Un método de imágenes de semi-alto rendimiento y un kit de herramientas de visualización de datos para analizar el desarrollo embrionario de C. elegans

Resumen

Este trabajo describe un protocolo de semi-alto rendimiento que permite imágenes simultáneas de lapso de tiempo 3D de embriogénesis en embriones de 80-100 C. elegans en una sola carrera nocturna. Además, se incluyen herramientas de visualización y procesamiento de imágenes para agilizar el análisis de datos. La combinación de estos métodos con cepas de reportero personalizadas permite un seguimiento detallado de la embriogénesis.

Resumen

C. elegans es el sistema principal para el análisis sistemático de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos durante el desarrollo embrionario. Un desafío es que la embriogénesis se desarrolla dinámicamente durante un período de aproximadamente 13 h; esta escala temporal de medio día ha limitado el alcance de los experimentos limitando el número de embriones que se pueden crear imágenes. Aquí, describimos un protocolo de semi-alto rendimiento que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones con resolución de tiempo moderada, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es sencillo y puede ser implementado por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidad de visita puntual. La utilidad de este protocolo se demuestra utilizándolo para crear una imagen de dos cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la especificación de la capa germinal y la morfogénesis. Para analizar los datos, se construyó un programa personalizado que recorta embriones individuales de un campo de visión más amplio en todos los canales, pasos z y puntos de tiempo y guarda las secuencias de cada embrión en una pila tiff independiente. El programa, que incluye una interfaz gráfica de usuario (GUI) fácil de usar, agiliza el procesamiento de datos aislando, preprocesando y orientando uniformemente embriones individuales en preparación para la visualización o el análisis automatizado. También se suministra una macro ImageJ que compila datos de embriones individuales en un archivo multipanel que muestra la proyección de fluorescencia de máxima intensidad e imágenes de campo brillante para cada embrión en cada punto de tiempo. Los protocolos y herramientas descritos en este documento fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario tras el derribo de 40 genes de desarrollo descritos anteriormente; este análisis visualizó fenotipos de desarrollo previamente anotados y reveló otros nuevos. En resumen, este trabajo detalla un método de imagen de rendimiento semi-alto junto con un programa de recorte y una herramienta de visualización ImageJ que, cuando se combina con cepas que expresan marcadores fluorescentes informativos, acelera en gran medida los experimentos para analizar desarrollo embrionario.

Introducción

El embrión C. elegans es un importante sistema modelo para la biología celular mecanicista y el análisis de la especificación del destino celular y eventos morfogenéticos que impulsan el desarrollo embrionario^{1,2,3,4 ,5,6,7,8,9}. Hasta la fecha, gran parte de la caracterización de eventos a nivel celular y especificación del destino celular en el embrión se ha logrado utilizando experimentos de imagen uno a uno de resolución temporal relativamente alta (es decir, adquisición cada 10–100 s) de embriones que expresan marcadores fluorescentes. Aunque es muy adecuado para eventos en el orden de segundos a decenas de minutos, este enfoque se convierte técnicamente en limitante para la caracterización de procesos más largos, en el orden de horas a días. El desarrollo embrionario desde el primer escote hasta el final del alargamiento toma alrededor de 10 h. En este tiempo, métodos de semi-alto rendimiento que permitirían imágenes simultáneas de menor resolución de tiempo (es decir, adquisición a intervalos de tiempo de 5-20 min) de cohortes más grandes de embriones, de diferentes condiciones, abrirían una nueva gama de experimentos; por ejemplo, permitir esfuerzos sistemáticos de cribado a gran escala y el análisis del número suficiente de embriones para comparar las consecuencias de las perturbaciones moleculares.

Aquí, describimos un método de semi-alto rendimiento para monitorear la embriogénesis de C. elegans que permite la toma simultánea de imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo en 80-100 embriones, de hasta 14 condiciones diferentes, en una sola carrera nocturna. El protocolo es fácil de implementar y puede ser llevado a cabo por cualquier laboratorio con acceso a un microscopio con capacidades de visita puntual. Los pasos principales en este protocolo se describen en la Figura 1. En resumen, los embriones se diseccionan de adultos gravídes que expresan marcadores fluorescentes de interés y transfieren embriones jóvenes (etapa de 2-8 células) a pozos de una placa de 384 pocillos para la toma de imágenes. En este formato, el tamaño relativamente pequeño del pozo canaliza los embriones en un área estrecha, lo que facilita la identificación de campos que contienen múltiples embriones para la toma de imágenes de lapso de tiempo. Para mantener un desarrollo más o menos sincrónico en toda la cohorte de embriones, las disecciones se realizan en medios refrigerados y la placa se mantiene en hielo, lo que impide un desarrollo significativo durante la ventana de tiempo de disección de una hora. La placa se transfiere al microscopio y los embriones se filman en una habitación con temperatura controlada durante la noche, a intervalos de tiempo de 20 minutos, utilizando una lente de inmersión en aceite de 60x 1.35 NA, para recoger todo el rango z en pasos de 2 m. Cincuenta campos, cada uno con entre 1-5 embriones, se utilizan en una sola carrera nocturna. Dependiendo del experimento deseado, la resolución de tiempo podría aumentarse (por ejemplo, imágenes a intervalos de 5-10 min) disminuyendo proporcionalmente el número de campos con imágenes.

Con este protocolo, incluso una sola ejecución nocturna genera una cantidad significativa de datos (80-100 embriones repartidos en 50 campos) y experimentos más grandes pueden volverse rápidamente inmanejables con respecto al análisis de datos. Para facilitar el procesamiento, la visualización y el análisis simplificado de estos datos, se creó un programa para recortar y orientar embriones y realizar pasos de preprocesamiento (opcional), y una macro ImageJ que compila los datos para simplificar la visualización. Estos programas se pueden utilizar para procesar imágenes recopiladas utilizando enfoques convencionales, ya que son independientes del método de imagen, que requieren un solo plano de campo brillante. El primer programa toma en un campo 4D que contiene múltiples embriones (opción GUI o código fuente embryoCrop.py) o múltiples campos 4D que contienen múltiples embriones (screenCrop.py), refuerza estrechamente los embriones y los orienta en una configuración anterior-posterior. Estos programas también ofrecen a los usuarios la opción de realizar la resta en segundo plano, la corrección de deriva y la corrección de atenuación. Los archivos resultantes son pilas tiff preprocesadas y estrechamente recortadas para cada embrión que son modificables para el análisis automatizado de imágenes. Para facilitar la visualización de todos los embriones para cada condición, se escribió una macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que ensambla todos los embriones de una condición dada en una sola pila tiff y matrices de imágenes de campo brillante y color de proyección de máxima intensidad ( RGB), en paralelo, para cada embrión. Los métodos fueron validados utilizándolos para caracterizar el desarrollo embrionario después de derribar 40 genes de desarrollo descritos anteriormente en un par de cepas personalizadas que expresan marcadores fluorescentes optimizados para visualizar aspectos clave de la capa germinal especificación y morfogénesis^10,11. Juntos, el protocolo de imágenes embrionarias de rendimiento semi-alto y las herramientas de procesamiento de imágenes permitirán experimentos de mayor número de muestras y esfuerzos de cribado a gran escala destinados a comprender los procesos de desarrollo. Además, estas cepas también proporcionarán un medio eficaz para examinar los efectos de las perturbaciones moleculares en la embriogénesis.

Protocolo

1. Preparación de C. elegans Embryos para imágenes de semi-alto rendimiento

NOTA: El objetivo de esta parte del protocolo es cargar una población de embriones C. elegans semi-sincronizados (etapa de 2 a 8 celdas), diseccionados de cepas marcadoras adecuadas(Figura 2),en una placa de 384 pocillos con fondo de vidrio para la toma de imágenes. Otros formatos de placas también podrían funcionar, pero se prefieren las 384 placas de pozo porque el pequeño tamaño del pozo restringe la propagación de embriones a un área relativamente pequeña, lo que facilita la identificación de campos que contienen múltiples embriones para la toma de imágenes de lapso de tiempo. La sincronización aproximada de los embriones garantiza que se capture el curso completo de desarrollo para cada uno de los embriones en un campo.

1. Preparar 5-10 ml de solución de 0,1 mg/ml de tetramisole clorhidrato (TMHC) anestésico disuelto en medio M9 helado (0,45 M Na₂HPO₄x 7H₂O, 0,11 M KH₂PO₄, 0,04 M NaCl, 0,09 M NH₄Cl) para utilizar durante el tiempo disección e imágenes. Este medio incluye un anestésico para asegurar que la larva eclosionada en movimiento no interrumpa la toma de imágenes de embriones en etapas de desarrollo anteriores.
   NOTA: Si utiliza las herramientas de recorte y visualización para analizar los datos adquiridos mediante métodos de montaje de almohadilla sin agarosa estándar, vaya a la sección 3 a continuación.
2. Aliquot 70 l de la solución preparada en pozos individuales de una placa de 384 pocillos con fondo de vidrio de 384 pocillos con un pozo para cada condición; evitar las dos filas externas de la placa para evitar efectos de borde.
   NOTA: Es útil enmascarar los pozos circundantes utilizando lámina de placa PCR adhesiva (ver ejemplo en la Figura 1D) esto preserva los pozos adyacentes para futuros experimentos y facilita la localización de los pozos apropiados bajo el microscopio de disección. Una vez que la solución esté alícuota, mantenga la placa y la solución restante en hielo durante la disección.
3. Generar pipetas bucales para transferir embriones desde la diapositiva de depresión (donde se diseccionan los hermafroditas gravídicas) a los pozos. Tire de pipetas capilares (pipetas calibradas de 25 l) sobre una llama y rompa para generar un extremo cónico fino(Figura 1D). Se necesita un pipeta por condición para evitar la contaminación cruzada; desechar el pipeta después de su uso.
4. Utilice pinzas finas para transferir 10 adultos gravid bajo un endoscopio de disección en 150 s de la solución de TMHC helada alícotada a un tobogán de depresión para cada condición. Usando las pinzas y un bisturí, diseccionar los gusanos para liberar los embriones.
5. Cargue un pipeta capilar tirado en el accesorio del aspirador incluido con los pipetas, y la boca pipeta para transferir todos los embriones de 2 a 8 fases celulares en un pozo individual de la placa preparada(Figura 1D). Evite transferir embriones en etapa tardía y restos de disección. Examinar bajo un alcance de disección y si hay agregados de embriones, entubamiento de la boca hacia arriba y hacia abajo o grupos de grifos de embriones con punta de pipeta para dispersar.
   NOTA: Para evitar la contaminación cruzada, limpie los equipos de disección y utilice un nuevo tubáco de la boca mientras se mueve entre condiciones. Almacene la placa en hielo entre disecciones.
6. Una vez diseccionados los gusanos de todas las condiciones y colocados embriones en su pozo apropiado, gire la placa de 384 pocillos durante 1 min a 600 x g para asentar los embriones.
7. Limpie la parte inferior de la placa con una toallita empapada en etanol para eliminar cualquier residuo y colocar la placa en un microscopio confocal equipado con un portaplacas en un entorno con temperatura controlada.
   NOTA: Los pasos que siguen detallan este método mediante la configuración de laboratorio; por favor modifique las condiciones de adquisición para adaptarse a las necesidades experimentales y el equipo. Aquí, se utiliza una caja de escáner confocal equipada con un disco giratorio nipkow doble mejorado con microlentes, una cámara EM-CCD de 512 x 512, una etapa automática de alta precisión (resolución designada 0,1 m) y un control motorizado del eje z (resolución designada 0,1 m). Este sistema se mantiene en una habitación de 16 oC, que mantiene la temperatura del microscopio entre 21 y 23 oC durante la toma de imágenes durante la noche.
8. Para identificar campos con embriones adecuados, realice un pre-escaneo de cada pozo utilizando un objetivo de 10x 0.4 NA y un software de imagen adecuado. Los campos más óptimos contendrán más de un embrión en etapa temprana que esté en el mismo plano focal que otros embriones e idealmente tendráun un contacto mínimo entre embriones adyacentes. Marque las posiciones de las regiones adecuadas.
9. Para seleccionar campos de imágenes, cambie al objetivo 60x y ajuste el plano focal en cada visita de punto para seccionar adecuadamente los embriones. Se crean una imagen de 1 a 4 campos por pozo, para un total de 50 campos en 14 pozos, y cada campo puede contener entre uno y cinco embriones. En general, se seleccionan de 4 a 15 embriones de cada condición para obtener imágenes de alta resolución.
   NOTA: Una variable clave en este paso es el uso de suficiente aceite; colocar aceite en el objetivo, visitando puntos en cada pozo para esparcir el aceite alrededor de la superficie de todos los pozos y luego aplicar una gota adicional de aceite al objetivo antes de la selección de campos.
10. Idee los campos seleccionados utilizando un objetivo de 60x 1,35 NA para adquirir secciones de 18 z a intervalos de 2 m cada 20 minutos durante 10 horas. Las condiciones de imagen que utilizan las cepas de reporteros de capa germinal y morfogénesis son las siguientes: campo brillante, 90% de potencia, 25 ms, 20% de ganancia; 488 nm, 100% de potencia, 200 ms, 60% de ganancia; 568 nm, 45% de potencia, 150 ms, 60% de ganancia.
11. Una vez completada la toma de imágenes, evalúe la letalidad embrionaria realizando un aumento bajo (objetivo de 10x 0,4 NA) exploración de campo brillante de pozo completo de 20 a 24 horas después del inicio de la toma de imágenes durante la noche.

2. Puntuación de la letalidad embrionaria

1. Usando los campos escaneados 10x después de la ejecución, evalúe la letalidad embrionaria y los defectos larvariales contando gusanos eclosionados y embriones sin rayar para cada pocal.
2. Puntuación de embriones sin rayar como letales embrionarios. Excluir del recuento de la letalidad los embriones detenidos de una a cuatro etapas celulares, ya que los embriones diseccionados jóvenes a veces no completan la formación de cáscaras de huevo (si la meiosis II aún no está completa) y los defectos de permeabilidad pueden conducir a complicaciones osmóticas durante los dos primeros Divisiones.
3. Puntuar gusanos parcialmente eclosionados o completamente eclosionados con morfología corporal o defectos de comportamiento, como volquete o paralizado, como "larva anormal".

3. Recorte automatizado(Figura 3A)

NOTA: El software se aloja en dos ubicaciones: (1) Zenodo alberga una versión fácil de usar del software¹² que no requiere ninguna experiencia de programación. (2) Github contiene el código fuente de nuestro embryoCropUI.py y screenCrop.py software^13,que requieren competencia con Python. Las instrucciones detalladas para descargar y operar ambas versiones del programa se pueden encontrar a continuación.

1. Recorte automatizado utilizando la versión ejecutable embryoCropUI (versión fácil de usar)
   1. Para utilizar el programa embryoCropUI, primero descargue el programa de Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w)¹².
      1. Descargue la versión de formato MacOS o Windows del programa (tenga en cuenta que la versión de MacOS requiere MacOS X10.11 o superior).
      2. Descargue el archivo de instrucciones (GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx), que proporciona instrucciones paso a paso para probar y utilizar el programa embryoCropUI.
      3. Descargue test_files.zip para comprobar si el programa funciona correctamente en la plataforma (consulte las instrucciones).
   2. Una vez descargado, descomprima y navegue para encontrar el ejecutable embryoCropUI (..... . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Haga doble clic para iniciar (o elija 'abrir con' terminal) y ejecute el ejecutable embryoCropUI.
   3. El ejecutable GUI recorta un campo de visión 4D a la vez. En la esquina superior izquierda, seleccione el botón Abrir para cargar el campo específico que desea recortar (multi-tiff). Si recorta una serie tiff, con varias dimensiones (es decir, z, tiempo, canal), cargue solo la primera imagen de la serie dentro de la carpeta (una serie tiff por carpeta).
   4. Una vez cargadas las imágenes, especifique la siguiente información: número de sectores z, (Z), número de puntos de tiempo (T), número de canales (C), el canal que corresponde a DIC o brightfield (primero 1, segundo 2, etc.).
   5. Seleccione el procesamiento adicional para que se ejecute en las imágenes. El programa ofrece Corrección de deriva, Resta de fondo y Corrección de atenuación.
   6. Especifique los parámetros para la resta en segundo plano y la corrección de atenuación para guiar los esfuerzos de procesamiento en la solicitud de GUI. Para Restar fondo, defina el tamaño de entidad más grande para reflejar el tamaño de la señal significativa; este tamaño de entidad no debe considerarse como fondo y debe ser un valor de número impar. Introduzca un valor de 0-1 para Corrección de atenuación. El valor Corrección de atenuación refleja el porcentaje de intensidad original que permanece en la profundidad más leal del objeto que se está creando imágenes.
      NOTA: La resta de fondo y la corrección de atenuación deben ejecutarse juntas.
   7. Especifique el orden de la colección de imágenes (es decir, el tiempo de canal-z (czt) o el tiempo de canal z (zct)).
   8. Especifique las micras por píxel para las imágenes en función de la cámara que se esté utilizando.
      NOTA: El recorte deficiente de la imagen se producirá si el tamaño del píxel no está definido correctamente.
   9. Seleccione Ejecutar en la esquina inferior izquierda. Se creará una nueva subcarpeta con la etiqueta "recortar" en la misma ruta que la carpeta sin recortar; las versiones recortadas se guardarán en esta ubicación. Dependiendo del tamaño del archivo, el recorte debe completarse en cuestión de segundos a minutos.
2. Recorte automatizado con screenCrop.py (versión por lotes alternativa a embryoCrop GUI descrita anteriormente;Solo usuarios expertos en Python)^10,13
   1. Para utilizar screenCrop.py, la versión de software de Python para recortar conjuntos de datos más grandes en un formato por lotes, clonar o descargar el código fuente de Github (github.com/renatkh/embryo_crop.git).
   2. Lea las instrucciones para configurar un entorno virtual adecuado y siga el sistema de nombres de archivos descrito; ambos se detallan en el archivo README en el repositorio Github: https://github.com/renatkh/embryo_crop/blob/master/README.md.
   3. Una vez que las variables ambientales y las convenciones de nomenclatura se han establecido correctamente, abra parameters.py y screenCrop.py en un editor de elección.
   4. Para modificar los parámetros ajustables sin tocar el código fuente, edite el archivo parameters.py.
      NOTA: también es posible cambiar directamente los parámetros dentro del encabezado de screenCrop.py.
      1. Si utiliza el archivo de configuración parameters.py, cambie la configuración use_configure a True. Si utiliza la edición directa dentro de screenCrop.py, deje la opción use_configure en False.
      2. Busque la siguiente información dentro del archivo parameters.py y realice modificaciones para adaptarse a los parámetros de imagen y la estructura de archivos deseados:
         1. loadFolder (línea 9): Cambie a la unidad en la que se almacenan los archivos (por ejemplo, Z:/, D://, etc.)
         2. fecha (línea 7): cambie a la carpeta que contiene los archivos de la sesión de imágenes. Esto se conoce como 'Nombre de carpeta de experimento' en el archivo de seguimiento CSV (consulte las instrucciones).
         3. trackingFile (línea 11): cambie a la ruta de acceso al archivo CSV en el que se almacena la información del experimento.
         4. z (línea 13): Establezca como el número de planos z.
         5. nT (línea14): Establezca como el número de puntos de tiempo.
         6. nPozos (línea 19): Establecer como el número de pozos utilizados.
         7. pointVisits (línea 20): Establecer como el número máximo de visitas de puntos (por pozo).
         8. En la línea 10 busque la ubicación actualmente ocupada por 'CV1000/' e introduzca la carpeta externa utilizada en la ruta de archivo. Para evitar problemas, utilice la siguiente convención: 'XXXXXXX/'.
         9. En la línea 12, introduzca una ruta de acceso de archivo válida para almacenar datos de relación de aspecto para los datos recortados.
         10. En las líneas 15, 16, 17 y 18 entrada Verdadero/Falso para si las imágenes pasan por el siguiente procesamiento:
             1. Introduzca True o False para la corrección de deriva en la línea 15.
             2. Introduzca True o False para restar fondo en la línea 16. El tamaño de la entidad debe determinarse empíricamente para diferentes deformaciones unitarias de marcador y tamaños de píxel. En la configuración aquí, el tamaño de la entidad se definió como 41 para la cepa Germ-Layer y 201 para la cepa Morphogenesis. La resta de fondo debe realizarse junto con la corrección de la atenuación.
             3. Introduzca True o False para la corrección de atenuación en la línea 17.
             4. Entrada True o False para rotación posterior anterior en la línea 18.
   5. Una vez que se han realizado todos los cambios, el recorte puede comenzar. Para ello, cambie a screenCrop.py y seleccione el icono de reproducción en la barra de herramientas, en el menú desplegable seleccione Ejecutar como > Ejecutar Python.
   6. Como el recorte puede tardar varias horas en completarse para un conjunto de datos grande (50 puntos visitan pasos de 18 z, 3 canales, 31 puntos de tiempo), realizar un seguimiento del progreso del recorte en la ventana de la consola. Una vez completado el recorte, una pequeña ventana mostrará vistas previas de las imágenes recortadas antes de guardarlas. Para cada imagen hay 3 opciones:
      1. Guardar: Pulse barra espaciadora para guardar la imagen si la imagen se recorta correctamente sin que se corten áreas de interés.
      2. X: Pulse X si la imagen parece tener áreas de interés cortadas; la imagen se guardará con una X delante del nombre para separarla de las otras imágenes.
      3. Borrar: Pulse D para eliminar la imagen recortada si la imagen no está recortada correctamente o si el embrión no es satisfactorio.
         NOTA: Las imágenes se guardarán en una subcarpeta denominada "Cropped" en la carpeta de carga (definida en la línea 9 del programa).

4. Visualización (Figura 4)

NOTA: OpenandCombine_embsV2.ijm^10,12 es una macro ImageJ que construirá un archivo tiff fácil de ver a partir de todas las imágenes para una tensión y condición específicas. Se requiere la instalación de FIJI/ImageJ^14,15. Esta macro se ejecuta de acuerdo con nuestra estructura de archivos; tendrá que ser modificado para trabajar con otras estructuras de archivos. Puede encontrar una guía para la estructura de archivos adecuada y una descripción detallada de las consideraciones importantes al final del archivo GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx en el repositorioZenodo. Lea estas instrucciones completamente antes de crear imágenes para nombrar y estructurar correctamente los archivos para interactuar mejor con esta macro. Como referencia, nuestra estructura de ubicación de archivos tiene este aspecto:
Z:'recortar''Destino', 'Strain', 'Emb', 'Target_Emb', '15' identificador único de dígitos _W'#F'_T', #_Z, #_C.tif
es decir, Z:-recortar-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

1. Descargue OpenandCombine_embsV2 y GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx desde Zenodo (https://zenodo.org/record/3235681#.XPAnn4hKg2w).
2. Prepare la siguiente información:
   -La ubicación donde se almacenan las carpetas de imagen (después del recorte).
   -Los nombres de la carpeta de imagen para las condiciones específicas que se van a procesar (es decir, EMBD0002). Esto se conoce como "Objetivo" en el ejemplo anterior
   -Un identificador único alfanumérico de 15 dígitos que es específico de un experimento nocturno determinado: este identificador es el nombre de la carpeta de adquisición de datos (es decir, 20140402T140154) y el identificador único se incrusta en el nombre de archivo tiff individual (EMBD0002_Emb1_ 20140402T140154_W06F2_T01_Z01_C1) por cada embrión que se doy a la imagen de ese día. La macro utiliza este identificador para comprobar si hay embriones adquiridos en la misma fecha y puede ensamblar condiciones repetidas, con fechas separadas, en archivos ImageJ separados.
3. Abra ImageJ y arrastre y suelte el archivo de macro, OpenandCombine_embsV2.ijm, en la barra ImageJ o abra la macro directamente.
4. Una vez abierta la macro, localice las líneas 3 y 4. Introduzca la información recopilada (sección 4.2) de acuerdo con los siguientes pasos:
   1. En la línea 3 (RNAL), introduzca el nombre de destino de las imágenes que se van a procesar. Introduzca cada destino en la siguiente estructura newArray("XXXXXXXX/"); incluir citas. Para ejecutar varias condiciones a la vez, separe con una coma y mantenga todos los nombres de destino dentro del paréntesis (es decir, newArray("EMBD0000/","EMBD0001/","EMBD0002/").
   2. En la línea 4 (fecha), introduzca el identificador único alfanumérico de 15 dígitos entre comillas, por ejemplo newArray("20140402T140154").
5. Pulse Ejecutar en la parte inferior izquierda de la ventana de macro. Aparecerá una ventana, que iniciará un mensaje para navegar a la carpeta externa que contiene las carpetas de imágenes recortadas (especificadas en 4.4.1).
6. Una vez seleccionada, aparecerá otra ventana, que permitirá la especificación de los parámetros de imagen.
   1. Introduzca el número de canales, el número de sectores Z, el tamaño de fuente del texto utilizado para etiquetar las imágenes compiladas y el color de cada uno de los canales.
   2. Compruebe/desactive el contraste automático en todos los canales.
7. Una vez especificados todos los parámetros, haga clic en Aceptar en la parte inferior de la ventana. El archivo compuesto comenzará a ensamblarse; esto tomará varios minutos, por condición, para completar.
8. Una vez completado, revise los archivos que se dejan abiertos si lo desea. Se pueden cerrar sin guardar, ya que la macro ya ha guardado los archivos en una carpeta recién creada que se nombra de la siguiente manera: nombre de carpeta externa (especificado en la solicitud de la sección 4.5) + "-fiji-processed-output" (es decir, Z: recortado-fiji-processed-output-EMBD0002_GLS_20140402T140154.tif).

Resultados

Un desafío significativo en la caracterización del efecto de las perturbaciones moleculares en el desarrollo embrionario de C. elegans es que los embriones tardan alrededor de 10 horas en progresar desde la primera escisión hasta el final del alargamiento a 20o¹⁶. Un método de semi-alto rendimiento en el que se pueden tomar imágenes simultáneas de grandes cohortes de embriones es útil para eventos en este escala temporal porque permite la toma de imágenes de múltiples condiciones...

Discusión

Este trabajo describe un conjunto de herramientas y métodos que se desarrollaron para permitir esfuerzos a mayor escala para perfilar la función de los genes en el desarrollo embrionario en C. elegans. Nuestro método de semi-alto rendimiento permite imágenes de lapso de tiempo 3D del desarrollo embrionario a una resolución de 20 minutos para 80-100 embriones en un solo experimento. Si bien este protocolo se puede adaptar para su uso con cualquier cepa de marcador deseada, este trabajo demuestra el potencial...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aspirator Tube Assembly	Drummond Scientific	2-000-000
Calibrated Pipette (25 mL)	Drummond Scientific	2-000-025
Cell Voyager Software	Yokogawa Electric Corp	Included with CV1000
Conical Tube (15 mL)	USA Scientific	1475-0501
CV1000 Microscope	Yokogawa Electric Corp	CV1000
Depression slide (3-well)	Erie Scientific	1520-006
Dissection Microscope	Nikon	SMZ-645
Eppendorf Centrifuge 5810R	Eppendorf	5811 07336
ImageJ/FIJI	Open Source	https://imagej.net/Fiji
M9 Buffer	Lab Prepared	https://openwetware.org/wiki/M9_salts
Microcentrifuge Tube (1.5 mL)	USA Scientific	1615-5500
Microseal F-foil Seal	Bio-Rad	MSF1001
NGM Plates	Lab Prepared	http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214
Scalpel #15	Bard Parker	REF 371615
Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom	Greiner Bio-One	781855
Tetramisole Hydrochloride	Sigma Aldirch	T1512-10G
Tweezers, Dumont #3	Electron Microscopy Sciences	0109-3-PO
U-PlanApo objective (10× 0.4 NA)	Olympus	1-U2B823
U-PlanApo objective (60× 1.35 NA)	Olympus	1-U2B832