombine-embsV2.ijm) a été écrite, qui assemble tous les embryons d'une condition donnée dans une seule pile tiff et tableaux images brightfield et la couleur de projection d'intensité maximale ( RGB) recons, côte à côte, pour chaque embryon. Les méthodes ont été validées en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l'élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits dans une paire de souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la couche germinale spécification et morphogenèse^10,11. Ensemble, le protocole d'imagerie embryonnaire à semi-haut débit et les outils de traitement de l'image permettront d'expérimenter un nombre d'échantillons plus élevé et d'intensifier les efforts de dépistage à grande échelle visant à comprendre les processus de développement. En outre, ces souches fourniront également un moyen efficace d'examiner les effets des perturbations moléculaires sur l'embryogenèse.

Protocole

1. Préparation des embryons de C. elegans pour l'imagerie semi-haute débit

REMARQUE: L'objectif de cette partie du protocole est de charger une population d'embryons de C. elegans semi-synchronisés (stade de 2 à 8 cellules), disséqués à partir de souches de marqueurs appropriées (figure 2), dans une plaque de 384 puits à fond de verre pour l'imagerie. D'autres formats de plaques pourraient également fonctionner, mais les 384 plaques de puits sont préférées parce que la petite taille du puits limite la propagation des embryons à une zone relativement petite, ce qui facilite l'identification des champs contenant plusieurs embryons pour l'imagerie en accéléré. La synchronisation grossière des embryons garantit que le cours complet du développement est capturé pour chacun des embryons dans un champ.

1. Préparer une solution de 5 à 10 ml de 0,1 mg/mL d'hydrochlorure de téramisole (TMHC) dissous dans un milieu M9 froid (0,45 M Na₂HPO₄à 7 H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) à utiliser pendant dissection et imagerie. Ce média comprend un anesthésique pour s'assurer que les larves écloses en mouvement ne perturbent pas l'imagerie des embryons à un stade de développement précoce.
   REMARQUE: Si vous utilisez les outils de culture et de visualisation pour analyser les données acquises à l'aide de méthodes standard de montage de coussinets d'agarose, passez à la section 3 ci-dessous.
2. Aliquot 70 l de la solution préparée dans les puits individuels d'une plaque de 384 puits en verre avec un puits pour chaque condition ; éviter les deux rangées extérieures de la plaque pour prévenir les effets de bord.
   REMARQUE: Il est utile de masquer les puits environnants à l'aide d'une feuille de plaque PCR adhésive (voir l'exemple de la figure 1D)qui préserve les puits adjacents pour de futures expériences et facilite la localisation des puits appropriés sous le microscope à dissection. Une fois que la solution est aliquoted, garder la plaque et la solution restante sur la glace tout au long de la dissection.
3. Générer des pipets buccaux pour le transfert d'embryons de la dépression (où les hermaphrodites gravid sont disséqués) aux puits. Tirer les pipets capillaires (25 pipets calibrés ll) au-dessus d'une flamme et casser pour générer une extrémité effilée fine(figure 1D). Un tuyau d'epiphe est nécessaire par condition pour prévenir la contamination croisée; jeter la tuyauterie après utilisation.
4. Utilisez des pinces fines pour transférer les adultes gravid s'agitent de 10 degrés dans une portée de dissection dans 150 L de la solution TMHC glacée indiquée sur une glissière de dépression pour chaque condition. À l'aide de la pince à épiler et d'un scalpel, disséquer les vers pour libérer les embryons.
5. Chargez un tuyau tapillaire tiré dans l'attachement de l'aspirateur inclus avec les pipets, et la tuyauterie buccale pour transférer tous les embryons de 2 à 8 cellules dans un puits individuel de la plaque préparée (Figure 1D). Évitez de transférer des embryons à un stade avancé et de dissectionr les débris. Examiner sous une portée de dissection et si des agrégats d'embryons sont présents, tuyauter la bouche vers le haut et vers le bas ou taper des amas d'embryons avec la pointe de pipet pour se disperser.
   REMARQUE: Pour éviter la contamination croisée, nettoyer l'équipement de dissection et utiliser un tuyau d'oreille frais tout en se déplaçant entre les conditions. Conserver la plaque sur la glace entre les dissections.
6. Une fois que les vers de toutes les conditions ont été disséqués et les embryons placés dans leur puits approprié, faites tourner la plaque de 384 puits pendant 1 min à 600 x g pour régler les embryons.
7. Essuyez le fond de la plaque à l'œil d'une lingette imbibée d'éthanol pour enlever tout résidu et placez la plaque sur un microscope confocal équipé d'un porte-plaque dans un environnement à température contrôlée.
   REMARQUE: Les étapes qui suivent détaillent cette méthode à l'aide de la configuration de laboratoire; veuillez modifier les conditions d'acquisition en fonction des besoins et de l'équipement expérimentaux. Ici, une boîte de scanner confocale équipée d'un double disque pivotant Nipkow amélioré par microlens, d'une caméra 512 x 512 EM-CCD, d'une auto-XY-Stage de haute précision (résolution désignée de 0,1 m) et d'un contrôle motorisé de l'axe z (résolution désignée 0,1 m) est utilisée. Ce système est conservé dans une pièce de 16 oC, qui maintient la température du microscope entre 21 et 23 oC pendant la nuit d'imagerie.
8. Pour identifier les champs avec des embryons appropriés, effectuez un pré-scan de chaque puits à l'aide d'un logiciel d'imagerie objectif 10x 0.4 NA et approprié. Les champs les plus optimaux contiendront plus d'un embryon à un stade précoce qui se trouve dans le même plan focal que les autres embryons et qui, idéalement, aura un contact minimal entre les embryons adjacents. Marquer les positions des régions appropriées.
9. Pour sélectionner les champs d'imagerie, passez à l'objectif 60x et ajustez le plan focal à chaque visite ponctuelle pour sectionner convenablement les embryons. 1/4 champs par puits sont représentés, pour un total de 50 champs répartis dans 14 puits, et chaque champ peut contenir entre un et cinq embryons. Dans l'ensemble, 4 à 15 embryons sont sélectionnés dans chaque condition pour une imagerie à haute résolution.
   REMARQUE: Une variable clé à cette étape est l'utilisation d'un pétrole suffisant; placer le pétrole sur l'objectif, visiter des points dans chaque puits pour répartir le pétrole autour de la surface de tous les puits, puis appliquer une goutte supplémentaire de pétrole à l'objectif avant la sélection des champs.
10. Imagez les champs sélectionnés à l'aide d'un objectif de 60x 1,35 NA pour acquérir 18 sections z à 2 m d'intervalle toutes les 20 min pendant 10 h. Les conditions d'imagerie utilisant les souches de reporter de couche germinale et de morphogenèse sont les suivantes : brightfield, 90% puissance, 25 ms, 20% gain ; 488 nm, 100% de puissance, 200 ms, 60% de gain; 568 nm, 45% de puissance, 150 ms, 60% de gain.
11. Une fois l'imagerie terminée, évaluez la létalité embryonnaire en effectuant un faible grossissement (objectif de 10x 0,4 NA) de balayage complet et lumineux de 20 à 24 h après le début de l'imagerie de nuit.

2. Notation de la létalité embryonnaire

1. À l'aide des champs numérisés 10x post-run, évaluez la létalité embryonnaire et les défauts larvaires en comptant les vers éclos et les embryons non éclos pour chaque puits.
2. Marquez les embryons non éclos comme embryonnaires mortels. Exclure les embryons d'une à quatre cellules arrêtés du nombre de létalités, puisque les jeunes embryons disséqués ne parviennent parfois pas à terminer la formation de coquilles d'œufs (si la méiose II n'est pas encore terminée) et que les défauts de perméabilité peuvent entraîner des complications osmotiques au cours des deux premiers Divisions.
3. Score vers partiellement éclos ou entièrement éclos avec morphologie du corps ou des défauts comportementaux, tels que dumpy ou paralysé, comme «larve anormale».

3. Culture automatisée (Figure 3A)

REMARQUE: Le logiciel est logé dans deux endroits: (1) Zenodo abrite une version conviviale du logiciel¹² qui ne nécessite aucune expertise en programmation. (2) Github contient le code source de notre embryoCropUI.py et screenCrop.py logiciel¹³, qui nécessitent des compétences avec Python. Des instructions détaillées pour télécharger et exploiter les deux versions du programme peuvent être trouvées ci-dessous.

1. Recadrage automatisé à l'aide de la version exécutable embryoCropUI (version conviviale)
   1. Pour utiliser le programme embryoCropUI, téléchargez d'abord le programme de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Téléchargez la version MacOS ou Format Windows du programme (à noter que la version MacOS nécessite MacOS X10.11 ou plus).
      2. Téléchargez le fichier d'instructions (GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx), qui fournit des instructions étape par étape pour le test et l'utilisation du programme embryoCropUI.
      3. Téléchargez le test-files.zip pour vérifier si le programme fonctionne correctement sur la plate-forme (voir les instructions).
   2. Une fois téléchargé, décompresser et naviguer pour trouver l'embryonCropUI exécutable (...-embryoCropUI-WINDOWS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe) ou (...embryoCropUI-MacOS-embryoCropUI-embryoCropUI.exe ). Double clic pour lancer (ou choisir 'ouvrir avec' terminal) et exécuter l'embryoCropUI exécutable.
   3. L'interface graphique récolte exécutable un champ de vision 4D à la fois. Dans le coin supérieur gauche, sélectionnez le bouton ouvert pour charger le champ spécifique à la culture (multi-tiff). Si le recadrage d'une série tiff, avec plusieurs dimensions (c.-à-d., z, temps, canal), ne chargez que la première image de la série dans le dossier (une série de tiff par dossier).
   4. Une fois les images chargées, spécifiez les informations suivantes : nombre de tranches z, (Z), nombre de points de temps (T), nombre de canaux (C), canal qui correspond au DIC ou au champ lumineux (premier 1, deuxième, etc.).
   5. Sélectionnez le traitement supplémentaire pour exécuter sur les images. Le programme offre la correction de dérive, la soustraction de fond, et la correction d'atténuation.
   6. Spécifiez les paramètres de la correction de soustraction et d'atténuation de fond pour guider les efforts de traitement dans l'invite guiguie. Pour la soustraction d'arrière-plan, définissez la plus grande taille d'entité pour refléter la taille du signal significatif ; cette taille d'entité ne doit pas être considérée comme arrière-plan et doit être une valeur de nombre impair. Entrée d'une valeur de 0-1 pour la correction d'atténuation. La valeur de correction d'atténuation reflète le pourcentage d'intensité d'origine qui reste à la profondeur la plus éloignée de l'objet en cours d'image.
      REMARQUE: Contexte La correction de soustraction et d'atténuation doit être exécuté ensemble.
   7. Spécifiez l'ordre de collecte d'images (c.-à-d. le temps de canal-z-time (czt), ou z-canal-temps (zct)).
   8. Spécifiez les microns par pixel pour les images en fonction de l'appareil photo utilisé.
      REMARQUE: Un mauvais recadrage d'image se produira si la taille des pixels n'est pas correctement définie.
   9. Sélectionnez Exécuter dans le coin inférieur gauche. Un nouveau sous-dossier étiqueté «culture» sera créé dans le même chemin que le dossier non recadré; les versions recadrées seront enregistrées à cet endroit. Selon la taille du fichier, le recadrage doit se terminer en quelques secondes à quelques minutes.
2. Culture automatisée à l'aide de screenCrop.py (version de lot alternative à l'interface graphique embryoCrop décrite ci-dessus ;Python utilisateurs avertis seulement)^10,13
   1. Pour utiliser screenCrop.py, la version logicielle Python pour la culture de plus grands ensembles de données dans un format de lot, cloner ou télécharger le code source de Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Lisez les instructions pour configurer un environnement virtuel approprié et suivez le système de dénomination des fichiers décrit; qui sont tous deux détaillés dans le fichier README dans le référentiel Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Une fois que les variables environnementales et les conventions de nommage ont été correctement établies, ouvrez parameters.py et screenCrop.py dans un éditeur de choix.
   4. Pour modifier les paramètres réglables sans toucher au code source, modifiez le fichier parameters.py.
      REMARQUE : il est également possible de modifier directement les paramètres dans l'en-tête de screenCrop.py.
      1. Si vous utilisez le fichier de configuration parameters.py, modifiez le paramètre d'utilisation configuré en True. Si vous utilisez l'édition directe dans screenCrop.py, laissez le paramètre d'utilisation configuré à False.
      2. Localisez les renseignements suivants dans le dossier parameters.py et modifiez les paramètres d'imagerie et la structure des fichiers souhaités :
         1. loadFolder (ligne 9) : Modifier le lecteur sur lequel les fichiers sont stockés (p. ex., Z : D://, etc.)
         2. date (ligne 7) : Modification du dossier contenant des fichiers pour la session d'imagerie. C'est ce qu'on appelle le « nom du dossier d'expérience » dans le fichier de suivi CSV (voir les instructions).
         3. suiviFichier (ligne 11) : Modification du chemin vers le fichier CSV dans lequel les informations d'expérience sont stockées.
         4. z (ligne 13): Définir comme le nombre de avions z.
         5. nT (ligne14) : Définir le nombre de points de temps.
         6. nWells (ligne 19): Définir comme le nombre de puits utilisés.
         7. pointVisites (ligne 20) : Définir comme le nombre maximum de visites ponctuelles (par puits).
         8. Dans la ligne 10 trouver l'emplacement actuellement occupé par «CV1000/» et entrer le dossier externe utilisé dans le chemin de fichier. Pour éviter les problèmes, utilisez la convention suivante : 'XXXXXXX/'.
         9. Dans la ligne 12, entrez un chemin de fichier valide pour stocker les données de ratio d'aspect pour les données recadrées.
         10. Dans les lignes 15, 16, 17 et 18, vous entrez True/False pour savoir si les images passent par le traitement suivant :
             1. Entrée vrai ou fausse pour la correction de la dérive sur la ligne 15.
             2. Entrée vrai ou faux pour soustraction de fond sur la ligne 16. La taille des entités doit être déterminée empiriquement pour différentes souches de marqueurs et tailles de pixels. Dans la configuration ici, la taille des entités a été définie comme 41 pour la souche Germ-Layer et 201 pour la souche Morphogenesis. La soustraction de fond doit être effectuée en conjonction avec la correction d'atténuation.
             3. Entrée vrai ou fausse pour correction d'atténuation sur la ligne 17.
             4. Entrée Vrai ou Faux pour la rotation postérieure antérieure sur la ligne 18.
   5. Une fois que tous les changements ont été apportés, le recadrage peut commencer. Pour ce faire, passez à screenCrop.py et sélectionnez l'icône de jeu dans la barre d'outils, dans le menu déroulant sélectionnez Run As 'gt; Python Run.
   6. Comme le recadrage peut prendre plusieurs heures pour terminer pour un grand jeu de données (50 visites de points 18 z étapes, 3 canaux, 31 points de temps), suivre les progrès de la culture dans la fenêtre de la console. Une fois le recadrage terminé, une petite fenêtre affiche des aperçus des images recadrées avant d'enregistrer. Pour chaque image, il y a 3 options :
      1. Enregistrer : Appuyez sur barre d'espace pour enregistrer l'image si l'image est recadrée correctement sans qu'aucun domaine d'intérêt ne soit coupé.
      2. X: Appuyez sur X si l'image semble avoir des zones d'intérêt coupées; l'image sera enregistrée avec un X devant le nom pour la séparer des autres images.
      3. Supprimer: Appuyez sur D pour supprimer l'image recadrée si l'image n'est pas recadrée correctement ou si l'embryon n'est pas satisfaisant.
         REMARQUE : Les images seront enregistrées dans un dossier nommé "Cropped" dans le dossier de charge (défini dans la ligne 9 du programme).

4. Visualisation (Figure 4)

REMARQUE: OpenandCombine-embsV2.ijm^10,12 est une macro ImageJ qui va construire un fichier tiff facile à afficher à partir de toutes les images pour une souche spécifique et l'état. L'installation de FIJI/ImageJ^14,15 est nécessaire. Cette macro fonctionne selon notre structure de fichiers; il devra être modifié pour fonctionner avec d'autres structures de fichiers. Un guide de la structure appropriée des fichiers et une description détaillée des considérations importantes peuvent être trouvés à la fin du fichier GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx sur le référentiel Zenodo. S'il vous plaît lire à travers ces instructions complètement avant l'imagerie pour bien nommer et structurer les fichiers pour mieux interagir avec cette macro. Pour référence, notre structure de localisation de fichiers ressemble à ceci :
Z: 'cropped''Target'Strain'Emb'Target'Emb '15 Digit Unique Identifier ' W '#F 'T '#_Z '#_C '.tif
C'est-à-dire Z: 'cropped'EMBD0001'GLS'Emb1'EMBD0001'Emb1'20140327T135219'W02F1'T01'Z01'C1.tif

1. Téléchargez OpenandCombine-embsV2 et GUI-Instructions-zenodo-repoV2.docx de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Préparer les informations suivantes :
   -L'emplacement où les dossiers d'image sont stockés (après le recadrage).
   -Nom du dossier d'image (s) pour le traitement de l'état spécifique (c.-à-d., EMBD0002). C'est ce qu'on appelle « cible » dans l'exemple ci-dessus
   -Un identifiant unique alpha-numérique à 15 chiffres spécifique à une expérience donnée du jour au lendemain — cet identifiant est le nom du dossier d'acquisition de données (c.-à-d. 20140402T140154) et l'identifiant unique est intégré dans le nom de fichier tiff individuel (EMBD0002-Emb1 20140402T140154-W06F2-T01-Z01-C1) pour chaque embryon photographié ce jour-là. La macro utilise cet identifiant pour vérifier les embryons acquis à la même date et peut assembler des conditions répétées, avec des dates séparées, dans des fichiers ImageJ séparés.
3. Ouvrez ImageJ, et faites glisser et déposer le fichier macro, OpenandCombine-embsV2.ijm, à la barre ImageJ, ou ouvrez la macro directement.
4. Une fois la macro ouverte, localisez les lignes 3 et 4. Saisir l'information recueillie dans (section 4.2) selon les étapes suivantes :
   1. Dans la ligne 3 (RNAL), entrez le nom cible pour les images à traiter. Entrée de chaque cible dans la structure suivante newArray ("XXXXXXXX/"); inclure des citations. Pour exécuter plusieurs conditions à la fois, séparez-vous d'une virgule et gardez tous les noms cibles dans la parenthèse (c.-à-d., newArray («EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. Dans la ligne 4 (date), entrez l'identifiant unique alpha-numérique à 15 chiffres dans les citations, par exemple newArray («20140402T140154 »).
5. Appuyez sur Exécuter en bas à gauche de la fenêtre macro. Une fenêtre s'affiche, qui lancera une invite pour naviguer vers le dossier externe contenant les dossiers d'image recadrée (spécifié dans 4.4.1).
6. Une fois sélectionnée, une autre fenêtre apparaîtra, ce qui permettra la spécification des paramètres d'imagerie.
   1. Entrez le nombre de canaux, le nombre de tranches Z, la taille de la police pour le texte utilisé dans l'étiquetage des images compilées, et la couleur pour chacun des canaux.
   2. Vérifiez le contraste automatique/arrêt dans tous les canaux.
7. Une fois que tous les paramètres ont été spécifiés, cliquez sur OK au bas de la fenêtre. Le fichier composite commencera à s'assembler; cela prendra plusieurs minutes, par condition, pour terminer.
8. Une fois terminé, examinez les fichiers qui restent ouverts si vous le souhaitez. Ils peuvent être fermés sans enregistrement, car la macro a déjà enregistré les fichiers dans un dossier nouvellement créé qui est nommé de la manière suivante: nom du dossier externe (spécifié dans l'invite de la section 4.5) - "-fiji-processed-output" (c.-à-d., Z: cropped-fiji-processed-output-EMBD0002-GLS-20140402T140154.tif).

Résultats

Un défi important dans la caractérisation de l'effet des perturbations moléculaires sur le développement embryonnaire de C. elegans est qu'il faut environ 10 h pour que les embryons progressent du premier clivage à la fin de l'allongement à 20^'16. Une méthode semi-haut débit dans laquelle de grandes cohortes d'embryons peuvent être simultanément imageest utile pour les événements sur cette échelle de temps, car elle permet l'imagerie de conditions multiples en parallèle avec...

Discussion

Ce travail décrit une série d'outils et de méthodes qui ont été développés pour permettre des efforts à plus grande échelle pour profiler la fonction des gènes dans le développement embryonnaire dans C. elegans. Notre méthode semi-haut débit permet l'imagerie en time-lapse 3D du développement embryonnaire à une résolution de 20 min pour 80 à 100 embryons dans une seule expérience. Bien que ce protocole puisse être adapté pour une utilisation avec n'importe quelle souche de marqueur souhaitée...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832