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Résumé

Le développement de modèles murins avec des gènes spécifiques mutés dans les patients atteints de cancer de la tête et du cou est nécessaire pour la compréhension de la néoplasie. Ici, nous présentons un protocole pour la transformation in vitro des cellules primaires de langue murine utilisant un système adeno-associé de virus-Cas9 pour produire des lignes de cellules murines de HNC avec des altérations génomiques spécifiques.

Résumé

L'utilisation de cellules épithéliales normales primaires permet d'induire de façon reproductible les altérations génomiques nécessaires à la transformation cellulaire en introduisant des mutations spécifiques dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs, en utilisant des courte répétition palindromic (CRISPR) à base de technologie d'édition du génome chez la souris. Cette technologie nous permet d'imiter avec précision les changements génétiques qui se produisent dans les cancers humains à l'aide de souris. En transformant génétiquement les cellules primaires murines, nous pouvons mieux étudier le développement, la progression, le traitement et le diagnostic du cancer. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules épithéliales de langue de souris Cas9 cre-inductibles pour permettre l'édition de génome utilisant le virus adéno-associé (AAV) in vitro. Plus précisément, en modifiant KRAS, p53, et APC dans les cellules épithéliales normales de langue, nous avons produit une ligne de cellules de tête et de cou murine (HNC) in vitro, qui est tumorigenic dans les souris syngeneic. La méthode présentée ici décrit en détail comment générer des lignées cellulaires HNC avec des altérations génomiques spécifiques et explique leur pertinence pour prédire la progression tumorale chez les souris syngénéiques. Nous envisageons que cette méthode prometteuse sera instructive et utile pour étudier la biologie et la thérapie de tumeur de HNC.

Introduction

HNC est une malignité commune dans le monde1. La modélisation de la genèse de la néoplasie HNC est actuellement à un tournant scientifique2. Bien que de nombreuses mutations génétiques aient été identifiées dans HNC2,3,4 (p. ex., TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 et RAS), les combinaisons spécifiques d'altérations génomiques requises de concert pour induire hNC demeurent floues.

L'utilisation actuelle des lignées cellulaires humaines hNC a contribué de manière significative à élucider les mécanismes associés à la pathogénie et au traitement3. Cependant, l'étude des lignées cellulaires humaines dans les systèmes murines immunodéprimés a ses limites, parce que ces systèmes ne traitent pas le processus néoplastique in vivo, le rôle des mutations génétiques spécifiques, et les réponses de traitement dans un microenvironnement immunitaire. Par conséquent, le développement et l'établissement de lignées cellulaires murines avec des altérations génétiques spécifiques sont d'une importance primordiale pour étudier comment différents gènes contribuent au processus de transformation et pour tester de nouvelles thérapies à base de molécules chez des souris immunocompétentes.

Les études sur la fonction génique dans la recherche biomédicale ont été considérablement affectées par les progrès des technologies d'édition de l'ADN, en introduisant des ruptures à double brin (DSB), par exemple5. Ces technologies, y compris l'utilisation de nucléases de doigts de zinc, de nucléases effectrices semblables à des activateurs de transcription et de répétitions palindromic courtes interespaces (CRISPR/Cas9), permettent la manipulation de tout gène d'intérêt à son locus. Les derniers systèmes CRISPR/Cas9 sont composés d'un ARN guide (gRNA) qui dirige la nucléase Cas9 pour générer un DSB à un site spécifique du génome. Ce système a acquis une large reconnaissance dans la modification des gènes endogènes dans n'importe quelle cellule ou tissu cible, même dans les organismes les plus traditionnellement difficiles à traiter5. Il a de multiples avantages par rapport à d'autres systèmes en raison de sa simplicité, la vitesse et l'efficacité.

En oncologie, la technologie CRISPR/CAS9 a répondu à la nécessité d'imiter efficacement les cellules cancéreuses. Pour établir ce système dans HNC, nous avons manipulé l'oncogène puissant de KRAS et deux gènes importants de suppresseur de tumeur, APC et p536. Selon la base de données GENIE7, cette combinaison est rare dans HNC. Les mutations de RAS (HRAS, NRAS, et KRAS) sont présentes dans seulement 7% de toutes les populations de HNC. Ces tumeurs ont tendance à être résistantes à la thérapie8,9.

La livraison de Cas9 et de son gRNA est réalisée par transduction virale à l'aide de AAV ou de lentivirus. L'AAV recombinant est souvent la méthode préférée pour délivrer des gènes aux cellules cibles en raison de son titre élevé, de sa réponse immunitaire légère, de sa capacité à transduire un large éventail de cellules et de sa sécurité globale. À l'aide d'un système AAV, diverses lignées de cellules de souris spécifiques aux tissus ont été générées, et de nouvelles lignées cellulaires sont encore en cours de développement10,11,12. Cependant, un système d'édition génomique efficace qui peut générer des cellules de modèles de lignée cellulaire HNC murine reste à développer. Dans cette étude, nous avons cherché à développer un système in vitro aAV-Cas9-basé pour transformer les cellules primaires de langue murine dans un état tumorigenic. Ce protocole unique de transformation DE CRISPR/Cas9 et la ligne établie de cellules de tumeur peuvent être employés pour mieux comprendre la biologie de HNC induite par une diversité des altérations génomiques.

Protocole

Cette étude a été approuvée par l'Université Ben Gourion du Comité de soins et d'utilisation des animaux du Néguev. Les expériences sur les animaux ont été approuvées par l'IACUC (IL.80-12-2015 et IL.29-05-2018(E)). Tous les aspects de l'expérimentation animale, du logement et des conditions environnementales utilisés dans la présente étude étaient conformes au Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire13.

1. Production de virus associée à l'adéno

  1. Jour 1: Culture cellulaire
    1. Graine 4 x 106 cellules HEK293T par plaque de 14,5 cm dans 15 ml de DMEM. Préparer 10 plaques pour la transfection avec la polyéthylènenimine (PEI) (1 g/L).
  2. Jour 2 : Transfection des cellules HEK293T à l'aide de l'Ile-du-Prince-Édouard
    1. Retirer les médias et les renourrir avec le DMEM chaud 1 h avant la transfection.
    2. Réagents de transfection préchauffés et DMEM.
    3. Utiliser 10 g du plasmide d'intérêt contenant AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 g du plasmide capsid AAV 2/9n (avec le gène de rep de AAV2 et le gène de la casquette de AAV9, et 10 g du plasmide d'aide (aide pAdDelta F5) par assiette (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Une nouvelle génération de plasmique d'aide - pAdDeltaF614,15,16 qui peut également être utilisé pour la production AAV est disponible.
    4. Mélanger les plasmides dans 1 ml de DMEM ordinaire par assiette. Ajouter ensuite 90 ll de polyéthylénimine (plasmide total : concentration de l'Ile-du-Prince-Édouard 1:3) au mélange plasmide et au vortex brièvement.
    5. Incuber le mélange d'ADN plasmique de l'Ile-du-Prince-Édouard pendant 20 min à température ambiante (RT).
    6. Ajouter le mélange dans le sens goutte à goutte sur les cellules HEK293T et transférer les plaques à l'incubateur de culture cellulaire à 37 oC avec 5% de CO2 pour 24 h.
  3. Jour 3 : Changement moyen après transfection
    1. Retirer complètement le milieu et ajouter 15 ml de DMEM frais.
  4. Jour 5: Récolter le virus
    1. Préparer un bain de glace sèche/éthanol.
    2. Recueillir les cellules avec un grattoir cellulaire et les transférer dans des tubes de 50 ml (2 plaques par tube de 50 ml).
    3. Tourner les tubes à 800 x g pendant 15 min à température ambiante.
    4. Jetez le supernatant de tous les tubes. Ajouter 0,5 ml de tampon de lyse (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH à 8,5) par assiette (c.-à-d. 5 ml pour 10 plaques) au premier tube seulement. Resuspendre les cellules et transférer le volume total vers le tube suivant et continuer jusqu'au dernier tube.
    5. Transférer la suspension cellulaire dans un tube frais de 50 ml. Laver les tubes avec le même volume de tampon de lyse (0,5 ml par plaque) en utilisant la même méthode de transfert que décrite à l'étape 1.4.4.
    6. Soumettez la suspension cellulaire à trois cycles de gel/dégel de 10 min entre un bain sec glace/éthanol et un bain d'eau de 37 oC. Vortex peu après chaque décongélation.
    7. Si la purification est effectuée le même jour, régler le tampon d'équilibre et d'élution (voir le tableau 1 pour la recette) à RT.
    8. Ajouter 50 unités de benzonase par assiette et incuber à 37 oC pendant 1,5 h.
      REMARQUE : Le benzonase est employé pour digérer les acides nucléiques résiduels des cellules de producteur d'hôte et l'ADN plasmide présent dans la suspension de cellules.
    9. Faire tourner les tubes à 3 000 x g pendant 15 min à 4 oC.
    10. Recueillir le supernatant dans une seringue à l'aide d'une aiguille en acier de 18 G et pousser la solution à travers un filtre de 0,45 m dans un tube de 15 ml pour obtenir le lysate brut.
    11. Conserver le lysate brut à 4 oC pendant quelques semaines jusqu'à ce que la purification ou continuer la purification.

2. Purification AAV

  1. Jour 5 ou plus tard
    1. Placez le tampon d'équilibre et d'élution à RT.
    2. Laver les colonnes de chromatographie avec 10 ml de tampon d'équilibre.
    3. Ajouter 0,5 ml par plaque d'héparine-agarose à la colonne17, puis ajouter le tampon d'équilibre (4fois le volume de l'héparine-agarose). Mélanger les solutions en inversant la colonne et laisser les sédiments agarose.
    4. Élipellez le tampon d'équilibre de la colonne par gravité.
      REMARQUE : Laissez un tampon d'équilibre pour empêcher l'agarose de se dessécher.
    5. Chargez le lysate brut sur la colonne et incubez pendant 2 h à 4 oC avec une agitation constante. Mettre la colonne en position verticale et laisser l'agarose dans les sédiments.
    6. Elute le lysate brut par gravité.
    7. Laver la colonne avec un tampon d'équilibre (4fois le volume de l'héparine-agarose).
    8. Placez un filtre à protéines centrifuges de 100 kDa sous la colonne et élichez le virus à l'aide d'un tampon d'élution (3 fois le volume de l'héparine-agarose) dans le filtre.
      REMARQUE : Le tampon d'élution ne doit pas dépasser 15 ml.
    9. Centrifuger le filtre à 3 000 x g pendant 30 min jusqu'à ce qu'il reste moins de 1 ml dans le filtre.
    10. Remplissez le filtre avec du PBS et de la centrifugeuse à 3 000 x g pendant 30 min jusqu'à ce qu'il reste moins de 1 ml dans le filtre. Répétez cette étape 2x pour enlever tous les sels.
    11. Concentrez la solution de virus dans le filtre par centrifugation à 3 000 x g pour arriver à un volume aussi petit que possible (moins de 200 l).
    12. Aspirez la solution virale à l'utilisation d'une aiguille et d'une seringue et poussez la solution à travers un filtre de 0,22 m dans un tube.
    13. Faire des aliquots de particules virales concentrées pour le stockage.
      REMARQUE : Les aliquots doivent être de 20 l pour un stockage à court terme à 4 oC et de 5 oL pour un stockage à long terme à -80 oC.
    14. Déterminer le titre viral et l'efficacité de la transduction virale tel que décrit précédemment14,18,19,20.

3. Isolement et culture des cellules primaires

  1. Jour 1
    1. Euthanasiez un mâle ou une femelle de 6 semaines B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9MD,-EGFP)Fezh/J par asphyxie CO2 ou tout autre protocole approuvé par l'IACUC.
      REMARQUE : Ces souris de knockin de CRISPR/Cas9 ont l'expression Cre recombinase-dépendante de cas9 endonuclease et EGFP dirigée par un promoteur de CAG. La séquence en amont de Lox-Stop-Lox (LSL) présente dans le génome de ces souris empêche l'expression de Cas9 et de l'EGFP en l'absence de Cre recombinase. Lorsqu'ils sont utilisés en combinaison avec des ARN à guide unique (sgRNAs) et une source de Cre, ils permettent l'édition de gènes de souris simples ou multiples in vivo ou ex vivo14.
    2. Disséquer la langue des souris euthanasiées à l'aide de ciseaux chirurgicaux.
    3. Dissocier manuellement le tissu en hachant le tissu de la langue en très petits fragments à l'aide d'un scalpel. Recueillir les fragments de tissu dans un tube de 15 ml contenant 4,5 ml de milieu ordinaire RPMI (avec le sérum).
    4. Ajouter le mélange triple enzymatique (200 l) (voir le tableau 1 pour la recette) aux fragments de tissu.
    5. Incuber le mélange tissu-enzyme à 37 oC pendant 30 min et appuyez sur le tube toutes les 10 minutes pour améliorer la dissociation enzymatique du tissu.
    6. Ajouter 5 % de sérum bovin fœtal (SGF) contenant du HBSS/PBS au mélange tissu-enzyme pour arrêter l'action enzymatique.
    7. Filtrer la suspension cellulaire ci-dessus à l'intérieur d'un maillage stérile en nylon de 70 m pour séparer les cellules dispersées et les fragments de tissus plus importants.
    8. Laver la suspension des cellules filtrées par centrifugation pendant 300 x g pendant 5 min dans HBSS/PBS à RT.
    9. Resuspendre le granule dans le milieu de culture (10% FBS dans RPMI/DMEM) et se développer dans des plats de culture de 60 mm jusqu'à ce que des colonies cellulaires distinctes soient formées.
      1. Agrégats de cellules de culture conservés sur le dessus du filtre dans un plat de culture de 60 mm contenant 3 ml de milieux complets (10 % de FBS en RPMI/DMEM) jusqu'à formation de colonies cellulaires.
    10. Examiner au microscope les cellules primaires pour la présence de contamination par le fibroblaste après 1 semaine de culture. Traiter les cellules primaires développées à partir d'agrégats et de suspensions cellulaires avec 0,25 trypsine 0,02% solution EDTA à 37 oC pendant 1 min pour enlever les fibroblastes.
      REMARQUE : Habituellement, la culture primaire à partir d'agrégats cellulaires produit plus de colonies que les suspensions unicellulaires. Les cellules de ces colonies offrent une meilleure efficacité de transduction avec la transduction AAV.

4. Transduction AAV des cellules primaires

  1. Jour 10
    1. Seed 2 x 105 cellules primaires par puits dans 6 plaques de puits dans 2 ml de milieux complets (10 % de FBS dans RPMI/DMEM).
    2. Le lendemain, transduire les cellules avec 1012 génome sviral/mL (1010 unités de transducage/mL) et incuber les cellules dans des médias de particules virales pendant 48 h à 37 oC.
    3. Retirez les médias contenant des particules virales et alimentez les cellules transducées par l'AAV avec un support complet.
      REMARQUE : Seules les cellules qui ont subi une transduction exprimeront le GFP et commenceront à proliférer. Les cellules qui n'ont pas subi de transduction finiront par mourir dans les 2 semaines.
    4. Après 2 semaines d'expansion de culture, ensemencez les cellules pour la validation et les expériences tumorigenic in vivo.
      REMARQUE : L'ADN génomique des cellules transducées par aAV et des cellules primaires normales de souris Cas9 a été extrait pour valider l'édition spécifique du génome à l'aide de protocoles standard. Le séquençage de l'ADN extrait et l'analyse des données séquentées (tableau 2) ont été effectués à l'aide d'un test de séquençage de prochaine génération basé sur la capture d'hybridation (p. ex., plate-forme MSK-IMPACT) tel que décrit précédemment21.

5. Valider la transformation des cellules normales en cellules tumorigènes à l'aide de l'immunofluorescence et du ballonnement occidental

  1. Immunofluorescence
    1. Seed 2 x 105 cellules sur des couvercles en verre de 12 mm et les placer dans un incubateur pendant la nuit.
    2. Fixer les cellules dans 4% de paraformaldéhyde dans le PBS (pH - 7.4) et le processus pour l'étiquetage d'immunofluorescence.
    3. Incuber les cellules fixes avec le premier anticorps primaire dans 1% BSA ou 1% sérum en PBST dans une chambre humidifiée pendant 1 h à RT ou pendant la nuit à 4 oC. Les principaux anticorps utilisés sont le lapin monoclonal anti-KRT 14, lapin monoclonal anti-E-cadherin anticorps, et Cas9 souris mAb.
    4. Retirez la solution d'anticorps primaire des couvertures en lavant les cellules 3x pendant 5 min avec 1x PBS.
    5. Incuber les cellules avec Cy3 âne anti-lapin IgG et / ou Cy3 chèvre anti-souris igG anticorps secondaires dans 5% BSA en PBST pour 1 h à RT dans l'obscurité.
    6. Retirez la solution d'anticorps secondaire des couvertures et lavez les cellules 3x comme décrit à l'étape 5.1.4.
    7. Montez les couvertures avec une goutte de support de montage contenant DAPI (DAPI Fluoromount).
    8. Conserver dans l'obscurité à 4 oC jusqu'à ce que les diapositives soient représentées à l'aide d'une microscopie à fluorescence.
  2. Le ballonnement occidental
    1. Seed 1 x 106 ont transformé les cellules dans un plat de culture de 100 mm et les placer dans un incubateur pendant la nuit.
    2. Laver et gratter les cellules transformées en PBS froid de glace de 200 'l.
    3. Centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire pendant 10 min à 2 000 x g à 4 oC pour granuler les cellules.
    4. Aspirer le supernatant et lyser les cellules à l'aide d'un tampon de lyse (voir tableau 1) contenant des cocktails inhibiteurs de la phosphatase et un inhibiteur de la protéase pendant 10 min à 4 oC. Centrifuger les lysates pendant 10 min à 10 000 x g et 4 oC et recueillir les lysates défrichés.
    5. Utilisez un kit d'évaluation Bradford disponible dans le commerce pour déterminer la concentration en protéines selon le protocole du fabricant. Utilisez un tampon d'échantillon 4x (500 mM de pH Tris à 6,8, 40 % de glycérol, 8 % de SDS, 20 % H2O, 0,02 % de bromophénol bleu) pour ajuster les échantillons de protéines à 0,5 ou 1 g/L. Faire bouillir à 96 oC pendant 5 min.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être stockés à -80 oC ou jusqu'à ce qu'une analyse de tache occidentale soit effectuée.
    6. Séparez des quantités égales de lysate total (30 g) par 10 % d'électrophores gel de sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE). Assurez-vous que le colorant atteint le fond du gel. Transférer la protéine dans la membrane de nylon par ballonnement semi-sec à 25 V pendant 30 min.
    7. Verser 5 % de BSA dans la saline tamponnée Tris (TBS)-0,1 % de tween (TBST) sur la membrane pour la recouvrir complètement. Bloquez la membrane pendant 1 h à RT. Incuber la mébrane avec des anticorps primaires (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-caténine, anti-p53, anti-phospho-ERK, et anti-actin dilué dans 5% BSA TBST) à 4 oC du jour au lendemain.
    8. Après l'incubation, laver les membranes pendant 10 min avec 1x TBST en s'assurant que la solution couvre complètement la membrane. Effectuer ce lavage 3x, puis ajouter le raifort peroxidase (HRP) conjugué anticorps secondaires (dilué 1:10,000 dans 5% BSA TBST) à la membrane. Incuber pour 1 h à RT.
    9. Après l'incubation, laver les membranes pendant 10 min avec 1x TBST en s'assurant que la solution couvre complètement la membrane. Effectuez l'imagerie par chemiluminescence (voir Tableau des matériaux)pour exposer les bandes et capturez des images en conséquence.
  3. Validation du potentiel tumorigène des cellules transformées chez les souris immunocompétentes
    REMARQUE : Les souris ont été maintenues et traitées selon les directives institutionnelles de l'Université Ben-Gourion du Néguev. Nod. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) et C57BL/6 souris ont été utilisés pour les études in vivo. Les souris étaient logées dans des armoires à débit laminaire filtrées à l'air avec un cycle de 12 heures de lumière/obscurité et ont été nourries de nourriture et d'eau ad libitum.
    1. Utilisez 6-8 semaines-vieille femelle NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) et C57BL/6 pour l'étude.
    2. Trypsiniser les cellules transformées AAV-Cas9. Arrêter la trypsinisation à l'aide de DMEM préréchauffé à 37 oC et recueillir dans un tube de 50 ml.
    3. Centrifuger le tube à 800 x g pendant 10 min à température ambiante. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans le milieu DMEM sans FBS. Effectuer la centrifugation à nouveau et resuspendre la pastille cellulaire en 1x PBS.
      REMARQUE: Ne pas garder les cellules dans 1x PBS pendant trop longtemps. Gardez toujours la suspension cellulaire sur la glace pour éviter l'agglutination cellulaire.
    4. Utilisez un compteur cellulaire automatique pour compter les cellules et diluer les cellules à la concentration désirée (2,5 x 107 cellules/mL) à l'aide de 1x PBS. Générer des tumeurs par une injection sous-cutanée de la suspension cellulaire transformée AAV-Cas9 dans le flanc droit de chaque NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Souris SCID) (2 x 106 cellules/souris). Pour générer un modèle orthotropique chez les souris syngénétiques, injectez 0,5 à 106 cellules primaires ou les cellules transformées AAV-Cas9 en langue de souris immunocompétentes C57BL/6.
    5. Euthanasier les animaux 2 semaines postinjection par asphyxie co2, et disséquer les tumeurs des souris euthanasiées pour l'analyse d'immunohistochimie.

Résultats

Utilisation du système AAV pour transformer les cellules Cas9 normales
La figure 1 fournit une carte vectorielle détaillée du plasmide transgénique AAV utilisé dans cette étude. La figure 2 décrit la conception et le fonctionnement du système à base d'AAV-Cas9. Pour produire des particules virales, les cellules HEK293T ont été transfectées avec le vecteur transgénique AAV et d'autres vecteurs d'em...

Discussion

Plusieurs méthodes ont déjà été utilisées pour transformer les cellules primaires en culture avec des degrés variables de succès25,26,27,28. La plupart de ces méthodes utilisent des cellules de fibroblaste de souris pour la transformation14,17,18,19 ou utilis...

Déclarations de divulgation

M.S. est membre du conseil consultatif de l'Institut des sciences biologiques, et Menarini Ricerche a reçu des fonds de recherche de Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics et Menarini Ricerche. M.S. est également co-fondateur de Medendi Medical Travel, et au cours des 2 dernières années, a reçu des honoraires de Menarini Ricerche et ADC Pharma. Tous les autres auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier le Dr Daniel Gitler de nous avoir fourni le plasmide de la plasmide de la plasmide de la plasmide delta 5. Ces travaux ont été financés par l'Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (à ME), la United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (à ME et MS), l'Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (à ME), l'Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (à ME), et la Concern Foundation (#7895) (à ME). Bourse : bourse Alon à ME et BGU Kreitman fellowships à SJ et MP.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β cateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 and XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolate II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep SolutionBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktailBiotoolB15001A/B
Protease inhibitor cocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glass wares
Cover slipsBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITKind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vectorAddgene112865
pAD Delta F5 helperBen Gurion University of the NegevProvided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mmMillexSLHV013SL
Culture platesGreiner Bio-One
Falcon tubesGreiner Bio-One

Références

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

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