JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مطلوب تطوير نماذج murine مع جينات محدده تحور في مرضي سرطان الراس والرقبة لفهم الأورام. هنا ، ونحن نقدم بروتوكول للتحول في المختبر من خلايا اللسان الاوليه murine باستخدام نظام الفيروسات المرتبطة adeno-كاس 9 لتوليد murine الخلايا HNC خطوط مع التعديلات الجينية محدده.

Abstract

استخدام الخلايا الظهاريه العادية الاوليه يجعل من الممكن التكرار الحث علي التغييرات الجينية اللازمة للتحول الخلوي من خلال إدخال طفرات محدده في الجينات المثبطة والجينات القمعية الورم ، وذلك باستخدام متفاوت المسافات التنظيمية المتداخلة تقنيه تحرير الجينوم القائمة علي الجينات القصيرة (CRISPR) في الفئران. هذه التكنولوجيا تسمح لنا لمحاكاة بدقه التغيرات الجينية التي تحدث في السرطانات البشرية باستخدام الفئران. من خلال تحويل وراثيا الخلايا الاوليه murine ، يمكننا دراسة أفضل لتطوير السرطان ، والتقدم ، والعلاج ، والتشخيص. في هذه الدراسة ، استخدمنا Cre-المحرض كاس 9 اللسان الماوس الخلايا الظهاريه لتمكين الجينوم التحرير باستخدام الفيروسات المرتبطة adeno (AAV) في المختبر. علي وجه التحديد ، عن طريق تغيير KRAS ، p53 ، و APC في الخلايا الظهاريه اللسان العادية ، ونحن ولدت الراس والرقبة murine السرطان (HNC) خط الخلية في المختبر ، والذي هو توموريغينيك في الفئران المتزامنة. تصف الطريقة المعروضة هنا بالتفصيل كيفيه توليد الخطوط الخلوية HNC مع التعديلات الجينية محدده ويشرح ملاءمتها للتنبؤ تطور الورم في الفئران المتزامنة. ونحن نتصور ان هذه الطريقة الواعدة ستكون مفيده لدراسة البيولوجيا السرطانية والعلاج من HNC.

Introduction

HNC هو الخبيثة الشائعة في جميع انحاء العالم1. نمذجة نشاه الأورام HNC حاليا في نقطه تحول العلمية2. في حين تم التعرف علي العديد من الطفرات الجينية في hnc2،3،4 (مثل ، TP53 ، PIK3CA ، NOTCH1 ، FAT1 ، وراس) التوليفات محدده من التعديلات الجينية المطلوبة في الحفل للحث علي hnc تبقي غير واضحة.

وقد ساعد الاستخدام الحالي للخطوط الخلوية HNC البشرية بشكل كبير لتوضيح أليات المرتبطة بالتسبب والعلاج3. ومع ذلك ، فان دراسة خطوط الخلايا البشرية في أنظمه الجينات المناعية لها حدودها ، لان هذه الانظمه لا تعالج عمليه الأورام المجهرية ، ودور طفرات جينيه محدده ، واستجابات العلاج في بيئة ميكرومناعيه. التالي ، فان تطوير وإنشاء خطوط خلايا murine مع التعديلات الجينية المحددة هي ذات اهميه أساسيه لدراسة كيفيه مساهمه الجينات المختلفة في عمليه التحول واختبار العلاجات الجديدة القائمة علي جزيء في الفئران المناعية.

وقد تاثرت دراسات وظائف الجينات في البحوث الطبية الحيوية بشكل كبير بالتقدم في تكنولوجيات تحرير الحمض النووي ، من خلال إدخال فواصل مزدوجة الحبل (DSBs) ، علي سبيل المثال5. هذه التكنولوجيات ، بما في ذلك استخدام الزنك الاصبع السبابة ، النسخ المنشط مثل المنحرف المستجيب ، وتكرار الفاصلة التنظيمية متباعدة المتداخلة (CRISPR/كاس 9) ، تسمح للتلاعب من اي جين الفائدة في موضعها. وتتالف أحدث أنظمه CRISPR/كاس 9 من دليل RNA (gRNA) الذي يوجه النيوداز كاس 9 لتوليد DSB في موقع معين في الجينوم. وقد اكتسب هذا النظام اعترافا واسع النطاق في تعديل الجينات الذاتية في اي خليه أو الانسجه المستهدفة ، حتى في الكائنات الأكثر صعوبة لعلاج التقليدية5. لديها مزايا متعددة علي الانظمه الأخرى نظرا لبساطتها ، والسرعة ، والكفاءة.

في مجال الأورام ، حققت تقنيه CRISPR/كاس 9 الحاجة إلى تقليد الخلايا السرطانية بشكل فعال. لإنشاء هذا النظام في hnc ، ونحن التلاعب القوية kras ورمي واثنين من الجينات المثبطة الأورام الهامه ، APC و p536. وفقا لقاعده بيانات الجني7، وهذا المزيج هو نادر في hnc. الطفرات RAS (HRAS ، NRAS ، و KRAS) موجودة في فقط ~ 7 ٪ من جميع السكان HNC. هذه الأورام تميل إلى ان تكون مقاومه للعلاج8،9.

ويتحقق تسليم كاس 9 والgrna من خلال المحولات الفيروسية باستخدام الطائرات بالطائرة أو اللينتيفيروسيس. المؤتلف AAV غالبا ما يكون الأسلوب المفضل لتقديم الجينات إلى الخلايا المستهدفة نظرا لارتفاع titer ، استجابه مناعية خفيفه ، والقدرة علي نقل مجموعه واسعه من الخلايا ، والسلامة العامة. باستخدام نظام AAV ، تم إنشاء خطوط خلايا الماوس المختلفة الانسجه الخاصة ، وخطوط الخلايا الجديدة لا تزال قيد التطوير10،11،12. ومع ذلك ، فان نظام التحرير الجيني الفعال الذي يمكن ان يولد خلايا نماذج خطوط الخلية التي لا يزال يتعين تطويرها. في هذه الدراسة ، سعينا لتطوير نظام القائم علي كاس 9 في المختبر لتحويل خلايا اللسان الاوليه murine إلى حاله الأورام. ويمكن استخدام هذا البروتوكول فريدة من نوعها CRISPR/كاس 9 التحول وخط الخلايا السرطانية التي أنشئت لفهم أفضل بيولوجيا HNC الناجمة عن تنوع التغييرات الجينوم.

Protocol

وقد تمت الموافقة علي هذه الدراسة من قبل جامعه بن غوريون في لجنه رعاية واستخدام الماشية في النقب. تمت الموافقة علي التجارب الحيوانية من قبل IACUC (80-12-2015 و IL. 29-05-2018 (ه)). وكانت جميع جوانب اختبار الحيوانية ، والإسكان ، والظروف البيئية المستخدمة في هذه الدراسة في الامتثال للدليل لرعاية واستخدام المختبر الحيوانية13.

1. adeno-إنتاج الفيروسات المرتبطة

  1. اليوم الأول: ثقافة الخلية
    1. البذور 4 × 106 خلايا HEK293T في لوحه 14.5 سم في 15 مل من dmem. اعداد 10 لوحات للتحويل مع بوليثيلينمين (PEI) (1 ميكروغرام/μL).
  2. اليوم الثاني: الانتقال من خلايا HEK293T باستخدام PEI
    1. أزاله الوسائط وأعاده التغذية مع DMEM الدافئة 1 ح قبل التحويل.
    2. الكواشف العابرة الدافئة و DMEM.
    3. استخدام 10 ميكروغرام من البلازميد من الفائدة التي تحتوي علي aav itr (aav pCM109 EFS cre sg APC sg kras sg P53-kras HDR) ، 10 ميكروغرام من aav 2/9n كابسيد البلازميد (مع الجينات rep من AAV2 والجينات الغطاء من AAV9 ، و 10 ميكروغرام من البلازميد المساعد (paddelta F5 المساعد) لكل لوحه (انظر جدول المواد).
      ملاحظه: جيل جديد من المساعد البلازميد-pAdDeltaF614،15،16 التي يمكن أيضا ان تستخدم لإنتاج aav هو متاح.
    4. اخلط البلازميدات في 1 مل من DMEM عادي لكل لوحه. ثم أضافه 90 μl من بوليثيلينيماين (مجموع البلازميد: تركيز PEI = 1:3) إلى مزيج البلازميد ودوامه لفتره وجيزة.
    5. احتضان مزيج الحمض النووي PEI-plasmid لمده 20 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
    6. أضافه القطرات المختلطة علي راس الخلايا HEK293T ونقل لوحات إلى الحاضنة ثقافة الخلية في 37 درجه مئوية مع 5 ٪ CO2 ل 24 ساعة.
  3. اليوم الثالث: تغيير متوسط بعد التحويل
    1. أزاله المتوسطة تماما وأضافه 15 مل من DMEM الطازجة.
  4. اليوم الخامس: حصاد الفيروس
    1. اعداد حمام الثلج الجاف/الايثانول.
    2. جمع الخلايا مع مكشطه الخلية ونقلها إلى أنابيب 50 mL (2 لوحات لكل أنبوب 50 mL).
    3. تدور أنابيب في 800 x g لمده 15 دقيقه في درجه حرارة الغرفة.
    4. تخلص من الديدان الفائقة من جميع الأنابيب. أضافه 0.5 mL من العازلة تحلل (150 mM كلوريد الصوديوم ، 50 mM تريس-HCl ، pH = 8.5) لكل لوحه (اي ، 5 مل ل 10 لوحات) إلى الأنبوب الأول فقط. أعاده تعليق الخلايا ونقل الحجم الكلي إلى الأنبوب التالي والاستمرار حتى الأنبوب الأخير.
    5. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 50 mL الطازجة. غسل الأنابيب مع نفس الحجم من تحلل العازلة (0.5 مل لكل لوحه) باستخدام نفس طريقه النقل كما هو موضح في الخطوة 1.4.4.
    6. موضوع تعليق الخلية إلى ثلاث جولات من ~ 10 دقيقه تجميد/ذوبان دورات بين الجليد الجاف/الايثانول حمام وحمام مياه 37 درجه مئوية. دوامه لفتره وجيزة بعد كل ذوبان.
    7. إذا تم اجراء التنقية في نفس اليوم ، قم بتعيين المخزن المؤقت لتاخيرمن والشطف (انظر الجدول 1 للوصفة) في RT.
    8. أضافه 50 وحدات من البنبوناز لكل لوحه واحتضان في 37 درجه مئوية ل 1.5 h.
      ملاحظه: يستخدم البنبوناز لهضم الأحماض النووية المتبقية من الخلايا المنتجة المضيفة والحمض النووي البلازميد الموجود في تعليق الخلية.
    9. تدور الأنابيب في 3,000 x g لمده 15 دقيقه في 4 °c.
    10. جمع ماده طافي في حقنه باستخدام ابره الصلب 18 G ودفع الحل من خلال فلتر 0.45 μm في أنبوب 15 مل للحصول علي lysate الخام.
    11. يخزن الليمات الخام عند درجه حرارة 4 درجات مئوية لبضعة أسابيع حتى التنقية أو الاستمرار في التنقية.

2. AAV تنقيه

  1. اليوم الخامس أو الأحدث
    1. وضع المخزن المؤقت تاخيرمن والتملص في RT.
    2. غسل الاعمده اللونية مع 10 مل من المخزن المؤقت تاخيرمن.
    3. أضافه 0.5 mL لكل صفيحه من الهيبارين-اجنشا إلى العمود17 ثم قم باضافه المخزن المؤقت تاخيرمن (4x حجم الهيبارين-اجنشا). خلط الحلول عن طريق عكس العمود والسماح لرواسب الاغاروزها.
    4. Elute تاخيرمن العازلة من العمود بواسطة الجاذبية.
      ملاحظه: ترك بعض تاخيرمن المخزن المؤقت لمنع اجنشا من التجفيف.
    5. تحميل محلله الخام علي العمود واحتضان لمده 2 ح في 4 درجه مئوية مع الانفعالات المستمرة. جعل العمود في وضع تستقيم والسماح لل الاغاروزها إلى الرواسب.
    6. Elute الخام محلله بالجاذبية.
    7. غسل العمود مع تاخيرمن العازلة (4x حجم الهيبارين-اجنشا).
    8. وضع فلتر بروتين الطرد المركزي 100 دهت تحت العمود و الوت الفيروس باستخدام العازلة الشطف (3x حجم الهيبارين-اجنشا) في فلتر.
      ملاحظه: يجب ان لا يتجاوز المخزن المؤقت التملص 15 مل.
    9. الطرد المركزي فلتر في 3,000 x g لمده ~ 30 دقيقه حتى اقل من 1 مل يترك في الفلتر.
    10. ملء فلتر مع تلفزيوني وأجهزه الطرد المركزي في 3,000 x g ل ~ 30 دقيقه حتى يتم ترك اقل من 1 مل في فلتر. كرر هذه الخطوة 2x لأزاله جميع الأملاح.
    11. التركيز علي حل الفيروس في تصفيه بواسطة طرد في 3,000 x g للوصول إلى وحده تخزين صغيره قدر الإمكان (اقل من 200 μl).
    12. يستنشق محلول الفيروس مع ابره وحقنه ودفع الحل من خلال فلتر 0.22 μm في أنبوب.
    13. جعل الارصفه من الجزيئات الفيروسية المركزة للتخزين.
      ملاحظه: يجب ان يكون قسامات ~ 20 μl للتخزين علي المدى القصير في 4 درجه مئوية و ~ 5 μl للتخزين علي المدى الطويل في-80 درجه مئوية.
    14. تحديد الفيروسية عيار وكفاءه المحولات الفيروسية كما هو موضح سابقا14،18،19،20.

3-عزل الخلايا الاوليه وثقافتها

  1. اليوم الأول
    1. موت ببطء ذكر أو انثي B6 يبلغ من العمر 6 أسابيع ؛ 129-Gt (ROSA) 26Sortm1 (CAG-كاس 9 *,-EGFP) Fezh/J من قبل CO2 خنق أو اي بروتوكول آخر وافق iacuc.
      ملاحظه: هذه الفئران CRISPR/كاس 9 المطرقة لديها Cre للالطبيعيه الاعتماد علي التعبير من كاس 9 نوكليوداز و egfp إخراج المروج CAG. المنبع Lox-Stop-Lox (LSL) تسلسل الموجودة في الجينوم من هذه الفئران منع التعبير عن كاس 9 و EGFP في غياب Cre للالطبيعيه. عند استخدامها في تركيبه مع دليل واحد RNAs (sgRNAs) ومصدر Cre ، فانها تسمح بتحرير جينات الماوس واحد أو متعددة في الجسم البشري أو السابق المجري14.
    2. تشريح اللسان من الفئران رحيم باستخدام مقص الجراحية.
    3. فك النسيج يدويا عن طريق فرم نسيج اللسان في أجزاء صغيره جدا باستخدام مشرط. جمع شظايا الانسجه في أنبوب 15 مل تحتوي علي 4.5 مل من متوسط RPMI عادي (مع المصل خارج).
    4. يضاف مزيج الانزيم الثلاثي (200 μl) (انظر الجدول 1 للوصفة) إلى شظايا الانسجه.
    5. احتضان مزيج الانسجه والانزيمات في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه والاستفادة من أنبوب كل 10 دقيقه لتعزيز التفكك الانزيمي للانسجه.
    6. أضافه 5 ٪ مصل الأبقار الجنينية (التي تحتوي علي HBSS/التلفزيونية إلى مزيج الانسجه والانزيمات لوقف عمل الانزيم.
    7. تصفيه تعليق الخلية أعلاه من خلال شبكه النايلون 70 μm معقمه لفصل الخلايا المشتتة وشظايا الانسجه أكبر.
    8. غسل تعليق الخلية المصفاة من قبل طرد ل 300 x g لمده 5 دقيقه في hbss/تلفزيوني في RT.
    9. أعاده تعليق بيليه في الثقافة المتوسطة (10 ٪ في RPMI/DMEM) وتنمو في الاطباق الثقافية 60 مم حتى تتشكل مستعمرات الخلايا المتميزة.
      1. يتم الاحتفاظ بمجاميع الخلايا الثقافية فوق الفلتر في طبق ثقافة 60 ملم يحتوي علي 3 مل من وسائل الاعلام الكاملة (10% من الوحدات في RPMI/DMEM) حتى تتشكل مستعمرات الخلايا.
    10. مجهريا فحص الخلايا الاساسيه لوجود التلوث الليفي بعد أسبوع واحد من الثقافة. علاج الخلايا الاساسيه التي تم تطويرها من المجاميع وتعليق الخلية مع 0.25 تريبسين 0.02% الحل أدتا في 37 درجه مئوية لمده 1 دقيقه لأزاله الليفية.
      ملاحظه: عاده ما تنتج الثقافة الاساسيه من مجاميع الخلايا المزيد من المستعمرات مقارنه بالمعلقات أحاديه الخلية. الخلايا من هذه المستعمرات توفير أفضل كفاءه المحولة مع محول AAV.

4. AAV محول الخلايا الاوليه

  1. اليوم العاشر
    1. البذور 2 × 105 الخلايا الاوليه في بئر في 6 لوحات جيدا في 2 مل من وسائل الاعلام الكاملة (10 ٪ في RPMI/dmem).
    2. في اليوم التالي ، transduce الخلايا مع 1012 الجينوم الفيروسي/مل(10 8 وحدات نقل/مل) واحتضان الخلايا في وسائل الاعلام التي تحتوي علي الجسيمات الفيروسية ل 48 h في 37 درجه مئوية.
    3. أزاله وسائل الاعلام التي تحتوي علي الجسيمات الفيروسية وإطعام الخلايا AAV-محول مع وسائل الاعلام الكاملة.
      ملاحظه: سيتم فقط الخلايا التي خضعت لمحول التعبير عن GFP والبدء في التكاثر. الخلايا التي لم تخضع لعمليه التوصيل ستموت في نهاية المطاف في غضون أسبوعين.
    4. بعد 2 أسابيع من التوسع الثقافي ، بذور الخلايا للتحقق من صحة والتجارب الحيوية في الجسم الحيوي.
      ملاحظه: تم استخراج الجينات الجينية من الخلايا المحولة للخلايا والخلايا الاساسيه العادية من الفئران كاس 9 للتحقق من صحة الجينوم معينه التحرير باستخدام البروتوكولات القياسية. وأجريت عمليه تسلسل الحمض النووي المستخرج وتحليل البيانات المتسلسلة (الجدول 2) باستخدام اختبار تسلسل الجيل التالي القائم علي التقاط التهجين (مثلا ، منصة MSK-IMPACT) علي النحو الموصوف سابقا في21.

5. التحقق من تحويل الخلايا الطبيعية إلى الخلايا المولدة باستخدام المناعي والتنقيط الغربية

  1. مناعي
    1. البذور 2 × 105 خلايا علي 12 مم الزجاج coverslips ووضعها في حاضنه بين عشيه وضحيها.
    2. إصلاح الخلايا في 4 ٪ بارافورمالدهيد في الاذاعه التلفزيونية (pH = 7.4) وعمليه لوضع العلامات المناعي.
    3. احتضان الخلايا الثابتة مع أول الأجسام المضادة الاوليه في 1 ٪ بوسني أو 1 ٪ مصل في PBST في غرفه ترطيب لمده 1 ساعة في RT أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية. الأجسام المضادة الرئيسية المستخدمة هي الأرنب الأحادي المضادة لل KRT 14 ، الأرنب الأحادي المضادة لل-الكترونيه-cملتصقون ، و كاس 9 الماوس ماب.
    4. أزاله حل الأجسام المضادة الاساسيه من الشفتين عن طريق غسل الخلايا 3x لمده 5 دقائق مع 1x تلفزيوني.
    5. احتضان الخلايا مع Cy3 حمار مكافحه الأرنب مفتش و/أو Cy3 الماعز مكافحه الماوس مفتش الأجسام المضادة الثانوية في الجيش الصربي البوسني 5 ٪ في PBST ل 1 ح في RT في الظلام.
    6. أزاله حل الأجسام المضادة الثانوية من الشفتين وغسل الخلايا 3x كما هو موضح في الخطوة 5.1.4.
    7. جبل الشفتين مع قطره من المتوسطة المتصاعدة التي تحتوي علي DAPI (DAPI فلوروماونت).
    8. يخزن في الظلام عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم تصوير الشرائح باستخدام المجهر الفلوري.
  2. غربيه يلطخ
    1. البذور 1 × 106 الخلايا المحولة في طبق الثقافة 100 ملم ووضعها في حاضنه بين عشيه وضحيها.
    2. غسل وكشط الخلايا المحولة إلى 200 ميكرولتر الجليد الباردة تلفزيوني.
    3. الطرد المركزي الأنبوب الذي يحتوي علي تعليق الخلية لمده 10 دقيقه في 2,000 x g في 4 درجه مئوية إلى بيليه الخلايا.
    4. يستنشق ماده طافي وlyse الخلايا باستخدام تحلل العازلة (انظر الجدول 1) التي تحتوي علي الفوسفاتيز المثبط الكوكتيلات ومثبط الانزيم البروتيني لمده 10 دقيقه في 4 ° c. الطرد المركزي لست] لمده 10 دقيقه في 10,000 x g و 4 درجه مئوية وجمع لست] مسح.
    5. استخدم طقم فحص برادفورد متاح تجاريا لتحديد تركيز البروتين بعد بروتوكول الشركة المصنعة. استخدام العازلة عينه 4x (500 mM تريس الأس الهيدروجيني = 6.8 ، 40 ٪ الجلسرين ، 8 ٪ SDS ، 20 ٪ H2O ، 0.02 ٪ بروموفينول الأزرق) لضبط عينات البروتين إلى 0.5 أو 1 ميكروغرام/Μl. يغلي عند 96 درجه مئوية لمده 5 دقائق.
      ملاحظه: يمكن تخزين العينات في-80 درجه مئوية أو حتى يتم اجراء تحليل لطخه الغربية.
    6. منفصلة كميات متساوية من مجموع محلله (30 ميكروغرام) بنسبه 10 ٪ كبريتات الصوديوم دوديسيل-بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-صفحه). تاكد من ان الصبغة تصل إلى الجزء السفلي من الهلام. نقل البروتين إلى غشاء النايلون عن طريق شبه الجافة التنقيط في 25 فولت لمده 30 دقيقه.
    7. اسكب 5% من الجيش البوسني الصربي في تريس-المحلول الملحي المخزن (TBS)-0.1% توين (TWEEN) علي الغشاء لتغطيته تماما. كتله الغشاء لمده 1 ساعة في RT. احتضان mebrane مع الأجسام المضادة الاوليه (المضادة--Cre ، المضادة--كاس 9 ، المضادة--GFP ، المضادة--β catenin ، مكافحه p53 ، المضادة--فوسفس--كيرك ، والمضادة--β.
    8. بعد الحضانة ، وغسل الاغشيه لمده 10 دقيقه مع 1x TBST التاكد من ان الحل يغطي الغشاء تماما. أداء هذا الغسيل 3x ، ومن ثم أضافه البيروكسيديز الفجل (الأس)-الأجسام المضادة الثانوية مترافق (المخفف 1:10000 في 5 ٪ بوسنيا TBST) إلى الغشاء. احتضان لمده 1 ساعة في RT.
    9. بعد الحضانة ، وغسل الاغشيه لمده 10 دقيقه مع 1x TBST التاكد من ان الحل يغطي الغشاء تماما. اجراء التصوير الكيميائي التلالؤ (انظر جدول المواد) لفضح العصابات ، والتقاط الصور وفقا لذلك.
  3. التحقق من الإمكانات المولدة للخلايا المتحولة في الفئران المناعية
    ملاحظه: تم الحفاظ علي الفئران ومعالجتها وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعه بن غوريون في النقب. موافقه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) و C57BL/6 وقد استخدمت الفئران للدراسات في الجسم المجري. وقد تم إسكان الفئران في خزانات تدفق الهواء المصفاة مع 12 ساعة ضوء/الظلام دوره وكانت تغذي الغذاء والماء الإعلان libitum.
    1. استخدام 6-8 العمر الأسبوع الإناث إيماءه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) و C57BL/6 الفئران للدراسة.
    2. [ترسنزيز] ال [اف-كاس 9] يحول خلايا. إيقاف التريسينزيشن باستخدام DMEM يسخن في 37 درجه مئوية وجمع في أنبوب 50 mL.
    3. الطرد المركزي أنبوب في 800 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في المتوسطة dmem دون المنفذة. تنفيذ طرد مره أخرى وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1x تلفزيوني.
      ملاحظه: لا تحتفظ الخلايا في 1x تلفزيوني لفتره طويلة جدا. دائما الحفاظ علي تعليق الخلية علي الجليد لمنع تكتل الخلايا.
    4. استخدام عداد الخلية التلقائي لحساب الخلايا وتمييع الخلايا إلى التركيز المطلوب (2.5 x 107 خلايا/مل) باستخدام 1X تلفزيوني. توليد الأورام من خلال حقن تحت الجلد من كاس 9 الخلية تحولت تعليق في الجناح الأيمن من كل إيماءه. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (إيماءه. SCID) الماوس (2 × 106 خلايا/الماوس). لتوليد نموذج الانسيابية في الفئران المتزامنة, حقن 0.5 × 106 الخلايا الاوليه أو كاس 9 تحويل الخلايا في اللسان C57BL/6 الفئران المناعية.
    5. موت ببطء الماشية 2 أسابيع بعد الحقن بواسطة CO2 خنق ، وتشريح الأورام من الفئران الرحيمة لتحليل المناعي.

النتائج

استخدام نظام AAV لتحويل خلايا كاس 9 العادية
ويقدم الشكل 1 خريطة مفصله لناقلات البلازما المستخدمة في هذه الدراسة. ويبين الشكل 2 تصميم وعمل النظام القائم علي كاس 9. ولإنتاج جزيئات فيروسية ، تم تحويل الخلايا HEK293T إلى ناقلات الجينات ال?...

Discussion

وقد استخدمت عده طرق سابقا لتحويل الخلايا الاساسيه في الثقافة مع درجات متفاوتة من النجاح25,26,27,28. معظم هذه الطرق استخدام خلايا الخلية الليفية الماوس للتحول14،17،18،<...

Disclosures

والماجستير في المجلس الاستشاري لمعهد العلوم البيولوجية ، وقد تلقي ميناريني ريريش أموالا بحثيه من شركه بوما للتكنولوجيا الحيوية ، وداييتشي-سانكيو ، وتارغايمون ، إيمونوميديكس ، وميريني ريريش. الماجستير هو أيضا أحد مؤسسي السفر ميدندي الطبية, وفي السنوات الماضية 2, وقد حصلت علي المكافات مناريني Ricerche و ADC فارما. كل المؤلفين الآخرين ليس لديهم شيء للكشف عنه.

Acknowledgements

نود ان نشكر الدكتور دانيال Gitler لتزويدنا مع pAd دلتا 5 المساعد plasmid. تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسه العلوم الاسرائيليه 700/16) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه العلوم الثنائية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (بالنسبة لي ، 2017323) ، وجمعيه السرطان الاسرائيليه (ICA ، 20170024) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه أبحاث السرطان الاسرائيليه (ICRF ، 17-1693-ركدا) (بالنسبة لي) ، ومؤسسه #7895 الزمالة: زمالة ألون لي وزمالات BGU Kreitman إلى SJ و MP.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β cateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 and XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolate II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep SolutionBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktailBiotoolB15001A/B
Protease inhibitor cocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glass wares
Cover slipsBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITKind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vectorAddgene112865
pAD Delta F5 helperBen Gurion University of the NegevProvided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mmMillexSLHV013SL
Culture platesGreiner Bio-One
Falcon tubesGreiner Bio-One

References

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155murineCRISPRadeno

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved